專利名稱：OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白轉基因工程菌株。
背景技術：
老年人骨質疏松發(fā)病率較高，全球有2億骨質疏松患者，并且女性多于男性。根據世界衛(wèi)生組織(WHO)的標準，美國國家健康和營養(yǎng)調查(NHANES III，1988 1994年)結果表明，骨質疏松嚴重影響老年人生活質量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會出現骨質疏松性骨折，一旦患者經歷了第一次骨質疏松性骨折，繼發(fā)性骨折的危險明顯加大。中國老年人居于世界首位，現有骨質疏松癥患者9000萬，占總人口的7. 1%。隨著社會老齡化的進程，骨質疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢，預計到2050年將增加到
2.21億，那時全世界一半以上的骨質疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國。有學者對1995 1996年美國骨質疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發(fā)生數進行調查顯示，每年發(fā)生骨質疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。肥胖與骨量關系臨床觀察表明，肥胖與骨密度(BMD)提高有關。肥胖是骨量的保護因素，超重和肥胖的婦女絕經后較同齡非超重婦女骨量高且骨丟失較慢。體重下降是絕經早期骨丟失的危險因素，提高體重指數可減緩絕經后骨丟失。但肥胖也常常引發(fā)高血糖、高血壓、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰島素血癥、冠心病、腦卒中、下肢靜脈曲張、脂肪肝、膽石癥、睡眠呼吸暫停癥、糖尿病、痛風癥及關節(jié)炎，是很多疾病的誘因之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決目前尚無同時有效治療骨質疏松和肥胖藥品的缺陷，而提供的一種OGP-rhLept in融合蛋白轉基因工程菌株。OGP-rhL印tin融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/0bese’)，大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)按以下步驟制備一、將含有OGP-rhL印tin融合蛋白基因的質粒載體pUC (0GP/0bese’ )用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-rhL印tin融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_1 ；三、OGP-rhL印tin融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_1進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/Obese’ ；四、用載體pGEX-0GP/0bese’轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-rhLept in融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/0bese’)。本發(fā)明中OGP-rhL印tin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明中OGP-rhL印tin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明OGP-rhLeptin融合蛋白采用人為改造的Leptin和成骨生長肽基因編碼翻譯而成。具有降低使用者體重，并防治骨質疏松的效果。
本發(fā)明用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白微生物制劑，不產生拮抗反應，使用安全。本發(fā)明OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21(DE3-0GP/0bese’)發(fā)酵產生的OGP-rhLeptin融合蛋白共52個氨基酸。本發(fā)明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)。采用本發(fā)明基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/0bese’)可大規(guī)模發(fā)酵生產OGP-rhLeptin融合蛋白，具有廣泛應用前景。本發(fā)明為治療骨質疏松和肥胖奠定了物質基礎。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-0GP/0bese，)，大腸桿菌 BL21 (DE3_0GP/0bese’)按以下步驟制備一、將含有OGP-rhLeptin融合蛋白基因的質粒載體pUC (0GP/0bese’ )用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-rhL印tin融合蛋白的DAN片段(0GP/0bese’)；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ；三、OGP-rhLeptin融合蛋白 的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/Obese’ ；四、用載體pGEX-0GP/0bese’轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/0bese’)。 本實施方式步驟四采用電擊轉化法轉化大腸桿菌BL21 (DE3 )。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟一中質粒載體pUC (0GP/0bese’ )酶切反應體系為
pUC (OGP/Obese，)20 μ
IOXMbuffer6μ1
Bamhll3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。其他步驟及參數與具體實施方式
一相同。本實施方式步驟一酶切反應在37°C條件下反應10h，然后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二的不同點在于步驟二中質粒pGEX-6P-l酶切反應體系為載體 pGEX-6P-l20 μΙ IOXM buffer 6μ1
BamHX3μ1 EcoR I 3μ1 不含 DNA 酶的 ddH20 28μΙ。其他步驟及參數與具體實施方式
一或二相同。本實施方式步驟二酶切反應在37°C條件下反應10h，然后O. 6%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一、二或三的不同點在于步驟三
中酶連接反應體系為
雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段1#1
IO X Τ4 DNA 迕接酚 buffer2μ1
Τ4 DNA連接酶2μ1。其他步驟及參數與具體實施方式
一、二或三相同。本實施方式步驟三酶連接反應在16 °C條件下進行。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一的不同點在于步驟一中OGP-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。其他步驟及參數與具體實施方式
一至四之一相同。本實施方式OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質粒載體pUC (OGP/Obese’)。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一的不同點在于步驟一中OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。其他步驟及參數與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式OGP-rhL印tin融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-0GP/0bese，)，大腸桿菌 BL21 (DE3_0GP/0bese’)按以下步驟制備一、將含有OGP-rhLeptin融合蛋白基因的質粒載體pUC (0GP/0bese’ )用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-rhL印tin融合蛋白的DAN片段(0GP/0bese’)；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ；三、OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/Obese’ ；四、用載體pGEX-OGP/Obese’轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/0bese’ )；
其中步驟一中質粒載體pUC (OGP/Obese’ )酶切反應體系為
pUC (OGP/Obese')20 μ
IOXM buffer6μ1
BamWl3μ1
KcoR I3μ1
不含DNA酶的ddH2028μ1其中步驟二中質粒pGEX-6P-l酶切反應體系為 載體 pGEX-6P-l20 μ IOXM buffer 6μ1
BcimH\3μ1 EcoR I 3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1；其中步驟三中酶連接反應體系為
雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA.片段13μ1
IOX Τ4 DN A 選接!w buffer2μ1
Τ4 DNA連接酶2μ1。其中步驟一中OGP-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :1所示；步驟一中OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。本實施方式中OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質粒載體pUC (OGP/Obese’)。本實施方式在構建OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21(DE3_0GP/0bese’)時在OGP和Obese’之間插入Kpn I酶切位點，既可以提高所編碼融合蛋白的穩(wěn)定性，同時也改變融合蛋白的二級結構，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因兩側分別加上BamHI和EcoR I酶切位點，而且根據大腸桿菌偏愛密碼子的特點，重新設計了融合基因編碼堿基序列。載體pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位點，本實施方式合成的pGEX-OGP/Obese’均能為Kpn I單酶切開,說明本實施方式OGP-rhLeptin融合蛋白成功導入質粒pGEX_6P_l中。然后將質粒pGEX-OGP/Obese’導入大腸桿菌BL21 (DE3)中，選取陽性克隆。隨機挑取陽性克隆大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0beSe’)菌落37°C過夜培養(yǎng)，提取質DNA，用Kpn I進行單酶切，并用相應的空白質粒pGEX-6P-l作為對照，將含有Kpn I酶切位點的質粒進行基因測序。測序工作委托生物公司進行，大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese,>內含有SEQ ID NO 1所示DNA。將大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)置于LB培養(yǎng)基28°C環(huán)境條件下培養(yǎng)15h，然后采用GST標簽融合蛋白純化方法進行蛋白的分離純化，本實施方式用于治療骨質疏松和肥胖的融合蛋白的純度為98%，融合蛋白的表達量為38. 7%。利用本實施方式大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)發(fā)酵獲得的OGP-rhL印tin融合蛋白進行試驗OGP-rhLeptin融合蛋白治療骨質疏松實驗取雌性SD大鼠在無菌條件下摘除雙側卵巢，12周后取存活健康大鼠40只，隨機分為5組(陽性對照組1、陽性對照組2、融合蛋白實驗組和陰性對照組)，每組8只。另取雌性SD大鼠切除雙側一小塊脂肪，12周后隨機取存活健康大鼠8只作為假手術對照組。共計6組，分別口服以下藥物假手術對照組質量濃度為O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；陰性對照組質量濃度為O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；融合蛋白實驗組質量濃度為O. 5%的OGP-rhLeptin融合蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；(獲得的用于治療骨質疏松和血栓的OGP-rhLeptin融合蛋白用無菌水溶解)陽性對照組1:阿侖膦酸鈉(Alen) 5mg/kg ；陽性對照組2 :質量濃度為O. 5%的OGP蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg。陽性對照組3 :質量濃度為O. 5%的rhL印tin溶液，灌胃劑量為5ml/kg。連續(xù)給藥三個月，處死后取大鼠股骨頭，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金剛石鋸將股骨頭矢面鋸開，取其一片，經清洗，10%次氯酸鈉浸泡6h，超聲清洗15min，乙醇梯度脫水，乙醚浸泡，干燥，離子濺射鍍膜，SX-40掃描電鏡觀察，加速電壓20kV。觀察骨質疏松治療對比實驗結果，實驗結果見表1，結果表明融合蛋白實驗組、陽性對照組I和陽性對照組2都具有治療骨質疏松的作用，且融合蛋白實驗組的效果最好。表I骨小梁寬度的比較和骨面積(X土SD)
權利要求
1.OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株,其特征在于OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)，大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/0bese’)按以下步驟制備 一、將含有OGP-rhLeptin融合蛋白基因的質粒載體pUC(OGP/Obese，)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ； 三、OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/Obese’ ； 四、用載體pGEX-OGP/Obese’轉化大腸桿菌BL21(DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/0bese’)。
2.根據權利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中質粒載體pUC (OGP/Obese’ )酶切反應體系為 pUC (OGP/Obese，)20 μ IOXM buffer6μ1 BamHX3μ1 KcoR I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
3.根據權利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟二中質粒pGEX-6P-l酶切反應體系為 載體 pGEX-6P-l20 μ IOXM buffer6μ1 BamHl3μ1 KcoR I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH2028μΙ。
4.根據權利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟三中酶連接反應體系為 雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ 融合蛋白的DNA片段13μ1 10ΧΤ4 DNA 迮接iW buiicv2μ1Τ4 DNA連接酶2μ1。
5.根據權利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中OGP-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
6.根據權利要求5所述的OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
全文摘要
OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株，它涉及一種融合蛋白轉基因工程菌株。解決目前尚無同時有效治療骨質疏松和肥胖藥品的缺陷。OGP-rhLeptin融合蛋白轉基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3-OGP/Obese’)按以下步驟制備一、獲得融合蛋白DAN片段；二、雙酶切質粒；三、酶連接；四、轉化大腸桿菌BL21。本發(fā)明可用于醫(yī)藥制備領域。
文檔編號C12N1/21GK103031268SQ201210585619
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權日2012年12月31日
發(fā)明者余瓊 申請人:黑龍江大學