專利名稱：OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白轉基因工程菌株。
背景技術：
老年人骨質疏松發病率較高，全球有2億骨質疏松患者，并且女性多于男性。根據世界衛生組織(WHO)的標準，美國國家健康和營養調查(NHANES III，1988 1994年)結果表明，骨質疏松嚴重影響老年人生活質量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會出現骨質疏松性骨折，一旦患者經歷了第一次骨質疏松性骨折，繼發性骨折的危險明顯加大。中國老年人居于世界首位，現有骨質疏松癥患者9000萬，占總人口的7. 1%。隨著社會老齡化的進程，骨質疏松癥的發病率呈上升趨勢，預計到2050年將增加到2. 21億，那時全世界一半以上的骨質疏松性骨折將發生在亞洲，絕大部分在中國。有學 者對1995 1996年美國骨質疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發生數進行調查顯示，每年發生骨質疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。當骨折發生時，患者最初的感受便是疼痛。在骨折早期治療過程中，疼痛從始至終都存在著。它不僅影響患者的治療效果，同時也直接影響肢體的功能恢復。不同類型的骨折均存在不同程度的疼痛、功能障礙、肢體腫脹，而疼痛是首先應考慮解決的問題。因為疼痛可引起交感神經興奮，繼而反射性抑制胃腸功能，引起食欲減退；疼痛還可影響睡眠質量，引起體內多種激素的釋放，產生相應的病理生理改變，使機體抵抗力下降，直接影響創傷愈合及功能恢復。因此解除骨折患者的疼痛感是治療的重要組成部分。如果患者服用多種藥物治療骨質疏松并止痛，容易產生藥物拮抗反應；若要錯開服藥時間一方面要靠考慮藥物的半衰期，另一方面還要考慮藥物有效濃度，而且給患者造成不便。目前缺乏一種可以同時有效治療骨質疏松和止痛的藥品。

發明內容
本發明要解決目前尚無同時有效治療骨質疏松和止痛藥品的缺陷，而提供的一種OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株。OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)，大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTX)按以下步驟制備一、將含有OGP-CTx融合蛋白基因的質粒載體pUC(0GP/CTx)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-CTx融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ；三、OGP-CTx融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/CTx ；四、用載體pGEX-OGP/CTx轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)。本發明中OGP-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。本發明中OGP-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。由于骨折患者均為突然致傷，無思想準備，再加上相關知識缺乏，治療過程長；患者因疼痛恐懼常呈被動體位，特別是老年骨折患者，往往會引起將來功能障礙，而且恢復期較長。本發明OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)發酵產生的OGP-CTx融合蛋白可治療骨質疏松的同時止痛，對于骨質疏松所引發骨折的患者治療效果顯著，而且由于可以明顯減輕或消除患處疼痛感，患者心理負擔小、康復快，愈后功能恢復期短。本發明用于治療骨質疏松和止痛的OGP-CTx融合蛋白微生物制劑，不產生拮抗反應，使用安全。本發明OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)發酵產生的OGP-CTx融合蛋白共42個氨基酸。本發明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21(DE3-0GP/CTX)。采用本發明基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)可大規模發酵生產OGP-CTx融合蛋白，具有廣泛應用前景。本發明為治療骨質疏松和止痛奠定了物質基礎。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTx)，大腸桿菌 BL21 (DE3_0GP/CTx)按以下步驟制備一、將含有OGP-CTx融合蛋白基因的質粒載體pUC(0GP/CTx)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-CTx融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ；三、OGP-CTx融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/CTx ；四、用載體pGEX-OGP/CTx轉化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)。本實施方式步驟四采用電擊轉化法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟一中質粒載體pUC (OGP/CTx)酶切反應體系為
權利要求
1.OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTX)，大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)按以下步驟制備 一、將含有OGP-CTx融合蛋白基因的質粒載體pUC(OGP/CTx)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-CTx融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 雙酶切質粒 pGEX_6P_l ； 三、OGP-CTx融合蛋白的DAN片段與經過雙酶切的載體pGEX-6P-l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/CTx ； 四、用載體pGEX-OGP/CTx轉化大腸桿菌BL21(DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTX)。
2.根據權利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中質粒載體pUC (OGP/CTx)酶切反應體系為 pUC (OGP/CTx)20 0IOXM buffer6(^1 BamHX3(il KcoR I3 ^il 不含 DNA 酶的 ddH2028^1。
3.根據權利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟二中質粒pGEX-6P-l酶切反應體系為 載體 pGEX-6P-l20 ^il10XM buffer6[il Bamlil3[il KcoR I3ul不含DNA酶的ddH2028^1
4.根據權利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟三中酶連接反應體系為 雙酶切的載體pGEX-6P-l3 ^il融合蛋白的DNA片段D^il 10XT4 DNA 迕接!W buffer2^1 T4 DNA連接酶20。
5.根據權利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中OGP-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。
6.根據權利要求5所述的OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株，其特征在于步驟一中OGP-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
全文摘要
OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株，它涉及一種融合蛋白轉基因工程菌株。解決目前尚無同時有效治療骨質疏松和止痛藥品的缺陷。OGP-CTx融合蛋白轉基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3-OGP/CTx)按以下步驟制備一、獲得融合蛋白DAN片段；二、雙酶切質粒；三、酶連接；四、轉化大腸桿菌BL21。本發明可用于醫藥制備領域。
文檔編號C12N15/70GK103013901SQ201210585620
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者余瓊 申請人:黑龍江大學