水稻轉錄因子Os04g08740基因CDS序列的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及水稻轉錄因子Os04g08740基因CDS序列的應用，其是利用轉錄因子激活基序VP64與水稻轉錄因子Os04g08740融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基因轉化到農作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如增加水稻籽粒寬度。對于詳細闡明調控種子發育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產實踐中也具有重要意義。
【專利說明】水稻轉錄因子0s04g08740基因CDS序列的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及水稻轉錄因子0s04g08740基因⑶S序 列的應用。

【背景技術】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個重要的功能基因研究的模式植物。與其相關的遺傳學和分子 生物學研究一直倍受研究者的重視，轉錄水平的調控是基因表達調控的重要方式。當前水 稻增產的研究較依賴于有限的水稻種質資源，傳統的雜交育種優勢正在逐漸減弱，而水稻 轉基因技術有可能發掘水稻進一步增產的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚 珠。從分子生物學的角度來說，種子的發育和萌發是一個有次序的、選擇性的基因表達過 程。而轉錄因子在基因表達的精確調控中起到了關鍵性的作用。
[0004] 禾谷類作物的產量很大程度上取決于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性狀的基因調 控是重要的研究領域。近年來，已經通過基因克隆、QTL等技術手段揭示了至少8個基因在 控制粒型方面具有重要作用。SGl基因編碼一個功能未知的蛋白，主要在水稻根和發育的 穗中表達，該蛋白的過量表達出現短粒和矮化表型。SGl降低了對油菜素內酯BR的應答， 通過減少細胞增殖從而降低諸如種子、穗軸節間等器官的伸長。SGLl是一個類SGl蛋白， 具有與SGl類似的功能，通過RNAi下調SGl及其同源基因SGLl的表達，水稻粒長和穗軸的 節間較野生型變長（Nakagawa等，2012)。GS3位點是控制水稻粒重和粒長的主效QTL，同時 也是控制水稻粒寬和籽粒充實度的微效QTL(Fan,Xing等，2006 ;Mao,Sun等，2010)。PGLl 是一個非典型的不結合DNA的堿性螺旋-環-螺旋蛋白（bHLH)，過量表達PGLl增加了籽 粒長度和重量。APG是PGLl的拮抗性互作因子，兩者都定位在核內。PGL1/APG介導的籽粒 長度增加是由于內穎細胞長度增加引起的。APG和PGLl不影響已知籽粒長度調控基因GS3 和SRS3的表達。PGLl-APG代表了一個新的籽粒長度和重量調控途徑，APG是一個負向調節 子，其功能受到PGLl的抑制（Heang等，2012)。Mi3(t)基因，來源于秈型水稻Y34,該基因 能使粒長縮短35. 7%?47. 4%，千粒重降低45. 9%?62. 4%，它主要控制籽粒長度，產生小粒 (劉明偉等，2005)。張啟發等（YiboLi,ChuchuanFan,QIfaZhang,etal. (2011)Natural variationinGS5playsanimportantroleinregulatinggrainsizeandyieldin rice.NatureGennetics)研究發現GS5編碼一個調節籽粒大小的絲氨酸羧肽酶，是控制籽 粒大小的正調節因子，過表達GS5可使水稻籽粒明顯變大；轉錄因子在調控籽粒大小方面 起著非常重要的作用，0sWRKY78可以調節水稻莖的伸長和種子的發育，0sWRKY78突變體可 以使莖桿變矮化影響籽粒發育；螺旋-環-螺旋蛋白（bHLH)類轉錄因子能通過調控外稃和 內稃細胞的長度影響谷粒的大小。此外，控制水稻籽粒性狀的基因還有gGL7和gGL7-2。但 Orphan家族的基因在影響籽粒大小方面的研究尚未見報道?？傊?，控制水稻籽粒發育是一 個復雜過程，涉及到多基因多條途徑的協調控制，目前發現調控該性狀的基因不多，調控籽 粒發育的分子機理尚未闡明，因此，尋找控制籽粒性狀發育的基因和新的發掘手段對作物 改良并提高作物產量具有重要意義。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供水稻轉錄因子0s04g08740基因⑶S序列的應用。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明首先提供一種組成型水稻轉錄因子，即融合蛋白 (VP16)4-Linker-0s04g08740。
[0007] 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，將4個VP16功能域基序融合在一起 可構成一類增強子，增強轉錄因子的功能，從而在轉基因植株中出現更明顯的表型變化。上 述融合蛋白中涉及的（VP16)4，即VP64是由4個VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser為間隔 形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 4所示。
[0008] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39個柔性氨基酸串聯而成，其氨基酸序列如SEQ IDNo. 9所示，編碼該Linker的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。
[0009] 上述融合蛋白中涉及的0s04g08740為水稻轉錄因子0s04g08740,其氨基酸序列 如SEQIDNo. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻轉錄因子0s04g08740基因的⑶S序列為：SEQIDNo. 1所示的核苷酸 序列。
[0010] 本發明還提供編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因，以及在嚴格條件下，可與該 基因的核苷酸序列發生雜交的核苷酸序列。
[0011] 本發明還提供含有編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因的載體、工程菌及細胞 系。
[0012] 所述載體的構建方法如下：
[0013] (1)在植物轉錄因子數據庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s04g08740基因，根據其序列設計PCR擴增引物對，其為正向 引物F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGGTC TCAATTGTTTTGAAGGACTC-3' 。
[0014] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用上述引物F和R進行PCR， 獲得0s04g08740基因完整的CDS序列。
[0015] (3)將上述PCR產物克隆到pDONER克隆載體上，經測序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。
[0016] (4)以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN(圖6)左右邊界包含的序列為骨架 序列，通過體外重組，將ubi promoter-VP64-Gateway表達單兀、35S promoter-asRED表達 單元和35S promoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQ ID No. 5所示。
[0017] (5)通過LR反應將0s04g08740基因的CDS序列構建到其目的基因的5'端連有 VP64編碼基因的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉錄 因子VP64-Linker-0s04g08740 基因的表達載體ubi:VP64-0s04g08740,其全序列如SEQID No. 6所示。
[0018] 上述表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿 孔等常規生物技術方法導入植物細胞中（Weissbach，1998,MethodforPlantMolecular BiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第 411-463 頁；Geiserson和Corey，1998,Plant MolecularBiology,2ndEdition)。
[0019] 本發明還提供一種轉基因水稻植株的構建方法，具體為：采用農桿菌介導的方法， 將上述表達載體轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農桿菌的AAM培養液進行轉化，轉化 后的材料經過共培養-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水稻植株。
[0020] 本發明還提供編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因在改良水稻籽粒性狀(例如增 加水稻粒寬及千粒重）中的應用。
[0021] 本發明還提供了用于擴增水稻轉錄因子0s04g08740基因⑶S序列的引物對，包括 正向引物F: 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物R: 5'-CAAGAAAGCTG GGTCTCAATTGTTTTGAAGGACTC-3' 。
[0022] 本發明進一步提供水稻轉錄因子0s04g08740基因⑶S序列在調控水稻籽粒性狀 中的應用。利用轉錄因子激活基序VP64(SEQIDNo. 10)與水稻轉錄因子0s04g08740融合 構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基因轉化到農作物如水稻中， 從而改良轉基因水稻籽粒的性狀。
[0023] 前述的應用，是將水稻轉錄因子0s04g08740基因的⑶S序列構建到轉錄因子激活 基序VP64編碼基因（SEQIDNo. 4)的下游，轉化水稻，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀。優 選將水稻轉錄因子0s04g08740基因的CDS序列通過Gateway系統轉錄因子激活基序VP64 編碼基因的下游。
[0024] 本發明首次利用轉錄因子激活基序VP64 (即4個轉錄因子激活基序VP16)與水稻 轉錄因子0s04g08740融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基 因轉化到農作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如水稻籽粒寬度增加。對于詳細闡明 調控種子發育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的粒型，因此 在生產實踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為本發明實施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜。
[0026] 圖2為本發明實施例1中ubi:VP64-0s04g08740載體圖譜。
[0027] 圖3為本發明實施例3中PCR檢測VP64-0s04g08740轉基因陽性株系，其中WT為 野生型水稻 'kitaake'，V0218H-18、V0218H-20 為VP64-0s04g08740 轉基因水稻株系。
[0028] 圖4為本發明實施例4中轉基因水稻籽粒性狀的表型寬度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，V0218H-18、V0218H-20 為VP64-0s04g08740 轉基因水稻株系。
[0029] 圖5為本發明實施例4中轉基因水稻籽粒性狀的數據統計分析結果；其中WT為野 生型水稻 'kitaake'，V0218H-18、V0218H-20 為VP64-0s04g08740 轉基因水稻株系。
[0030] 圖6為本發明實施例1中pCambial301_UbiN載體圖譜。

【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0032] 實施例1
[0033] 0s04g08740基因CDS序列的獲得及植物表達載體的構建
[0034] I0s04g08740基因CDS序列的獲得
[0035] 在植物轉錄因子數據庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s04g08740基因，根據其序列設計PCR擴增引物，正向引物 F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCTCAA TTGTTTTGAAGGACTC-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用引物F和R進 行PCR，獲得0s04g08740基因完整的CDS序列（如SEQIDNo. 1所示)。
[0036] 2植物表達載體的構建
[0037] 將水稻轉錄因子0s04g08740基因的CDS序列通過Gateway系統構建到4個轉錄 因子激活基序VP16編碼基因（如SEQIDNo. 4所示）的下游。
[0038] 2. 1將上述PCR產物克隆到pDONER克隆載體上
[0039] 按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。此過程中包含兩輪 PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptorattB接頭的基因引物（F和R)，而第二輪的 模板用第一輪的PCR產物，并且引物用完整的adaptorattB引物（attB5'adaptor: 5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3'adaptor:5'-GTGGGGACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGGTC-3'）。將PCR產物克隆到pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上，經測序鑒 定得到與目的基因完全相同的序列。
[0040] 2. 2植物表達載體的構建
[0041] 以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN(圖6)左右邊界包含的序列為骨架序列， 通過體外重組，將ubipromoter-VP64-Gateway表達單兀、35Spromoter-asRED表達單兀和 35Spromoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQID No. 5所示，載體圖譜見圖1。
[0042] 表達載體nVP64-hyg_asRED含有Gateway重組系統，pDONR帶有目的基因的質粒 作為入門載體（Enteryvector),通過LR反應可完成目的基因表達載體的構建。
[0043] 通過LR反應將0s05g27980基因的CDS序列構建到其目的基因的5'端連有VP64 編碼基因的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉錄因 子VP64-Linker-0s05g27980 基因的表達載體ubi:VP64-0s05g27980,其全序列如SEQID No. 6所示，載體圖譜見圖2。
[0044] LR反應體系如下：
[0045] 表達載體 1 μ? ( 30-50ng ) 入門載體（pDONR-gene ) 1 μ? ( 30-5Ong ) LR Clonase Enzyme Mix Ιμ? ddH20 2μ1 總體積5μ1
[0046]于25°C反應過夜。用反應體系轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆。
[0047] 實施例2轉基因水稻植株的獲得
[0048] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經消毒 之后接種到誘導培養基上進行誘導培養。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農桿菌介導法將ubi:VP64-0s04g08740轉入水稻愈傷組織中，用含有100μM的 乙酰丁香酮和OD值為0. 7的農桿菌的AAM培養液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織置 于共培養基上進行共培養，25°C暗培養3d后置于篩選培養基上培養約30d，每IOd繼代一 次。然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠 色小苗的抗性愈傷轉移到生根培養基上生根，待約7d長出發達根系后煉苗，并計算轉化所 獲轉基因苗數。煉苗7d后轉移至大田生長。獲得20株轉基因苗。
[0049] 本實施例中涉及的培養基配方如下：
[0050] 誘導培養基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0051] 共培養基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 2后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS(乙酰丁香酮）100?200μg/mL。
[0052] 篩選培養基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司）。
[0053] 分化培養基：MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2.Omg/LKinetin(激動素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L鹿糖，以水配制， 調pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0054] 實施例3轉基因陽性株系的鑒定
[0055] 為檢測實施例2獲得的VP64-0s04g08740轉基因水稻株系中ubi: VP64-0s04g08740基因在T2代轉基因水稻（V0218H-18、V0218H-20)中的過表達情況，本實 施例在載體與目的基因接頭處設計引物（正向引物：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC TTC-3' 和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）進行PCR檢測，得到了明 顯的特異性條帶。由圖3可見，擴增出的條帶大小在2000bp以上，且引物是在載體與目的 基因接頭處設計的，擴增出的片段大小與目的基因（2292bp)基本一致。因此可以說明，實 施例2獲得的轉基因水稻株系V0218H-18、V0218H-20中含有VP64-0s04g08740融合基因。
[0056] 實施例4轉基因水稻表型分析和考種分析
[0057] 將實施例2獲得的轉基因水稻株系V0218H-18、V0218H-20和野生型水稻種子進行 比較，從表型上可以明顯的看出，發現轉基因材料的籽粒明顯變寬（圖4)?？挤N數據分析表 明（圖5)，本發明獲得的VP64-0s04g08740轉基因水稻籽粒的寬顯著大于野生型水稻籽粒。
[0058] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1. 一種組成型水稻轉錄因子，其特征在于，其為融合蛋白（VP16)4-Linker-0s04g08740 ； 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4個VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser為間隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 個柔性氨基酸串聯而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s04g08740為水稻轉錄因子 0s04g08740,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個 氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權利要求1所述組成型水稻轉錄因子的基因。
3. 含有權利要求2所述基因的載體。
4. 含有權利要求2所述基因的工程菌。
5. -種轉基因水稻植株的構建方法，其特征在于，采用農桿菌介導的方法，將權利要求 3所述的載體轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農桿菌的AAM培養液進行轉化，轉化后的 材料經過共培養-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水稻植株。
6. 權利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應用。
7. 用于擴增水稻轉錄因子0s04g08740基因⑶S序列的引物對，其特征在于，包括正向 引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGCCACCGATCCCATCT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC TCAATTGTTTTGAAGGACTC-3,； 其中，水稻轉錄因子0s04g08740基因的⑶S序列為： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻轉錄因子0s04g08740基因CDS序列在調控水稻籽粒性狀中的應用。
9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，其是利用轉錄因子激活基序VP64與水稻 轉錄因子0s04g08740融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基 因轉化水稻，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉錄因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ IDNo. 10所示。
10. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s04g08740基因 的⑶S序列通過Gateway系統構建到轉錄因子激活基序VP64編碼基因的下游，轉化水稻， 從而改良轉基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉錄因子激活基序VP64編碼基因的核苷酸序列如SEQID No. 4所示。
【文檔編號】C12N1/21GK104341528SQ201310347536
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】劉斌, 張傳玉, 李宏宇, 趙濤, 劉軍, 林辰濤 申請人:中國農業科學院作物科學研究所