專利名稱：靶向血管緊張素原的rna干擾片段、其表達載體、混合克隆細胞株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及RNA干擾及應用領域，更具體地說是涉及靶向血管緊張素原的RNA干擾片段、其表達載體及其應用。
背景技術：
腎素一血管緊張素系統(Renin-Angiotensin System, RAS)是生理功能復雜的內分泌系統，已確定與人類心腦血管疾病、糖尿病、肝臟、腎臟疾病等有密切的關系，其源頭即為血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)。近年的研究發現機體脂肪組織中存在RAS的所有成分，提示RAS與脂肪細胞的分化和增殖有密切關系，而脂肪細胞的異常分化與增殖又是導致肥胖的直接原因。RNA干擾技術(RNA interference, RNAi)是近年來迅速發展起來的一項高效基因研究技術，在哺乳動物細胞中利用該技術成功阻斷基因的表達，可實現細胞水平的基因敲除。通過干擾脂肪細胞中AGT基因的表達以抑制RAS發揮作用，達到抑制前脂肪細胞分化的效果。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于:提供一種靶向血管緊張素原的RNA干擾序列，能干擾降低細胞中血管緊張素原AGT的表達，進而降低脂肪細胞分化程度而抑制脂肪的形成。 本發明要解決的另一技術問題在于:提供一種針對血管緊張素原的RNAi片段構建的表達載體，能降低細胞中血管緊張素原AGT的表達，進而降低脂肪細胞分化程度而抑制脂肪的形成。本發明要解決的又一技術問題在于:提供一種混合克隆細胞株，降低細胞中血管緊張素原AGT的表達，進而降低脂肪細胞分化程度而抑制脂肪的形成。本發明要解決的再一技術問題在于:提供靶向血管緊張素原的RNA干擾片段在抑制肥胖形成中的應用。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案:提供一種靶向血管緊張素原的RNA干擾片段，其序列為SEQ ID N0.1。進一步地，所述血管緊張素原是針對鼠前脂肪細胞內的血管緊張素原。所述鼠血管緊張素原AGT基因的cDNA序列NM007428，其序列表為SEQ ID N0.2。本發明還提供一種靶向血管緊張素原的RNA干擾片段表達載體，該表達載體含有所述的RNA干擾片段。該表達載體具有圖1a所示的結構。所述的祀向血管緊張素原的RNA干擾片段表達載體,插入載體的siR結構為表I所示siR-AGT對應的結構。
本發明進一步提供一種混合克隆細胞株，能降低細胞中血管緊張素原AGT的表達，進而降低脂肪細胞分化程度而抑制脂肪的形成，是由所述靶向血管緊張素原的RNA干擾片段構建表達載體質粒并轉染前脂肪細胞株而建立的。所述的混合克隆細胞株具體由下述步驟制得的:
步驟1:RNAi干擾片段SiR的設計；
步驟2:以設計好的RNAi干擾片段siR插入載體psiRNAT-U6.1/NeoRNAi而構建及合成表達載體質粒PsiR ；
步驟3:以表達載體質粒PsiR轉染鼠前脂肪細胞3T3-L1，并建立混合克隆株。進一步地，所述步驟2具體為:RNAi干擾片段siR插入載體psiRNAT_U6.1/NeoRNAi構建并合成表I的siR-AGT寡聚核苷酸單鏈后，再經退火成雙鏈RNAi片段，PsiRNAT-U6.1/Neo載體經BamH I和Hind III雙酶切成線性載體，最后經T4連接酶與雙鏈RNAi片段連接構建成PsiR表達載體質粒，表達載體結構為圖la。本發明還提供靶向血管緊張素原的RNA干擾片段用于抑制肥胖的應用。本發明的有益效果如下:
由于本發明設計的靶向血管緊張素原的RNA干擾片段siR經過克隆入載體，轉入前脂肪細胞中，血管緊張素原在轉錄后表達水平明顯下調，同時前脂肪細胞向成熟細胞的分化也明顯受到抑制，因此本發明所涉及的干擾序列可以用于抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，具有降低脂肪細胞含量，抑制肥胖形成的用途。


圖1是本發明實施例構建的重組載體質粒psiRNAT-U6.1/Neo的圖譜；其中圖1(a)為PsiR重組載體結構，代表插入siR干擾片段后的質粒圖譜；圖1 (b)為PsiRO重組載體結構圖，代表插入siRO干擾片段后的質粒圖譜。圖2是本發明實施例的RNAi表達載體測序結果圖，其中圖(a)為PsiR測序結果圖，圖(b)為PsiRO測序結果圖；框內標示分別為siR和siRO的序列，I代表堿基G、2代表堿基A、3代表T、4代表C。圖3是本發明實施例熒光定量PCR檢測結果示意圖，其中圖(a)為AGT，β -actinreal-time PCR擴增圖，圖(b)為AGT，β-actin real-time PCR溶解曲線；圖中曲線I 4為β -actin，其中曲線I 2為轉染PsiR質粒的細胞，曲線3 4為轉染PsiRO質粒的細胞；曲線5 8為AGT，其中曲線5 6為轉染PsiRO質粒的細胞，曲線7 8為轉染PsiR。圖4是本發明實施例轉染PsiRO細胞在誘導分化后的油紅O染色X 100倍圖。圖5是本發明實施例轉染PsiR沉默組細胞在誘導分化后的油紅O染色X 100倍圖。圖6是本發明實施例3T3-L1細胞轉染重組質粒后分化過程中脂質含量的變化曲線。圖7是本發明實施例轉染重組質粒對鼠前脂肪細胞分化過程中GPDH活性的影響示意圖，其中*表示差異顯著0.01〈*P〈0.05。圖8是本發明實施例抑制脂肪細胞AGT表達的電泳結果檢測結果圖。
具體實施例方式以下具體實施例對本發明作進一步的說明，以下實施例僅用于說明本發明，而不用于限定本發明的范圍。本發明靶向血管緊張素原的RNA干擾序列的設計，是從NCBI數據庫中查找鼠血管緊張素原AGT基因的cDNA序列NM007428，如序列表SEQ ID N0.2，根據siRNA設計原則，從開放閱讀框的起始密碼(ATG)開始，尋找二個連續的腺嘌呤序列后的19個堿基序列為備選革巴序列。以Ambion公司提供的在線siRNA設計軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) siRNA Target finder 來設計祀序列。為了提高 RNAi 的抑制效率，篩選I條19bp長的靶序列，為避免siRNA非特異性抑制同源性較高的其它基因，利用BLAST軟件，對備選祀序列同源性分析(http://www.ncbinlm.nih.gov/blast),確保無非特異性沉默。序列如SEQ ID N0.1，結構式為:
siR:GCACTCATTTGTTCAGAGC
以上述siR的RNAi片段構建表達載體，同時還設計一條不針對任何基因的19bp的序列(siRO)，作為陰性對照，序列為:siRO:GCGCTGAGTA CTTCGAAAT
以設計好的序列以及所選定的載體psiRNAT-U6.1/Neo (載體psiRNAT_U6.1/Neo購自GenScript公司)為基礎,分別設計出與之互補的反向序列，正向與反向序列之間用LOOP環(TTGATATCCG)連接，確保單鏈分別包括BamH I酶切粘性末端互補片段、19個堿基靶序列、LOOP環、19個堿基靶序列的互補序列、終止信號以及Hind III酶切粘性末端的互補片段共六個區域，分別命名為siR-AGT和siRO-AGT，其序列請參照表I。設計并委托上海生工生物工程有限公司合成寡聚核苷酸單鏈siR-AGT和siRO-AGT，用水溶解到25ymol/L，90°C加熱lOmin，室溫靜置lh，使之退火成雙鏈RNAi。PsiRNAT-U6.1/Neo載體經BamH I和Hind III雙酶切成線性載體，再經T4連接酶與雙鏈RNAi片段連接，構建成兩種載體，分別命名為PsiR、PsiRO，其質粒圖譜見圖1，并經測序正確，測序結果見圖2。其中，圖1的載體質粒psiRNAT-U6.1/Neo圖譜，由GenScript公司提供，圖1 (a)為PsiR重組載體結構，代表插入siR干擾片段后的質粒圖譜，圖1(b)為PsiRO重組載體結構圖，代表插入siRO干擾片段后的質粒圖譜。PsiR中siR基因即為本發明中所設計的靶向AGT序列的干擾序列siR - AGT, siRO基因即為本發明中所設計的非靶向AGT序列的對照序列siRO - AGT0圖2是本發明實施例的RNAi表達載體測序結果圖，載體質粒與干擾片段重組后，將重組載體寄至上海生工生物工程股份有限公司，使用ABI測序儀進行測序，其中圖2 (a)為PsiR測序結果圖，圖2 (b)為PsiRO測序結果圖；框內標示分別為siR和siRO的序列，測序結果證明所設計的靶向AGT序列的干擾序列siR — AGT及對照序列siRO - AGT已插入載體，圖2中數字I代表堿基G、2代表堿基A、3代表T、4代表C。以上述構建得到的表達載體PsiR、PsiRO，轉染鼠前脂肪細胞株3T3-L1，并建立混合克隆細胞株，包括以下步驟:
1.轉染:鼠前脂肪細胞3T3-L1(來源于廣州中國科學院廣州生物醫藥與健康研究所)按照2 X IO4個/孔接種于24孔板中，371:，5%(￥八)0)2(此處5%指二氧化碳培養箱所調節的CO2 體積比濃度，v/v)用 10% (m/m)FCS (fetal bovine serum,胎牛血清)+DMEM (Dulbecco改良Eagle培養基，簡稱DMEM)培養基培養，到細胞匯合至90%，更換無抗生素無血清FCS的DMEM培養基培養過夜。利用Lipofectamine2000試劑，將各組質粒PsiR、PsiRO分別轉染入3T3-L1鼠前脂肪細胞株中。2.建立混合克隆細胞株:為了排除未轉染干擾質粒細胞的影響，轉染48小時后，加入含600 μ g/mL G418進行篩選，10 14天后建立定點轉染混合克隆細胞株。經實驗證明，本發明設計的干擾質粒PsiR、PsiRO能降低3T3-L1細胞中血管緊張素原AGT的表達，干擾減低鼠血管緊張素原mRNA表達量約46%以上，蛋白水平表達量約43.9%。同時脂肪細胞分化程度降低，這表明針對鼠血管緊張素原的RNAi序列能夠抑制脂肪細胞的分化，有可能抑制脂肪的形成。實施例1RNAi片段的設計
從NCBI數據庫中查找鼠血管緊張素原AGT基因的cDNA序列(NM007428，見序列表SEQID N0.2，根據siRNA設計原則，從開放閱讀框的起始密碼(ATG)開始，尋找二個連續的腺嘌呤序列后的19個堿基序列為備選靶序列。以Ambion公司提供的在線siRNA設計軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) siRNA Target finder 來設計靶序列。為了提高RNAi的抑制效率，篩選I條19bp長的靶序列，命名為siR。為避免siRNA非特異性抑制同源性較高的其它基因，利用BLAST軟件，對備選靶序列同源性分析(http://www.ncbinlm.nih.gov/blast),確保無非特異性沉默。此外,還設計一條不針對任何基因的19bp的序列(siRO)，作為陰性對照，兩條序列送由上海生工合成，具體序列見下:siR:GCACTCATTTGTTCAGAGCsiRO:GCGCTGAGTACTTCGAAAT。實施例2RNAi表達載體的構建
以設計好的序列以及所選定的載體psiRNAT-U6.1/Neo (購自GenScript公司)為基礎，分別設計出與之互補的反向序列，正向與反向序列之間用LOOP環(TTGATATCCG)連接，確保單鏈分別包括BamH I酶切粘性末端互補片段、19個堿基靶序列、LOOP環、19個堿基靶序列的互補序列、終止信號以及HindIII酶切粘性末端的互補片段共六個區域。如表1:
表1插入psiRNAT-U6.1/Neo線性載體的寡聚核苷酸片段
權利要求
1.一種靶向血管緊張素原的RNA干擾片段，其序列為SEQ ID N0.1。
2.如權利要求1所述的靶向血管緊張素原的RNA干擾片段，其特征在于:所述血管緊張素原是針對鼠前脂肪細胞內的血管緊張素原。
3.如權利要求2所述的靶向血管緊張素原的RNA干擾片段，其特征在于:所述鼠血管緊張素原AGT基因的cDNA序列NM007428，其序列表為SEQ ID N0.2。
4.一種祀向血管緊張素原的RNA干擾片段表達載體,其特征在于:該表達載體含有權利要求I 3中任一項所述的RNA干擾片段。
5.如權利要求4所述的靶向血管緊張素原的RNA干擾片段表達載體，其特征在于:該表達載體具有圖1a所示的結構。
6.如權利要求5所述的靶向血管緊張素原的RNA干擾片段表達載體，其特征在于:插入載體的siR結構為表I所示siR-AGT對應的結構。
7.一種混合克隆細胞株，能降低細胞中血管緊張素原AGT的表達，進而降低脂肪細胞分化程度而抑制脂肪的形成，其特征在于:是由權利要求1 3中任一項所述靶向血管緊張素原的RNA干擾片段構建表達載體質粒并轉染前脂肪細胞株而建立的。
8.如權利要求7所述的混合克隆細胞株，其特征在于:具體由下述步驟制得的:步驟I =RNAi干擾片段siR的設計； 步驟2:以設計好的RNAi干擾片段siR插入載體psiRNAT-U6.1/NeoRNAi而構建及合成表達載體質粒PsiR ； 步驟3:以表達載體質粒PsiR轉染鼠前脂肪細胞3T3-L1，并建立混合克隆株。
9.如權利要求7所述的混合`克隆細胞株，其特征在于:所述步驟2具體為:RNAi干擾片段siR插入載體psiRNAT-U6.1/NeoRNAi構建并合成表I的siR-AGT寡聚核苷酸單鏈后，再經退火成雙鏈RNAi片段，PsiRNAT-U6.1/Neo載體經BamH I和Hind III雙酶切成線性載體，最后經T4連接酶與雙鏈RNAi片段連接構建成PsiR表達載體質粒，表達載體結構為圖1a0
10.如權利要求1 2中任一項所述靶向血管緊張素原的RNA干擾片段用于抑制肥胖的應用。
全文摘要
本發明涉及一種靶向血管緊張素原的RNA干擾片段其序列為如序列表SEQ ID NO.1，還涉及其表達載體以及用于抑制肥胖的應用。由于本發明的干擾序列siR經過克隆入載體，轉入前脂肪細胞中，血管緊張素原在轉錄后表達水平明顯下調，同時前脂肪細胞向成熟細胞的分化也明顯受到抑制，因此本發明所涉及的干擾序列可以用于抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，具有降低脂肪細胞含量，抑制肥胖形成的用途。
文檔編號C12N15/113GK103103192SQ20131001868
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者黃志立, 張麗君, 伍麗華 申請人:深圳職業技術學院