專利名稱：Leber病之線粒體T12338C檢測試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及用于檢測與Leber氏病相關的線粒體DNA ND5T12338C突變的試劑盒，還涉及一種與原發性Leber氏病相關的線粒體基因突變的檢測方法，特別涉及檢測線粒體M^T12338C突變的方法，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測與原發性Leber氏病相關的線粒體DNA T12338C突變中的應用。
背景技術：
Leber 遺傳性視神經病變(Leber，s Hereditary Optic Neuropathy, LH0N,簡稱Leber氏病)是一種母系遺傳性視神經病變，主要累及視網膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維，導致視神經退行性變的母系遺傳病，嚴重的影響著人們正常的生產、生活。根據國家衛生部(http://www .moh.gov.cn/)最新數據統計我國現有的低視力人口約有710萬,盲人約有500萬，占總人數的0.4%，成為世界上視力損傷最嚴重的國家之一。其中，由視神經病變引起的約為55萬。1871年德國眼科醫生Theodor Leber首次報道該病的臨床癥狀、體征和遺傳特性。1972年Erickson等發現LHON的遺傳方式呈典型的母系遺傳特征。1988年Wallace DC等發現了第一個與LHON相關的線粒體基因組DNA(mitochondria DNA, mtDNA)突變位點似衫G11778A。目前已報道50多種線粒體DNA突變位點與LHON致病相關(http://www.mitomap.0rg/),其中90%以上的LHON的家系是由氧化磷酸化復合物I亞基上的ND4G11778A、ND1 G3460A和ND6 T14484C這3個原發突變位點所致。為了進一步探究LHON的發病機制，在全國范圍內收集了大量的LHON家系，除上述3個原發性突變位點外，相繼發現了 tRNAMetA4435G、似衫 G11696A、tRNAThr A15951G、M 7 T3866C 和似枚 T12338C 突變與 LHON相關，與線粒體相關的原發性Leber氏病在早期臨床癥狀不明顯，早期的檢查常常會因此被耽誤，尤其在我國偏遠農村地區，這種情況普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中開展mtDNA突變篩查，對于預防和控制與線粒體相關的原發性Leber氏病的發生有著極其重要的作用。自發現與mtDNA突變相關的疾病以來，檢測線粒體突變位點的檢測方法主要還是序列測定。直接測序法是鑒定突變的黃金標準，但該操作繁瑣，費用昂貴限制了它的廣泛應用。近年來，國內相繼報道了 Leber遺傳性視神經病變的基因診斷試劑盒及其檢測方法，以滿足對線粒體突變突變進行廣泛篩查的需要，如福建醫科大學于2005年申請了的基因診斷試劑盒及其檢測方法專利(專利號:200510006097.8)，該發明是根據90 %以上的Leber氏遺傳性視神經病變患者的線粒體DNA突變屬于3個原發性致病位點突變(G11778A、G3460A和T14484C)，設計和合成位點特異性PCR引物，直接以全血樣作PCR的DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術，單管一次性PCR反應，同時檢測LHON患者的線粒體DNA的3個原發性致病突變位點，具有簡便快速、高效、費用低、特異性好、只需微量血液樣本等優點，為LHON患者的快速臨床基因診斷提供一種簡易、可靠的方法和試劑盒，具有巨大的普及推廣應用價值。但是該方法存在血液中直接PCR擴增的難度加大，實驗中采取的多重PCR的條件要求將會增加，檢測方法跟普通的方法沒有本質的區別。2006年杭州優思達生物科技有限公司建立一種以單核苷酸多態性核酸試紙快速檢測LHON線粒體DNA中G11778A位點突變的新方法(專利號:200610003429.1)。在應用單核苷酸多態性核酸檢測試紙條進行多態位點或突變位點的檢測時，需要設計一條特異性延伸引物，這條引物的3’端堿基緊臨多態性堿基或突變堿基，其在DNA聚合酶的作用下開始延伸，帶有抗原標記與模板對應的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠實現短時間內的檢測陽性位點，但PCR擴增條件嚴格，存在假陰性的幾率大大增加。

發明內容
本發明的目的是針對目前檢測tRNAIle T12338C突變的方法所存在的缺點，提供一種Leber病之線粒體T12338C檢測試劑盒，是一種快速、簡便、準確、經濟的檢測原發性Leber氏病相關的線粒體DNA突變的試劑盒。本發明提供的試劑盒，由置于盒體內的DNA提取混合液、擴增T12338C的PCR混合液、針對T12338C設計的一對外引物、針對T12338C設計的一對內引物、限制性內切酶Psi 1、陽性對照和陰性對照構成。其中提取DNA提取混合液主要由細胞裂解液和溶液I(主要成分是蛋白酶K)組成；擴增T12338C的PCR混合液試劑包括dNTP (脫氧單核苷酸)、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，針對T12338C設計的外引物包括外前向引物 F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物 R: AGA AGG ATATAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2);針對T12338C設計的內引物包括內前向引物F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAM TTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA (SEQ ID NO:3)，內反向引物R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA (SEQ ID NO:4);限制性內切酶包括限制性內切酶Psi I ；陽性標本對照是不含有線粒體序列第12338位點發生T>C突變的酶切樣本、陰性標本對照是含有線粒體序列第12338位點發生T>C突變的酶切樣本。在上述試劑 盒中，在擴增T12338C的PCR混合液中添加用于提高延伸反應特異性的少許二甲基亞砜(0.1-0.2 μ I)。本發明的另一個目的是提供所述試劑盒在檢測與Leber氏病相關的線粒體基因M^T12338C突變中的應用。通過以下步驟實現:
(1)基因組DNA的提取:運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA ；
(2)特異性PCR擴增:使用Primer5.0軟件和01 igo7.0軟件根據SEQ ID N0:5所示的人類線粒體基因序列所設計的引物F#/R#、F#/I^是能擴增出包含上述原發性Leber氏病的線粒體突變位點的片段，F#/R#卜擴增出為線粒體DNA的核苷酸11929-12793，其序列為序列表中的SEQ ID N0:l、2 ;F /R肖擴增出為線粒體DNA的核苷酸12268-12488，其序列為序列表中的SEQ ID Ν0:3、4
(3)酶切鑒定:將上述PCR產物用限制性內切酶I對T12338C位點處進行酶切；
(4)突變檢測:聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生T12338C突變。在上述檢測mtDNA T12338C突變的方法中，可從血標本(如一滴血)、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，根據取樣方式或被測樣本形式不同，對不同樣本進行相應的預處理，處理方法如下:
(1)血標本(如一滴血):取20 200μ I少量血標本(如一滴血)或Icm2的血濾紙片放入1.5ml EP管(離心管)，加入900μl紅細胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.6)(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉淀；
(2)帶毛囊的毛發:用體積比70%乙醇洗帶毛囊的毛發I次，后再用蒸餾水沖洗毛發2次。在1.5ml EP管中分別放入2 4根毛發，毛囊置于EP管底部，用干凈的剪刀剪去毛發高于EP管的部分；
(3)口腔粘膜刮片或唾液:收集唾液前，必須讓被收集者漱口。以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質。半小時內不要喝水、進食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，可視條件選 擇如下方法收集唾液樣本:①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細胞，將約0.1ml唾液直接吐進EP管內生理鹽水漱口，吐進EP管內，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的EP管中，反復吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復該過程一次用棉拭子反復刮拭面頰內壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入EP管中將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成大小約Icm2碎紙片置于EP管中。然后用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，利用鹽析法去除蛋白等雜質，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于-20°C保存備用。在本發明的實施方案中，引物設計的指導思想是，針對mtDNA T12338C位點存在的位置相鄰近，擴增在一條片段上，故應設計3’末端與12338位點野生型T和12338位點突變型C相對應的上游引物；針對12338位點設計3’末端分別與12338位點野生型T和12338位點突變型C相對應的下游引物。(參照圖2)
本發明人針對設計的特殊的引物形成限制性酶切位點進行特異性PCR擴增(圖3)，mtDNA T12338C發生突變后使形成的酶切位點消失。酶切位點是由mtDNA T12338C突變形成的，其中的限制性內切酶為I，其位點處為序列表中的SEQ ID N0:3、4;
用以上設計的引物，以相應的被檢測樣本的DNA為模板，通過PCR擴增后分別獲得明亮清晰的大小約221bp的恒定擴增帶，12338突變位點對應于擴增片段的第70位。在上述檢測線粒體基因原發性Leber氏病突變的方法中，結合特異性PCR技術和酶切技術，每份DNA樣本分別用特異性引物即引物F/R于PCR反應管中進行普通PCR擴增，然后進行突變位點處的酶切，通過一次PCR便可在幾小時內檢出原發性Leber氏病相關的mtDNA T12338C 突變。理論上，基因組DNA樣本經一次PCR反應，即體系中僅加入針對突變型位點T12338C引物F/R后，加入針對突變位點新形成的限制性內切酶泣_7 I進行酶切，就可進行檢測。也就是說，同一基因組DNA樣本經一次PCR-酶切，從而使檢測結果更為準確、可信。本發明人還根據本發明中設計的引物序列，通過人工合成(委托生物公司)獲得引物，并將引物按一定的比例混合，與提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標本對照、陰性標本對照以及使用說明書組合起來，制成了用于體外檢測母系遺傳原發性Leber氏病線粒體基因mtDNA T12338C突變的試劑盒，使得樣本DNA提取、特異性PCR擴增和酶切可以在試劑盒提供的試劑基礎上順利完成。其中，提取樣本DNA的試劑主要由細胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；PCR擴增反應試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，限制性內切酶包括限制性內切酶泣7 I。用本發明的方法及其制備的體外檢測原發性Leber氏病相關的線粒體基因mtDNAT12338C突變試劑盒具有以下特點:
1.傳統上獲得原發性Leber氏病患者基因組DNA的方法是從血液中提取，每人大約需要3 5ml。這種采血方法給很多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區傳遞樣本時存在一定的風險和麻煩。本發明運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本(如一滴血)、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA。該方法不僅解決了傳統上從原發性Leber氏病患者血液中提取DNA的問題，減輕被檢者的痛苦；而且還解決了跨地區傳遞樣本的問題，血濾紙片、毛發以及口腔粘膜刮片(棉拭子)或唾液斑濾紙片等可以很容易的放在信封內，并可通過郵寄的方式跨地區傳遞。2.目前國內外有幾種線粒體相關的母系遺傳性疾病基因診斷方法，如直接測序法熒光定量PCR檢測方法、基因芯片檢測方法等，由于其自身的缺陷，如費時費力、操作繁瑣以及檢測費用偏高而不易在臨床進行推廣。與這些方法相比較，PCR-酶切技術則結合了特異性PCR技術及酶切技術兩者的優點，每份DNA樣本用特異性引物即引物F/R于PCR反應管中進行特異性PCR擴增，通過一次PCR-酶切便可在幾小時內同時檢出mtDNA T12338C突變。另外值得一提的是，本方法所用的引物均經過仔細設計。首先，正常和突變等位基因間不同的堿基在酶切過程中對特異性限制性內切酶形成的位點不同，因而大大提高了酶切的特異性；另外由正常對照和空白對照的產物可作為整個PCR反應的分子內控指標，從而避免假陰性結果的出現，提高檢測結果的穩定性。通過調整不同引物的濃度和比例以及對PCR反應條件進行優化，以確保結果的特異性和穩定性。3.應用本發明提供的試劑盒進行mtDNA T12338C突變檢測，成本較其他檢測方法更低；檢測流程簡便、快速，結果判讀直觀；對實驗設備及操作人員無特殊要求，適合在一般醫院、分子生物實驗室 開展，便于在全國范圍內特別是欠發達地區實行原發性Leber氏病相關的mtDNA T12338C突變的大規模篩查和預防性檢查。


圖1是本發明試劑盒結構示意圖。圖2是本發明的特異性巢式PCR引物示意圖。圖3是本發明的特異性巢式PCR擴增方案示意圖。圖4是攜帶T12338C突變原發性Leber氏病家系系譜圖。圖5是基因特異性巢式PCR擴增鑒定mtDNA T12338C的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。符號說明:
圖2和3中:F外為特異性巢式PCR第一次擴增的正向引物#外為特異性巢式PCR第一次擴增的反向引物，與F外配對使用；F內為特異性巢式PCR第二次擴增的正向引物，R內為特異性巢式PCR第二次擴增的反向引物，與F內配對使用；T12338C表示為線粒體DNA第12338位，野生型為T，發生基因突變后為C。圖4中:□為正常男性個體；〇為正常女性個體；■為發病男性個體；籲為發病女性個體；，為先證者；I為該家系的第一代成員；II為該家系的第二代成員；111為該家系的第三代成員。圖5中:Ml表示野生型位點檢測的PCR擴增產物的電泳圖(陰性對照者)；M2表示先證者攜帶T12 3 38C突變位點檢測的P C R擴增產物經酶切鑒定的電泳圖；M 3為攜帶T12338C突變的先證者的女兒；M4分別為未攜帶T12338C突變的先證者的丈夫，M6表示未攜帶T12338C突變位點檢測的PCR擴增產物發生酶切的電泳圖；M7陽性對照者電泳圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。實施例1 一種Leber病之線粒體T12338C檢測試劑盒
參見圖1，本發明提供的試劑盒，由置于盒體8內的DNA提取混合液1、擴增T12338C的PCR混合液2、針對T12338C設計的一對外引物3、針對T12338C設計的一對內引物4、限制性內切酶/ / I 5、是陽性對照6和陰性對照7構成。其中提取DNA提取混合液I主要由細胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；擴增T12338C的PCR混合液2試劑包括dNTP (脫氧單核苷酸)UOXPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，針對T12338C設計的一對外引物3包括外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQID NO:1)，外反向引物 R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO: 2);針對 T12338C 設計的一對內引物 4 包括內前向引物 F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA (SEQ ID NO:3)，內反向引物 R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA(SEQ ID NO:4);陽性對照6是不含有線粒體序列第12338位點發生T>C突變的酶切樣本，陰性對照7是含有線粒體序列第12338位點發生T>C突變的酶切樣本。在上述試劑盒中，在擴增T12338C的PCR混合液2中添加用于提高延伸反應特異性的少許二甲基亞砜(0.1-0.2 μ I)。實施例2攜帶線粒體基因T12338C突變的原發性Leber氏病家系的檢測
1.檢測樣本
選擇I個攜帶T12338C突變的原發性Leber氏病家系。其家系圖參見圖4。這個家系呈現母系遺傳，發病者均以視力損傷為唯一的臨床癥狀，但是家系中母系成員的視力損傷程度不等。這個家系總人數為18人，其中母系成員數為12人，患Leber氏病者有2人。2.基因組DNA的提取
分別獲取4名受檢者的樣本(包括采集I1-9,11 -10和家系外正常者的毛細血管一滴靜脈血濾紙片；111 -5為由于年齡較小采集帶毛囊的頭發)，將血濾紙片用干凈的剪刀剪成大小約lcm2的碎紙片放入1.5ml EP管(Eppendorf管)，加入900 μ I紅細胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉淀；帶毛囊的頭發樣本用70%乙醇洗帶毛囊的毛發I次，后再用蒸餾水沖洗毛發2次。在1.5ml EP管中分 別放入2 4根毛發，毛囊置于EP管底部，用干凈的剪刀剪去毛發高于EP管的部分。然后加入600 μ I細胞裂解液，混勻后再加入溶液I，使得蛋白酶K的工作濃度為20μ g/ml。充分混勻后55°C消化裂解，接著以鹽析法去除蛋白等雜質，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存備用。
3.引物設計
使用Primer 5.0軟件和01igo7.0軟件協助設計改良引物,根據已公開的人類線粒體基因劍橋參考序列(SEQ ID N0:5)進行設計，引物的設計方案(見圖3)如下:
針對mtDNA 12338位點，保證引物設計的特異性，我們設計巢式PCR兩對引物F外/R夕卜，F內/R內；它們長度、退火溫度相近便于實驗條件穩定，以增強特異性。由此設計出的4263 位點的巢式 PCR 引物為外前向引物 F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1),外反向引物 R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO: 2);內前向引物 F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAATAAMGTTA (SEQ ID NO:3)，內反向引物 R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA (SEQ ID NO:4)。參見圖2，在本發明的實施方案中，引物設計的指導思想是，針對mtDNA T12338C位點存在的位置相鄰近，擴增在一條片段上，故應設計3’末端與12338位點野生型T和12338位點突變型C相對應的上游引物；針對12338位點設計3’末端分別與12338位點野生型T和12338位點突變型C相對應的下游引物。本發明人針對設計的特殊的引物形成限制性酶切位點進行特異性PCR擴增(圖3)，mtDNA T12338C發生突變后使形成的酶切位點消失。酶切位點是由mtDNA T12338C突變形成的，其中的限制性內切酶為I，其位點處為序列表中的SEQ ID N0:3、4。用以上設計的引物，以相應的被檢測樣本的DNA為模板，通過PCR擴增后分別獲得明亮清晰的大小約221bp的恒定擴增帶，12338突變位點對應于擴增片段的第70位。

4.基因特異性巢式PCR擴增
根據上述設計的4條引物序列，通過人工合成(委托生物公司)獲得2對引物，以上述提取的被檢樣本基因組DNA為模板，進行基因特異性巢式PCR擴增和7%的聚丙烯酰胺凝膠電泳酶切鑒定。
表I基因特異性巢式PCR擴增反應體系(TAKAM公司產品)
權利要求
1.一種Leber病之線粒體T12338C檢測試劑盒，其特征在于，由置于盒體(8)內的DNA提取混合液(I)、擴增T12338C的PCR混合液(2)、針對T12338C設計的一對外引物(3)、針對T12338C設計的一對內引物(4)、限制性內切酶I (5 )、陽性對照(6 )和陰性對(7 )構成，其中提取DNA提取混合液(I)由細胞裂解液和溶液I組成；擴增T12338C的PCR混合液(2)試劑有脫氧單核苷酸、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和DNA聚合酶組成，針對T12338C設計的一對外引物(3)有外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG和外反向引物R:AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG，針對T12338C設計的一對內引物(4)有內前向引物F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAA TTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA 和內反向引物R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA ;陽性對照(6)是不含有線粒體序列第12338位點發生T>C突變的酶切樣本，陰性對照(7)是含有線粒體序列第12338位點發生T>C突變的酶切樣本，溶液I為蛋白酶K。
2.根據權利要求1所述的一種Leber病之線粒體T12338C檢測試劑盒，其特征在于，擴增T3866C的PCR混合液(2)中添加0.1-0.2 μ I 二甲基亞砜。
3.根據權利要求1或2所述的一種Leber病之線粒體T12338C檢測試劑盒在檢測與Leber氏病相關的線粒體基因ND5 T12338C突變中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，通過以下步驟實現: (1)基因組DNA的提取:用蛋白酶K消化裂解法，從血液標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA ； (2)特異性PCR擴增:使用Primer5.0軟件和Oligo7.0軟件根據SEQ ID N0:5所示的人類線粒體基因序列所設計的引物F#/R#、F#/I^是能擴增出包含上述原發性Leber氏病的線粒體突變位點的片段，F#/R#卜擴增出為線粒體DNA的核苷酸11929-12793，其序列為序列表中的SEQ ID N0:l、2 ;F /R肖擴增出為線粒體DNA的核苷酸12268-12488，其序列為序列表中的SEQ ID Ν0:3、4; (3)酶切鑒定:將上述PCR產物用限制性內切酶I對T12338C位點處進行酶切； (4)突變檢測:聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生T12338C突變。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟(I)所述從血標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，通過以下方法獲得: (1)血標本:取20 200μ I血標本或Icm2的血濾紙片放入1.5ml離心管，加入900 μ I紅細胞裂解緩沖液，20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH 7.6，室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉淀； (2)帶毛囊的毛發:用體積比70%乙醇洗帶毛囊的毛發I次，后再用蒸餾水沖洗毛發2次，在1.5ml離心管中分別放入2 4根毛發，毛囊置于離心管底部，用干凈的剪刀剪去毛發聞于尚心管的部分； (3)口腔粘膜刮片或唾液:收集唾液前，必須讓被收集者漱口，以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質，半小時內不要喝水、進食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，選擇如下方法收集唾液樣本:①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細胞，將0.1ml唾液直接吐進離心管內；②生理鹽水漱口，吐進離心管內，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的離心管中，反復吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復該過程一次用棉拭子反復刮拭面頰內壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入離心管中；④將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成大小約Icm2碎紙片置于離心管中； 然后用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，利用鹽析法去除蛋白雜質，異丙醇沉淀DNA，最后 用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存備用。
全文摘要
本發明提供一種Leber病之線粒體T12338C檢測試劑盒，由置于盒體內的DNA提取混合液、擴增T12338C的PCR混合液、針對T12338C設計的一對外引物和一對內引物、限制性內切酶PsiⅠ、陽性對照和陰性對照構成。本發明從少量的血液標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA，既解決傳統上從原發性Leber氏病患者血液中提取DNA的問題，減輕被檢者的痛苦，又解決了跨地區傳遞樣本的問題，提高酶切特異性，避免出現假陰性，提高檢測結果的穩定性。本發明是一種快速、簡便、準確、經濟的檢測試劑盒。可實行原發性Leber氏病相關的mtDNAT12338C突變的篩查和預防性檢查。
文檔編號C12Q1/68GK103173545SQ20131006933
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者冀延春, 管敏鑫, 蔣萍萍, 梁敏, 張娟娟, 徐靜 申請人:浙江大學