專利名稱：一種微生物轉化制備氧化白藜蘆醇的方法
技術領域：
本發明涉及微生物轉化技術領域,特別是一種利用黑曲霉(Aspergillus niger)轉化技術制備氧化白藜蘆醇的安全、高效、快速的方法。
背景技術：
氧化白藜蘆醇(Oxyresveratrol)是羥基化的白藜蘆醇結構類似物，較早的由北海道大學的S.Mongolsuk, Alexander Robertson, R.Towers等人在滇菠蘿蜜中發現,而后在?？浦参镏?，百合科以及麻藤科植物中也陸續出現了它的身影。雖然相較于白藜蘆醇它的自然資源顯得十分有限，但是它卓越的藥用醫療、食品保健價值好似一筆巨大的寶藏，促使大量研究者們的擠上探索這個寶藏的偉大航路。隨后在1998年以及2007年等研究報告中發現氧化白藜蘆醇是絡氨酸酶的抑制齊U，可作為高效的美白化妝品添加劑。2003年以及2011年，研究者們通過動物實驗發現氧化白藜蘆醇表現出比熟知的抗氧化劑衍生物以及抗壞血酸更有效的DNA保護作用，具備十分優良的抗氧化以及抗衰老作用(抗自由基)，表明氧化白藜蘆醇可作為抗衰老劑和核黃素穩定劑潛在利用價值。2004年、2006年以及2008年等研究中又發現氧化白藜蘆醇卓越的神經保護作用，或可開發成治療帕金森綜合癥的藥物以及預防老年癡呆以及中風等此類病癥發生的保健食品。2011年朱拉隆功大學通過小鼠實驗研究證明當運用氧化白藜蘆醇作為乳液主要的基礎成分時，可以治療皮膚單純皰疹病毒感染。氧化白藜蘆醇的生物活性遠不止這些，如近年來華工理工大學就以氧化白藜蘆醇具備有效治療及預防糖尿病及其并發癥的用途向國家知識產權局申請了一項發明專利，除此之外，氧化白藜蘆醇還具有抗癌、護肝、抗炎等諸多有利于人類健康的藥用效果。
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氧化白藜蘆醇(Oxyresveratrol)比桑皮苷A (mulberroside A)多兩個酌■輕基，是它的桑皮苷A的苷元。QIUE報道，桑皮苷A通過實驗小鼠代謝后生成的氧化白藜蘆醇，生物活性更強。同時，Jeong-Ha Kim 等在專利(Application# =20060216253, Class =424062000(USPTO))中報道，從桑白皮(桑樹根根皮)中提取分離桑皮苷A時，所得到的最終產物中檢測到了少量氧化白藜蘆醇。目前獲得氧化白藜蘆醇的主要方法主要是用乙醇浸提桑白皮，再用硅膠、凝膠、聚酰胺等反復柱層析。這些方法過程繁瑣，得率純度偏低，更重要的是它至提取分離得到了桑樹中已經存在的少量氧化白藜蘆醇，其含量較低。而桑白皮中的桑皮苷A含量遠遠高于氧化白藜蘆醇，造成了很大的生物能源浪費。西南大學徐立等人在專利(CN101591680)題名為氧化白藜蘆醇的提取方法中利用直接酶對桑皮(桑枝)提取，繼而對高含量的桑皮苷A進行了完全轉化，大大增加了其含量。但由于酶的價格昂貴、且不易獲得等缺陷，造成實際生產中的諸多不便。若通過安全易得的微生物方法轉化桑皮苷A，不但可以簡單、高效的快速提高提取物的收率，并且成本大大的降低，目前并無相關研究報道。發明的優點在于可大大提高植物中氧化白藜蘆醇的得率，轉化率為70、8%。相對于傳統的化學法或從植物中直接提取的方法具有以下優點:1、有害物質含量低，安全無毒副作用；2、可進行大規模的應用，不受季節環境等影響；3、生產操作簡便，產品得率高；4、成本低，反應條件溫和，環境友好。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用微生物方法轉化制備氧化白藜蘆醇的方法。主要通過微生物與桑枝粉末共同發酵方法將桑枝中高含量的桑皮苷A徹底轉化為氧化白藜蘆醇，從而提高氧化白藜蘆醇的得率。該微生物是黑曲霉菌(Aspergillus niger)。本發明制備氧化白藜蘆醇的微生物轉化方法，包括:
(1)、將黑曲霉菌(Aspergillus niger),進行常規培養活化，活化后的菌株做為生物催化劑；活化所用的斜面培養基為:馬鈴薯(PDA)斜面培養基:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂粉
1.5°Γ2%, pH自然。121°C高壓濕熱滅菌，2(Γ30分鐘，滅菌后冷卻，制成斜面、接種黑曲霉進行活化。28°C培養:Γ5天。(2)、取鮮桑枝或桑根的皮，粉碎至2(Γ40目，作為生物轉化底物，再將其添入發酵培養溶液；發酵培養的培養基為:桑枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。pH值為3飛。(3)、將(I)收集的菌體制成菌懸液，加入含(2)的底物的發酵溶液中并在一定條件下進行轉化反應，生成氧化白藜蘆醇；發酵培養條件為:250ml三角瓶裝液量5(Tl00ml，培養溫度為3(T45°C，搖床轉速為75 180r/min，接種量為:1% 3%，培養12 48小時。(4)、將( 3)的轉化液，用質量百分比濃度為609Γ80%的甲醇或者乙醇溶液進行超聲提取10飛0分鐘，再靜止或離心處理去除下層雜質，上清液回收溶劑，得到氧化白藜蘆醇粗品。(5)、根據氧化白藜蘆醇光不穩定性的特征，發酵過程中采取必要的避光的措施，減少氧化白藜蘆醇的損失。最優發酵培養條件為:250ml的三角瓶裝液量50ml、培養溫度為45°C，搖床轉速為150r/min，接種量為3%，轉化時間為18.5小時。在此方法下能有效的提高桑枝氧化白藜蘆醇的得率，其桑皮苷A轉化率達到95%以上。所得的轉化產物用高效液相法測定，其液相條件為:色譜柱:HyperSil BDS C18柱(4.6mmX 200mm, 5Mm);流速:lml/min ;柱溫為40°C ;流動相:1%甲酸水_乙腈，梯度洗脫程序為:0-20min，乙腈:甲酸水 5%: 95%，20_35min,乙腈:甲酸水一5%: 95% 20%: 80% ;檢測波長:320nm ;進樣量:20μ 。
具體實施例方式實施例1
將新鮮采取的桑枝利用中藥粉碎機打粉過20目篩得到過篩粉末。斜面培養:培養基為100ml，馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g，pH6，121 °C濕熱滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為黑曲霉(Aspergillus niger), 28°C培養4天，作為斜面培養基活化菌種。種子培養和發酵:培養基為枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。pH值為6.0，裝液量為250ml三角瓶裝液量100ml, 121 °C濕熱滅菌，作為發酵培養液。滅菌后冷卻接種斜面種子制成的菌懸液，接種量為l%，75rpm/min，30°C作為發酵條件。轉化液用60%甲醇超聲提取40分鐘后，離心去除沉淀，上清液過有機微孔濾膜后進HPLC，高效液相法在25小時時測得此次氧化白藜蘆醇的得率為4.9Pg/ml，算出最高轉化率為48%。實施例2
將新鮮采取的桑枝利用中藥粉碎機打粉過20目篩得到過篩粉末。斜面培養:培養基為100ml，馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g，pH6，121 °C濕熱滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為黑曲霉(Aspergillus niger), 28°C培養5天，作為斜面培養基活化菌種。種子培養和發酵:培養基為枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。pH值為5.0，裝液量為250ml三角瓶裝液量100ml, 121 °C濕熱滅菌，作為發酵培養液。滅菌后冷卻接種斜面種子制成的菌懸液，接種量為1%, 180rpm/min, 40°C作為發酵條件。轉化液用80%甲醇超聲提取30分鐘后，離心去除沉淀，上清液過有機微孔濾膜后進HPLC，高效液相法在28小時時測得此次氧化白藜蘆醇的得率為6.8Pg/ml，算出最高轉化率為66%
實施例3
將新鮮采取的桑枝利用中藥粉碎機打粉過20目篩得到過篩粉末。

斜面培養:培養基為100ml，馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g，pH6，121 °C濕熱滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為黑曲霉(Aspergillus niger), 28°C培養4天，作為斜面培養基活化菌種。種子培養和發酵:培養基為枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。？!1值為4.0，裝液量為250ml三角瓶裝液量50ml，121°C濕熱滅菌，作為發酵培養液。滅菌后冷卻接種斜面種子制成的菌懸液，接種量為1%，180rpm/min, 35°C作為發酵條件。整個過程發酵過程中遮光處理，提取過程中也盡量避光。轉化液用60%甲醇超聲提取40分鐘后，離心去除沉淀，上清液過有機微孔濾膜后進HPLC，高效液相法在22.5小時時測得此次氧化白藜蘆醇的得率為8.4Pg/ml，算出最高轉化率為82%
實施例4
將新鮮采取的桑枝利用中藥粉碎機打粉過20目篩得到過篩粉末。斜面培養:培養基為100ml，馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g，pH6，121 °C濕熱滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為黑曲霉(Aspergillus niger), 28°C培養4天，作為斜面培養基活化菌種。種子培養和發酵:培養基為枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。？!1值為3.0，裝液量為250ml三角瓶裝液量50ml，121°C濕熱滅菌，作為發酵培養液。滅菌后冷卻接種斜面種子制成的菌懸液，接種量為3%，180rpm/min, 45 °C作為發酵條件。整個過程發酵過程中遮光處理，提取過程中也盡量避光。
轉化液用60%甲醇超聲提取30分鐘后，離心去除沉淀，上清液過有機微孔濾膜后進HPLC，高效液相法在18.5小時時測得此次氧化白藜蘆醇的得率為lOPg/ml，算出最高轉化率為96%?！?br> 權利要求
1.一種微生物轉化制備氧化白藜蘆醇的方法，其特征包括: (1)將黑曲霉菌株SW-3301進行常規培養活化，活化后的菌株做為生物催化劑； (2)取鮮桑枝或桑根的皮，粉碎至2(Γ40目，作為生物轉化底物，再將其添入發酵培養溶液； (3)將(I)收集的菌體制成菌懸液，加入到步驟(2)含底物的發酵液中并在一定條件下進行轉化反應，生成氧化白藜蘆醇； (4)將步驟(3)的轉化液，用質量百分比濃度為609Γ80%的甲醇或者乙醇溶液進行超聲提取后，再靜止去除下層雜質，得到的上清液蒸發回收溶劑，得到氧化白藜蘆醇粗品。
2.如權利要求1所述的一種微生物轉化制備氧化白藜蘆醇的方法，其特征在于步驟(2)中發酵培養的培養基為:桑枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%，pH值為3 6。
3.如據權利要求1所述的一種微生物轉化制備氧化白藜蘆醇的方法，其特征在于步驟(3)的發酵培養條件為:250ml三角瓶裝液量5(Tl00ml，培養溫度為3(T45°C，搖床轉速為75 180r/min，接種量為:1% 3%，培養12 48小時。
4.如據權利要求1所述的一種微生物轉化制備氧化白藜蘆醇的方法，其特征在于步驟(3)的最優發酵培養條件為:250ml的三角瓶裝液量50ml、培養溫度為45°C，搖床轉速為150r/min，接種量為3%，轉化時間為18.5小時。
5.如據權利要求1所 述的一種微生物轉化制備氧化白藜蘆醇的方法，其特征在于根據氧化白藜蘆醇光不穩定性的特征，發酵過程中采取避光的措施，減少氧化白藜蘆醇的損失。
6.如據權利要求1所述的一種微生物轉化制備氧化白藜蘆醇的方法，其特征在于使用該方法能有效的提高桑枝氧化白藜蘆醇的得率，其桑皮苷A轉化率可達到95%以上。
全文摘要
本發明提供一種利用微生物方法轉化制備氧化白藜蘆醇的方法，將粉碎桑枝作為轉化底物投入發酵培養溶液中培養12~48小時，將得到的轉化液用質量百分比濃度為60%~80%的甲醇或者乙醇溶液進行超聲提取，再靜止或離心處理去除下層雜質沉淀，上清液回收溶劑，即得。此方法產物得率高，反應條件溫和，安全無毒且成本低，操作簡單易于生產。
文檔編號C12R1/685GK103194493SQ20131014740
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月25日 優先權日2013年4月25日
發明者李順祥, 虢小翊, 周晉 申請人:湖南中醫藥大學