專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其微生態制劑和在動物飼料中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌，特別是公開一種含有該枯草芽孢桿菌的微生態制劑以及在動物飼料中的應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
飼料添加劑對強化飼料營養價值、改善飼料品質、節約飼料成本以及促進動物健康生長有非常重要的作用。抗生素被用作飼料添加劑后，為動物生產提供了一定的防疫保障，也給畜牧業帶來了巨大的經濟效益。但是隨著社會的發展與科技的進步，利用抗生素作為飼料添加劑的弊端也逐步暴露，表現為病原微生物的抗藥性逐漸增強，動物產品藥物殘留[1]，對人類的健康和生態環境的安全帶來了潛在的威脅。因此，抗生素替代品益生菌制齊U、酸制劑、酶制劑以及一些復合生態制劑等的研究與應用，逐漸成為了畜牧工作者關注的
執占[2_5]。枯草芽孢桿菌是公認的腸道有益菌[6]，其代謝過程產生多種生物活性物質，作用表現為:
1、枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，這些活性物質對致病菌或內源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用；
2、枯草芽孢桿菌迅速消耗環境中的游離氧，造成腸道低氧，促進有益厭氧菌生長，并產生乳酸等有機酸類，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長；
3、刺激動物免疫器官的生長發育，激活T、B淋巴細胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強細胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力；
4、枯草芽孢桿菌菌體自身合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內的消化酶類一同發揮作用；
5、能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內干擾素和巨噬細胞的活性。枯草芽孢桿菌具有耐高溫高壓，利于飼料加工，易于貯存的特點，在動物生產中的應用一直是畜牧業科研人員研究的重點。目前我國飼料行業微生態制劑的生產菌種較為滯后，微生態制劑的生產較為單一 [7_8]，急需篩選出更多更優秀的菌種以滿足畜牧業發展的需求。

發明內容
本發明的目的是針對上述現有技術存在的問題，提供一種枯草芽孢桿菌及其微生態制劑和在動物飼料中的應用，本發明的枯草芽孢桿菌耐酸、耐堿，可較長時間承受一定程度的高溫高壓，可抑制大腸桿菌的生長繁殖。本發明含有上述枯草芽孢桿菌的微生態制劑能替代抗生素用于動物飼料，用以維持 動物腸道正常的微生物區系，從而促進動物生長、提高飼料報酬。。本發明是這樣實現的:一種枯草芽孢桿菌，其特征在于:該枯草芽孢桿菌為2009年12月17日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的枯草芽孢桿^Bacillus subtilis,保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.3532。所述的枯草芽孢桿菌(.Bacillus subtilis) CGMCC N0.3532為革蘭氏陽性菌，在LB培養基上的菌落為白色、扁平、表面粗糙、邊緣不整齊，細胞直徑小于I微米、細胞形態為桿狀，形成芽孢但不產生伴孢晶體。在PH為5.(T8.5之間生長良好，在pH為3.5的環境中，培養5h內的存活率在90%以上，在pH為9.0的環境中，培養5h，存活率亦在85%以上。在90°C恒溫水浴處理30分鐘以后，存活率在70%以上。該枯草芽孢桿菌能夠很好的適應動物消化道環境，對飼料加工過程的熱處理不敏感，有利于制粒和膨化等工藝。—種含有枯草芽孢桿菌的微生態制劑，采用上述枯草芽孢桿菌在培養基中充分培養、發酵后得到的代謝產物與吸附劑、稀釋劑混合均勻后，經烘干、粉碎后得到微生態制劑。所述枯草芽孢桿菌的制備方法:
菌株原種的分離培養:①固體平板培養基配方為蛋白胨log、酵母提取物5g、蔗糖25g、瓊脂粉15 — 20g、氯化鈉5g、加去離子水到總體積1000ml，培養條件為pH6_8、溫度為35°C、培養24-48h !②液體培養基為蛋白胨10g、鹿糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸鈣0.lg、加去離子水到總體積1000ml，挑取①得到的単菌落進行液體擴大培養，培養條件為PH6-8、溫度為37°C、恒溫搖床160rpm/min、培養15_18h ;③發酵培養基配方為玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂
0.05%、氯化鐵0.01%,2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%，接種②得到的培養基菌液混合液3-5%進行發酵培養，培養條件為PH6-8、溫度為35°C、發酵罐攪拌器轉速120rpm/min，發酵時間為 30-84h。、
所述的吸附劑為特制二氧化硅，所述的稀釋劑為輕質碳酸鈣、麩皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任何一種或一種以上的組合。所述培養、發酵后 得到的代謝產物與吸附劑、稀釋劑以質量比1:1:2比例混合。所述枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的應用，包括動物日糧和枯草芽孢桿菌微生態制劑，所述的枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的添加量為動物飼料重量的
0.05%-0.15%。飼用動物包括單胃動物、反芻動物以及水產動物。本發明的有益效果是:本發明的枯草芽孢桿菌心subtilis ) CGMCCN0.3532具有耐酸、耐堿、耐熱、抑制腸道有害菌群(如大腸桿菌)的生長和繁殖，該枯草芽孢桿菌制劑作為動物飼料添加劑，可替代現有動物飼料中的抗生素，可改善動物胃腸道微生物區系、促進動物健康生長、增強動物免疫機能、提供營養因子、提高飼料轉化率、促進營養物質的吸收、降低動物腹瀉率，可提高仔豬、仔雞的生產性能。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )CGMCC N0.3532及其微生態制劑無耐藥性，不會對環境造成破壞，也不會對人類的健康造成危害，是一種環境友好型微生態飼料添加劑。保藏說明
菌株:枯草芽抱桿菌subtilis 保藏日期:2009年12月17日
保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號 保藏編號:CGMCC N0.353具體實施例方式以下結合實施例詳細介紹本發明的枯草芽孢桿菌(^3ci77tts subtilis ),保藏號:CGMCC N0.3532微生態制劑在實際生產中的應用效果。實施例1:
本實施例為保藏號為CGMCC N0.3532的枯草芽孢桿菌的篩選過程，具體步驟如下:
(I)、菌種的初步篩選
取仔豬十二指腸、回腸和直腸內容物進行生物篩選。將所取的腸道內容物在80-90°C的水域中熱處理15分鐘，用滅菌去離子水分別作I倍稀釋、5倍稀釋、10倍稀釋、20倍稀釋、100倍稀釋、1000倍稀釋后，LB培養基平板培養。篩選用LB 培養基，既蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g、瓊脂粉15_20g，加去離子水IOOOmL, 115°C高壓滅菌15min。(2)、菌種的復篩
將初篩出的枯草芽孢桿菌在液體培養基中培養，培養基配方為液體培養基為蛋白胨10g、鹿糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸|丐0.lg、加去離子水到總體積1000ml，37°C、210rpm恒溫搖床培養15_18h。將得到的菌液在80°C水浴中處理5min后復篩，復篩培養基為:蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g、蔗糖25g、瓊脂粉15-20g,加去離子水IOOOmL, 115°C高壓滅菌15min。(3)、菌種耐酸堿的實驗
將復篩得到的枯草芽孢桿菌菌液分別在PH為3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,6.5,7.0、
7.5、8.0、8.5、9.0、10.0的液體LB培養基中培養5h后，該枯草芽孢桿菌在pH為3.5處理組中存活率為91.5%，在pH為9.0處理組中存活率為86.2%。實施例2:
將實施例1所得的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )，保藏號:CGMCC N0.3532接種于固體斜面培養基上，所述固體斜面培養基配方為:蛋白胨10g、酵母提取物5g、蔗糖25g、瓊脂粉15 — 20g、氯化鈉5g、加去離子水到總體積1000ml，35°C恒溫培養36h，得到種子培養物接種于液體培養基中擴大培養，培養基配方為:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸|丐0.lg、加去離子水到總體積1000ml,37°C、160rpm/min恒溫培養15_18h,取得到的菌液按體積比3_5%于發酵培養基中培養,發酵培養及配方為玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂0.05%、氯化鐵0.01%,2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%，35°C、發酵罐攪拌器轉速120rpm，發酵時間為72h，將得到的培養物與二氧化硅和輕質碳酸鈣按1:1:2重量比混合，經干燥、粉碎得到枯草芽孢桿菌微生態制劑。實施例3:
將實施例:1所得的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )，保藏號:CGMCC N0.3532接種于固體斜面培養基上，所述固體斜面培養基配方為:蛋白胨10g、酵母提取物5g、蔗糖25g、瓊脂粉15 — 20g、氯化鈉5g、加去離子水到總體積1000ml，35°C恒溫培養36h，得到種子培養物接種于液體培養基中擴大培養，培養基配方為:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸I丐0.lg、加去離子水到總體積1000ml, 37°C、160rpm/min恒溫培養15_18h,取得到的菌液按體積比3_5%于發酵培養基中培養,發酵培養及配方為玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂
0.05%、氯化鐵0.01%、2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%，35 °C、發酵罐攪拌器轉速120rpm，發酵時間為72h，將得到的培養物與二氧化硅和麩皮按1:1:2的重量比混合，經干燥、粉碎得到枯草芽孢桿菌微生態制劑。實驗例:
本實驗例是實施例2所得到的枯 草芽孢桿菌微生態制劑對仔豬生產性能的影響，用日齡一致、體重接近的杜長大斷奶仔豬60頭，觀察枯草芽孢桿菌微生態制劑對仔豬生產性能的影響。仔豬分三個試驗組，試驗I組，為對照組，試驗II組飼喂基礎日糧和添加0.05%的枯草芽孢桿菌微生態制劑，處理III組飼喂基礎日糧和添加0.1%的枯草芽孢桿菌微生態制劑。I材料與方法
1.1微生態制劑
枯草芽孢桿菌微生態制劑，采用實施例2的枯草芽孢桿菌制劑。1.2試驗動物
選擇日齡一致、體重接近的(杜長大)斷奶仔豬60頭，公母各半，按完全隨即分組設計分為3組，每組5個重復，每個重復4頭仔豬，公母分開飼喂。1.3試驗日糧
試驗分為3個處理組，即對照組(飼喂基礎日糧+55mg/kg金霉素)，試驗I組(飼喂基礎日糧+0.05%的枯草芽孢桿菌微生態制劑)，試驗II組(基礎日糧+0.1%的枯草芽孢桿菌微生態制劑)。基礎日糧原料組成及營養成分見表I。表I為試驗基礎日糧組成及營養水平比較表。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于:該枯草芽孢桿菌為2009年12月17日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的枯草芽孢桿菌Bacillus保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.3532。
2.根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于: 1)在pH為3.5的環境中，培養5h內的存活率在90%以上； 2)在pH為9.0的環境中，培養5h，存活率亦在85%以上； 3)在90°C恒溫水浴處理30分鐘以后，存活率在70%以上。
3.一種含有權利要求1或2所述枯草芽孢桿菌的微生態制劑，其特征在于:枯草芽孢桿菌在培養基中經 充分培養、發酵之后所得到的代謝產物與吸附劑/稀釋劑按1:1:2比例混合，經烘干、粉碎后得到的微生態制劑，所述的吸附劑為特制二氧化硅，所述的稀釋劑為輕質碳酸鈣、麩皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任意一種或一種以上的組合。
4.根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌微生態制劑，其特征在于:所述培養過程將枯草芽孢桿菌接種于液體培養基中進行擴大培養。
5.根據權利3或4所述枯草芽孢桿菌的微生態制劑，其特征在于:所述的液體培養基為適合枯草芽孢桿菌生長的任何培養基，其優選培養基配方為:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸鈣0.lg、加去離子水到總體積IOOOml0
6.根據權利3所述枯草芽孢桿菌的微生態制劑，其特征在于:所述的發酵培養基為適合枯草芽孢桿菌生長的任何培養基；其優選培養基配方為:玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂0.05%、氯化鐵0.01%,2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%。
7.根據權利3-6中任意一項所述枯草芽孢桿菌的微生態制劑,其特征在于:所述培養基是在溫度為35-37°C的條件下，培養15-72h ;其優選枯草芽孢桿菌接種于固體斜面培養基,在35°C的恒溫培養箱中，培養36h作為種子培養物，所述的種子培養物接種于液體擴大培養基，在溫度為35-37°C下，培養15-18h ;擴大培養的代謝產物接種到發酵培養基中培養，在35°C下，培養72h。
8.一種含有權利要求3-7中任一項所述枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的應用，包括動物日糧和枯草芽孢桿菌微生態制劑，所述的枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的添加量為動物飼料重量的0.05%-0.15%。
9.根據權利要求8所述的枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的應用，其特征在于:所述的枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的添加量優選為動物飼料重量的0.1%。
10.根據權利要求8所述的枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的應用，其特征在于:所述動物日糧包括豬用日糧、雞用日糧、水產動物用日糧和反芻動物用日糧。
全文摘要
本發明為一種枯草芽孢桿菌及其微生態制劑和在動物飼料中的應用，其特征在于該枯草芽孢桿菌為2009年12月17日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》的枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，保藏中心登記入冊編號CGMCCNo.3532。枯草芽孢桿菌在培養基中經充分培養、發酵之后所得到的代謝產物與吸附劑和稀釋劑按1:1:2比例混合，經烘干、粉碎后得到的微生態制劑，所述的吸附劑為特制二氧化硅，所述的稀釋劑為輕質碳酸鈣、麩皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任意一種或一種以上的組合。所述的枯草芽孢桿菌微生態制劑在動物飼料中的添加量為動物飼料重量的0.05%-0.15%，提高動物免疫機能，可有效替代抗生素。
文檔編號C12N1/20GK103087964SQ201310040239
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者王海東, 潘寶海, 陳 峰 申請人:上海三維同力生物科技有限公司