專利名稱：一株能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株。
背景技術：
植物內生菌的研究始于19世紀末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌[2]。目前從植物中分離的內生 菌根據其具有的獨特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病蟲害的生防菌[5~8]和具有促進植物對不良環境的修復能力的抗性菌。在促進光合作用方面的內生菌報道極少，僅有在水稻上發現一種具有光合作用能力的內生菌，它也被證明是豆莢Aeschynomene[9]莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一個株系。木麻黃科植物是兼有弗蘭克氏菌菌(Frankia)、內生菌根菌和外生菌根菌的共生營養型植物，因此，關于木麻黃真菌學方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌(Frankia)、青枯菌(Solanasearum)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum Smith)等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內生真菌方面的研究尚未見報道[1°_11]。前人的研究中應用菌株，多為外生真菌，同時也沒有從促進光合作用的根本因素去尋找內生真菌，提高其科學性和可靠性[12]。證實能促進光合作用的內生菌方面尚未見報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一株能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株。本發明提供的一株能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株，為葉點霉{Phyllosticta sp.)木麻黃根際真菌16,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6308。該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續調整消毒方法[13_15]；
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個部分的鱗狀葉小枝，每個鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個部分；D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養基表面，于28°C恒溫培養箱內培養5— 7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩定后純化。固體培養:使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接后得到單一菌種的上述的Phyllostic-ta sp.功能菌株；
其在平面培養基上，菌落呈圓形，由中心向外輻射狀褶皺，中部隆起；背部褶皺，生長速度極慢。分生孢子器暗色，有孔，兩面凸到球形；分生抱子梗短；分生孢子小，單孢，無色，卵圓形到長；參照真菌鑒定手冊將其鑒定為葉點霉屬sp.),保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6308。上述的一種能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株應用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。上述的一種能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。上述的一種能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株應用菌液的應用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根lOmin。本發明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標菌株為葉點霉{Phyllosticta sp.)木麻黃根際真菌16,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6308。將木麻黃根際真菌16接種于木麻黃水培苗，根據光合作用的各項指標綜合評判，進一步證實其對光合作用具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質的增效作用，尋找到對促進光合作用有益的功能內生真菌可應用于生產。菌株16處理的Fm值為對照苗木的2.13倍，Fv為對照苗木的2.21倍，Fv/Fm值與對照CK相比增加了 6.24%。OPSII較對照增加了 14.10%, Rfd對照CK相比增加了 6.30%。說明了接菌處理有利于提高苗木的潛在光合能力。菌株16號處理下苗木的生物量鮮重、生物量干重、地上部分鮮重和干重、地下部分鮮重和干重都顯著高于其他菌株處理下的苗木，生物量鮮重達到1.043g，為對照CK的2.34倍，生物量干重達到0.283g，為對照CK的1.66倍，地上部分與地下部分各生物量指標較對照的增幅至少達到33%以上，因此，菌株16號對木麻黃苗木的生物量促進作用很明顯。`


圖1為不同接菌處理下苗木Fm、Fv的比較。圖2為不同接菌處理植株苗木Fv/Fm的比較。
具體實施例方式1、水培繁殖中的應用
取配制好的木麻黃根際真菌16 (菌株16)應用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin。可提高植苗成活率10%以上。2、根際土壤澆施應用
試驗材料為惠安一號水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農林大學森林生態研究所田間試驗地。 水培苗根系長齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24h。待土壤內甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發，以免影響幼苗的移植成活率。經過一個月的恢復性生長，在木麻黃根際施入菌株濃度為9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對照。菌液的制備:將菌株16接入液體培養基，培養基為改良馬丁培養基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂0.5g，其它為無菌水，pH值6.4±0.2。經過24h的培養，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成
1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進行光合作用等指標的測定，檢測方法和結果如下:
2.1菌株澆施后木麻黃葉綠素熒光參數分析
應用 Photon Systems Instruments.(PSI)公司生產的 Handy Fluor Cam 突光成像儀在夜間19:00-22:00測定木麻黃苗木的葉綠素熒光參數，測定前先將苗木放入暗箱內，充分暗反應20min，隨后將苗木放于攝像頭之下，調節焦距至能看清葉片圖像為止。測量的原始參數有:Fo (最小、基礎或不變熒光強度等)是光系統II (PS II )反應中心所有電子均處于完全開放時的熒光產量，它與葉片的葉綠素濃度有關；Fm(最大熒光)是葉片經暗適應20min后，光系統II (PS II )反應中心處于完全關閉時的熒光產量，可反映PS II的電子傳遞情況；Fo':(光下最小熒光)是光適應狀態下全部PS II中心都開放時的突光強度；Fm'(光下最大突光)是光適應狀態下全部PS II中心都關閉時的突光強度。其它動力學參數:
X Fv/Fm= (Fm-Fo)/Fm:PS II的最大或潛在的光化學效率，反映的是PS II原初光能轉化效率[19_2°]，非脅迫條件下該值變化極小，脅迫條件下該值有明顯下降[21]；:2 Yield=OPSII=AFziFm' =(Fm/ -FVFm':PS II 實際光化學量子效率，反映了植物目前的實際光合效率；
5: qN=(Fv-Fv' )/Fv=1-(Fm' -Fo' )/(Fm-Fo)或 NPQ=(Fm-Fm' )/Fm' =Fm' -1:非光化學淬滅系數；
Φ Rfd=Fd/Fs= (Fm-Fs )/Fs:此比值為葉片活力指標,反映葉片光合作用活力，即葉片潛在的光合作用量子轉化效率。對不同處理下各苗木的原始熒光參數(Fm、Fv)和其他動力學葉綠素熒光參數(Fv/Fm、OPSI1、Rfd和NPQ)進行單因素方差分析，以檢驗其變化的顯著性，多重比較采用Duncan法，所有數據處理以及圖表制作均采用Excel和SPSS軟件處理。I不同處理水培苗Fm、Fv和Fv/Fm的值
熒光分析當中，Fm和Fv均反映著光系統II的光化學活性。最大熒光(即Fm)是光系統II (即PS II )反應中心處于完全關閉狀態下的熒光產量，它既可以反映光系統II的電子傳遞情況，也能反映光是否受到抑制的情況(當Fm降低時)；可變熒光(即Fv)為Fm與Fo之差，反映著光系統II的電子受體一初級醌受體(即QA)的還原情況，研究發現，Fv值的變化程度反映著植物對周圍環境脅迫的忍耐能力[16]。從圖1中的Fm可以看出，菌株16處理的Fm值較對照CK有顯著的提高，差異達到顯著水平，為對照苗木的2.13倍。從圖1中的Fv可以看出，菌株16號增幅較大，為對照苗木的2.21倍。熒光參數中，PS II的實際光化學效率(即Fv/Fm)是研究植物光合生理狀態的重要參數，反映著植物的潛在光合能力，同時也是研究植物脅迫的重要參數，在非脅迫的環境條件下，植物的物種與生長條件對其影響不大，該參數值保持在0.75與0.85之間，一旦受到外界脅迫作用，Fv/Fm呈現明顯的下降趨勢，其值的減小意味著光系統II反應中心的光化學損害與光能熱耗散的增加[17]。圖2直觀地反映了菌株16接菌方式對木麻黃苗木Fv/Fm的影響。菌株16處理的植株顯著高于對照，與對照CK相比，增加了 6.24%。說明了接菌處理有利于提高苗木的潛在光合能力。2不同處理水培 苗ΦPSI1、Rfd和NPQ的值
表I不同處理下木麻黃水培苗葉綠素熒光參數的特征值
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*在表中的同一列數值中，有不同小寫字母者表示差異顯著(P < 0.05)
OPSII能準確反映植物當前PSII反應中心的實際光合效率狀況，其值越大，光合結構電子傳遞能力越強，參與光化學反應的光能份額越大，越有利于提高植物的光合能力18]。由表I的參數特征值可以看出，菌株16號的OPSII較對照增加了 14.10% ;Rfd為葉片活力指標，反映葉片光合作用活力，即葉片潛在的光合作用量子轉化效率，與植物光合作用成線性關系，可直觀反映植物的光合作用能力，Rfd值的測定中發現，菌株16號與對照CK相比增加了 6.30%ο3不同處理對木麻黃水培苗生物量的影響
生物量是反映苗木生產力水平的重要指標，它與苗木地上與地下部分的生長發育之間有著極為密切的關系；植物的根冠比是指植物地下部分與地上部分的干重的比值，它的大小能夠表征苗木對土壤養分或光照的需求與競爭能力，若根冠比值越大，則說明苗木對養分的需求和競爭能力越強，相反根冠比值越小，則說明苗木對光照的需求和競爭能力越強。用SPSS 18.0統計分析軟件對木麻黃苗木的各生物量指標進行方差分析，結果表明不同處理下木麻黃苗木的各生物量指標的Sig均為0.000，即差異均達到顯著水平(顯著水平為
0.05)，各指標的多重比較見表2。表19不同處理對木麻黃苗木生物量的影響
權利要求
1.一株能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株，為葉點霉5/7.)木麻黃根際真菌16，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6308。
2.一種如權利要求1所述的葉點霉菌株的應用菌液，其特征在于:所述應用菌液的制備方法，是將所述的葉點霉sp.)木麻黃根際真菌16接入液體培養基,搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—種如權利要求2所述的應用菌液的用途，其特征在于:所述應用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期蘸根。·
全文摘要
本發明涉及一株能促進木麻黃光合作用的葉點霉菌株，為葉點霉(Phyllostictasp.)木麻黃根際真菌16，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCNo.6308。將木麻黃根際真菌16接種于木麻黃水培苗，根據光合作用的各項指標綜合評判，進一步證實其對光合作用具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質的增效作用，尋找到對促進光合作用有益的功能內生真菌可應用于生產。
文檔編號C12R1/645GK103173363SQ20131006879
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者吳承禎, 洪偉, 謝安強, 林燕青, 林勇明 申請人:福建農林大學