具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸的制作方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸，具體的涉及具有增強(qiáng)分解纖維素活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離核酸。本發(fā)明還涉及包含所述核酸的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用所述多肽的方法?！緦?zhuān)利說(shuō)明】具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年02月04日，申請(qǐng)?zhí)枮?00580011917.0(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2005/003802)，發(fā)明名稱(chēng)為“具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。[0002]關(guān)于受到聯(lián)邦政府資助的研究與開(kāi)發(fā)的發(fā)明權(quán)利的聲明[0003]本發(fā)明是在受到政府資助的由能源部簽訂的主要合同DE-AC36-98G010337的NREL轉(zhuǎn)包合同N0.ZC0-30017-02下做出的。政府擁有本發(fā)明的一些權(quán)利。[0004]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域[0005]本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)分解纖維素活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用所述多肽的方法。[0006]相關(guān)領(lǐng)域的描述[0007]纖維素是單糖葡萄糖通過(guò)β-1,4-連接鍵共價(jià)鍵合的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在任意位置消化纖維素聚合物，使其易受纖維二糖水解酶的攻擊。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的水溶性β_1，4-連接二聚體。葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。[0008]將纖維素原料轉(zhuǎn)變成乙醇具有如下優(yōu)點(diǎn)，即易于獲得大量原料、避免燃燒或填埋物質(zhì)、以及乙醇燃料的清潔性?，F(xiàn)在認(rèn)為木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物、和城市固體廢物是生產(chǎn)乙醇的原料。這些物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)變成葡萄糖，就容易通過(guò)酵母將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。[0009]在本領(lǐng)域中提高纖維素原料的轉(zhuǎn)化將是有利的。[0010]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有增強(qiáng)分解纖維素活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離核酸序列以提高纖維素原料的轉(zhuǎn)化。[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明涉及選自下列的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的分離多肽:[0013](a)具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少70%的同一性；[0014](b)由如下核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在中等嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii),(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交；和[0015](c)在SEQIDNO:2第23至250位氨基酸中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守缺失、插入、和/或替代的變體。[0016]本發(fā)明還涉及選自下列的編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的分離多核苷酸:[0017](a)編碼具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，該氨基酸序列與SEQIDN0:2第23至250位氨基酸具有至少70%的同一性；[0018](b)與SEQIDNO:1第67至796位核苷酸具有至少70%同一性的多核苷酸；和[0019](c)在至少中等嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交的多核苷酸。[0020]本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、和重組宿主細(xì)胞。[0021]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)這些具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含如下核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；并(b)回收所述多肽。[0022]本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中所述基因可操作連接由SEQIDNO:1第I至66位核苷酸組成的編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄卸允峭庠吹?。[0023]本發(fā)明還涉及降解或者轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括:在存在有效量的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)，用有效量的分解纖維素的蛋白質(zhì)處理纖維素材料，其中與不存在該具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)相比，該具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解。[0024]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的方法，包括:[0025](a)在存在有效量的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)，用有效量的分解纖維素的蛋白質(zhì)糖化纖維素材料，其中與不存在該具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)相比，該具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解；[0026](b)用一種或多種發(fā)酵微生物對(duì)步驟(a)的已糖化纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵；并[0027](C)由發(fā)酵回收有機(jī)物質(zhì)。[0028]附圖簡(jiǎn)述[0029]圖1顯示了橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的增強(qiáng)分解纖維素活性的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:1和2)。預(yù)測(cè)的內(nèi)含子以斜體表示。預(yù)測(cè)的信號(hào)肽(SignalP)標(biāo)以下劃線(xiàn)。編碼序列為799bp，包括終止密碼子且間含一個(gè)56bp的內(nèi)含子。預(yù)測(cè)的成熟多肽含有228個(gè)氨基酸。[0030]圖2顯示了pAILol的限制性圖譜。[0031]圖3顯示了pBANelO的限制性圖譜。[0032]圖4顯示了pAILo2的限制性圖譜。[0033]圖5顯示了pDZA2的限制性圖譜。[0034]定義[0035]增強(qiáng)分解纖維素活性(cellulolyticenhancingactivity):術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)分解纖維素活性”在本文中定義為這樣的生物活性，其促進(jìn)具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)水解纖維素材料一。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，增強(qiáng)分解纖維素活性是通過(guò)在如下條件下測(cè)量分解纖維素的蛋白質(zhì)水解纖維素材料產(chǎn)生的還原糖的增量而測(cè)定的:在存在和不存在0.01-2.5mg增強(qiáng)分解纖維素活性/gPCS中的纖維素時(shí)，2.5mg分解纖維素的蛋白質(zhì)/gPCS于50°C保溫5_7天，與用沒(méi)有增強(qiáng)分解纖維素活性的等量總蛋白質(zhì)加載(5.01-7.5mg分解纖維素的蛋白質(zhì)/gPCS中的纖維素)進(jìn)行的對(duì)照水解進(jìn)行比較。在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用從NovozymesA/S(Bagsvaerd，丹麥)獲得的、由表達(dá)米曲霉(Aspergillusoryzae)β_葡糖苷酶的瑞氏木霉(Trichodrmareesei)發(fā)酵得到的、下稱(chēng)Tr/AoBG(W002/095014)的纖維素酶制備物的纖維素酶蛋白質(zhì)加載作為分解纖維素活性的來(lái)源。[0036]本發(fā)明的多肽具有由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸所示氨基酸序列組成的多肽的至少20%、優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、且甚至最優(yōu)選至少100%的增強(qiáng)分解纖維素活性。[0037]纖維素材料(cellulosicmaterial):術(shù)語(yǔ)“纖維素材料”在本文中定義為任何含有纖維素的材料。通常在例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸或者樹(shù)的葉、枝、和木質(zhì)發(fā)現(xiàn)有纖維素。纖維素材料還可以是，但不限于，草本植物材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙漿和造紙廠(chǎng)殘余物。應(yīng)當(dāng)理解本文的纖維素可以是木質(zhì)纖維素的形式，即在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素、和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。[0038]在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是稻草。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是紙和紙漿加工廢料。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是木本或草本植物。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是甘蔗渣。[0039]可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來(lái)利用纖維素材料，進(jìn)行或者可進(jìn)行預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理技術(shù)可包括各種類(lèi)型的碾磨、照射、蒸/蒸汽噴發(fā)(steamexplosion)、和濕熱分解作用(hydrothermolysis);化學(xué)預(yù)處理技術(shù)可包括用稀酸、堿、有機(jī)溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳、和PH控制的濕熱分解作用；及生物預(yù)處理技術(shù)可包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見(jiàn)例如Hsu,T-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,在《HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization))中，Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.和Singh,A.,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.App1.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,在《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel,M.E.、Baker,J.0.和Overend,R.P.編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,chapter15；Gong,C.S.、Cao,N.J.、Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)),Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson,L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；及Vallander,L.和Eriksson,K.-E.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0040]纖維素分解活性:術(shù)語(yǔ)“纖維素分解活性”在本文中定義為水解纖維素材料的生物學(xué)活性。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，纖維素分解活性是通過(guò)在如下條件下測(cè)量分解纖維素的混合物水解纖維素材料的增量而測(cè)定的=1-1Omg分解纖維素的蛋白質(zhì)/gPCS中的纖維素于50°C保溫5-7天，與未添加分解纖維素的蛋白質(zhì)的對(duì)照水解進(jìn)行比較。在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用從NovozymesA/S(BagSV$rd，丹麥)獲得的、由表達(dá)米曲霉β-葡糖苷酶的瑞氏木霉發(fā)酵得到的、下稱(chēng)Tr/AoBG(W002/095014)的載有纖維素酶蛋白質(zhì)的纖維素酶制備物作為分解纖維素活性的來(lái)源。[0041]經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米秸桿:術(shù)語(yǔ)“經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米秸桿”或“PCS”在本文中定義為通過(guò)用加熱和稀酸處理玉米秸桿得到的纖維素材料。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，PCS是通過(guò)實(shí)施例9描述的方法或其改變時(shí)間、溫度和酸量的變體方法制備的。[0042]糖苷水解酶家族61(family61glycosidehydrolase):術(shù)語(yǔ)“糖苷水解酶61家族”或“GH61家族”在本文中定義為根據(jù)B.Henrissat,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316及HenrissatB.和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696歸入糖苷水解酶61家族的多肽。目前，Henrissat將GH61家族列入未分類(lèi)的,指示屬于這個(gè)家族的多肽的某些性質(zhì),諸如機(jī)制、催化性親核體/堿、催化性質(zhì)子供體、和三維結(jié)構(gòu)是未知的。[0043]分離的多肽:術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”在用于本文時(shí)指根據(jù)SDS-PAGE的測(cè)定，至少20%純、優(yōu)選至少40%純、更優(yōu)選至少60%純、還更優(yōu)選至少80%純、最優(yōu)選至少90%純、且甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽。[0044]基本上純的多肽(substantiallypurepolypeptide):術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”在本文中指以重量計(jì)含有至多10%、優(yōu)選至多8%、更優(yōu)選至多6%、更優(yōu)選至多5%、更優(yōu)選至多4%、更優(yōu)選至多3%、甚至更優(yōu)選至多2%、最優(yōu)選至多1%、且甚至最優(yōu)選至多0.5%與該多肽天然相伴隨的其它多肽物質(zhì)的多肽制備物。因此，優(yōu)選的是，基本上純的多肽以重量計(jì)制備物中存在的全部多肽物質(zhì)是至少92%純的、優(yōu)選至少94%純的、更優(yōu)選至少95%純的、更優(yōu)選至少96%純的、更優(yōu)選至少96%的純的、更優(yōu)選至少97%純的、更優(yōu)選至少98%純的、甚至更優(yōu)選至少99%純的、最優(yōu)選至少99.5%純的、且甚至最優(yōu)選100%純的。[0045]本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選的是多肽是“本質(zhì)上(essentially)純的形式”，即多肽制備物本質(zhì)上不含與該多肽天然相伴隨的其它多肽物質(zhì)。例如，這可通過(guò)采用眾所周知的重組方法或采用經(jīng)典的純化方法制備多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0046]在本文中，術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”與術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”和“分離形式的多肽”含義相同。[0047]同一性(identity):本文用參數(shù)“同一性”來(lái)描述兩種氨基酸序列之間或兩種核苷酸序列之間的相關(guān)性。[0048]對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，兩種氨基酸序列之間的同一性程度可使用ParacelBioViewWorkbench軟件(Paracel,Pasadena,CA)及blosum62矩陣通過(guò)blastp算法(Higgins,1989，CAB10S5:151-153)來(lái)測(cè)定。采用缺口罰分，存在:10和延伸:10，作為配對(duì)比對(duì)(pairwisealignment)參數(shù)。[0049]對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，兩種核苷酸序列之間的同一性程度使用LASERGENE?MEGALIGN?軟件(DNASTAR公司，Madison,WI)及同一性表和后面的多重比對(duì)參數(shù)通過(guò)Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726-730)來(lái)測(cè)定:缺口罰分10和缺口長(zhǎng)度罰分10。配對(duì)比對(duì)參數(shù):Ktuple=3，缺口罰分=3，和窗口(windows)=20。[0050]多肽片段:術(shù)語(yǔ)“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO:2第23至250位氨基酸或其同源序列的氨基和/或羧基末端刪除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽，其中所述片段具有增強(qiáng)分解纖維素活性。優(yōu)選的是，SEQIDNO:2第23至250位氨基酸的片段含有至少175個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少190個(gè)氨基酸殘基、且最優(yōu)選至少205個(gè)氨基酸殘基。[0051]子序列:術(shù)語(yǔ)“子序列”在本文中定義為由SEQIDNO:1第67至796位核苷酸的5’和/或3’末端刪除了一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列，其中子序列編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽片段。優(yōu)選的是，SEQIDNO:1第67至796位核苷酸的子序列含有至少525個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少570個(gè)核苷酸、且最優(yōu)選至少615個(gè)核苷酸。[0052]等位變體:術(shù)語(yǔ)“等位變體”在本文中指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或多種可選形式中的任一種。等位變異由突變天然引起，并可導(dǎo)致種群內(nèi)多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?所編碼多肽沒(méi)有變化)，或者可編碼氨基酸序列改變的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。[0053]分離的多核苷酸:術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”在用于本文時(shí)指根據(jù)瓊脂糖電泳的測(cè)定，至少20%純的、優(yōu)選至少40%純的、更優(yōu)選至少60%純的、甚至更優(yōu)選至少80%純的、最優(yōu)選至少90%純的、且甚至最優(yōu)選至少95%純的多核苷酸。[0054]基本上純的多核苷酸:術(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”在用于本文時(shí)指不含其它外來(lái)或不需要的核苷酸且以適于在基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)內(nèi)使用的形式存在的多核苷酸制備物。因此，基本上純的多核苷酸以重量計(jì)含有至多10%、優(yōu)選至多8%、更優(yōu)選至多6%、更優(yōu)選至多5%、更優(yōu)選至多4%、更優(yōu)選至多3%、甚至更優(yōu)選至多2%、最優(yōu)選至多1%、且甚至最優(yōu)選至多0.5%與該多核苷酸天然相伴隨的其它多核苷酸物質(zhì)。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，諸如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選的是，基本上純的多核苷酸以重量計(jì)是至少90%純的、優(yōu)選至少92%純的、更優(yōu)選至少94%純的、更優(yōu)選至少95%純的、更優(yōu)選至少96%純的、更優(yōu)選至少97%純的、甚至更優(yōu)選至少98%純的、最優(yōu)選至少99%純的、且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。優(yōu)選的是，本發(fā)明的多核苷酸是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選的是，本文公開(kāi)的多核苷酸是“本質(zhì)上純的形式”，即多核苷酸制備物本質(zhì)上不含與該多核苷酸天然相伴隨的其它多核苷酸物質(zhì)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”與術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”含義相同。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源或其任意組合。[0055]cDNA:術(shù)語(yǔ)“cDNA”在本文中定義為可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄由真核細(xì)胞獲得的成熟的、經(jīng)過(guò)剪接的mRNA分子而制備的DNA分子。cDNA缺乏通常在相應(yīng)基因組DNA中存在的內(nèi)含子序列。最初的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，它在成為成熟的、經(jīng)過(guò)剪接的mRNA之前要經(jīng)過(guò)一系列加工步驟。這些步驟包括通過(guò)稱(chēng)為剪接的過(guò)程除去內(nèi)含子序列。因此，由mRNA衍生的cDNA缺乏任何內(nèi)含子序列。[0056]核酸構(gòu)建體:術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”在用于本文時(shí)指單鏈或雙鏈的核酸分子，它是由天然存在的基因分離的，或是經(jīng)過(guò)修飾而以自然界中不存在的方式含有核酸區(qū)段。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明編碼序列所需要的控制序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”含義相同。[0057]控制序列:術(shù)語(yǔ)“控制序列”在本文中定義為包括對(duì)表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸所必需的或有利的所有成分。每種控制序列對(duì)編碼多肽的核苷酸序列來(lái)說(shuō)可以是天然的或外來(lái)的，或者每種控制序列相對(duì)彼此也可以是天然的或外來(lái)的。這些控制序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽(propeptide)序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。為了引入特異的限制性位點(diǎn)以便于控制序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)連接，控制序列可以帶有接頭(linkers)。[0058]可操作連接:術(shù)語(yǔ)“可操作連接”在本文中指這樣一種構(gòu)造，其中控制序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得控制序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。[0059]編碼序列:在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”意指直接規(guī)定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界一般由開(kāi)放讀碼框確定，它通常起始于A(yíng)TG起始密碼子或備選起始密碼子諸如GTG和TTG，并終止于終止密碼子諸如TAA、TAG和TGA。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。[0060]表達(dá):術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括多肽產(chǎn)生涉及的所有步驟，包括但不限于:轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。[0061]表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”在本文中定義為如下線(xiàn)狀或環(huán)狀DNA分子，它包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，且其與有助于其表達(dá)的其它核苷酸可操作連接。[0062]宿主細(xì)胞:術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”在用于本文時(shí)包括易于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、等等的任何細(xì)胞類(lèi)型。[0063]修飾:術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文中意指對(duì)包含SEQIDNO:2第23至250位氨基酸或其同源序列或由其組成的多肽的任何化學(xué)修飾以及對(duì)編碼該多肽的DNA的基因操作。修飾可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、刪除和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈的替換。[0064]人工變體:在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人工變體”意指具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽，它是由表達(dá)經(jīng)修飾的核苷酸序列SEQIDNO:1或其同源序列或其成熟編碼區(qū)的生物體產(chǎn)生的。經(jīng)修飾的核苷酸序列可通過(guò)人工干預(yù)對(duì)SEQIDNO:1中所公開(kāi)的核苷酸序列或其同源序列或其成熟編碼區(qū)進(jìn)行修飾來(lái)獲得。[0065]發(fā)明詳述[0066]具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽[0067]在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有如下氨基酸序列的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的分離多肽，該氨基酸序列與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸(即成熟多肽)具有至少70%、優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、且甚至最優(yōu)選至少97%、98%或99%的同一性程度(下文的“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，同源多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸相差10個(gè)氨基酸、優(yōu)選5個(gè)氨基酸、更優(yōu)選4個(gè)氨基酸、甚至更優(yōu)選3個(gè)氨基酸、最優(yōu)選2個(gè)氨基酸、且甚至最優(yōu)選I個(gè)氨基酸。[0068]本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含氨基酸序列SEQIDNO:2或其等位變體；或其具有增強(qiáng)分解纖維素活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含氨基酸序列SEQIDN0:2。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2第23至250位氨基酸或其等位變體；或其具有增強(qiáng)分解纖維素活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2第23至250位氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽由氨基酸序列SEQIDN0:2或其等位變體；或其具有增強(qiáng)分解纖維素活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽由氨基酸序列SEQIDN0:2組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸或其等位變體；或其具有增強(qiáng)分解纖維素活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸組成。[0069]在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及由如下多核苷酸編碼的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的分離多肽，該多核苷酸在很低嚴(yán)緊條件、優(yōu)選低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中等-高嚴(yán)緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊度條件、且最優(yōu)選很高嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸；(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列⑴或(ii)的子序列，或(iv),(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交(J.Sambrook、E.F.Fritsch和Τ.Maniatus,1989,《MolecularCloning,ALaboratoryManual》，第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的子序列含有至少100個(gè)連續(xù)核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的核苷酸。另外，子序列可編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽片段。[0070]根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，可使用核苷酸序列SEQIDNO:1或其子序列以及氨基酸序列SEQIDNO:2或其片段來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針，用于從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的DNA。具體而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，可將這些探針用于與目的屬或種的基因組或cDNA進(jìn)行雜交，從而鑒定和分離其中的相應(yīng)基因。這些探針可以比完整序列短得多，但是長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)是至少14個(gè)、優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、且最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，優(yōu)選的是，核酸探針的長(zhǎng)度是至少100個(gè)核苷酸。例如，核酸探針的長(zhǎng)度可以是至少200個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸、或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸?？墒褂蒙踔粮L(zhǎng)的探針，例如長(zhǎng)度是至少550核苷酸、至少優(yōu)選至少600個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少650個(gè)核苷酸、或最優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針都可使用。通常將探針進(jìn)行標(biāo)記，用于檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如用32P、3H、35S、生物素、或親和素)。本發(fā)明涵蓋這些探針。[0071]因此，可從這樣的其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選與上述探針發(fā)生雜交且編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的DNA。來(lái)自這樣的其它生物體的基因組或其它DNA可通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)來(lái)分離?？蓪?lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖維素或其它適宜載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其子序列同源的克隆或DNA,將載體材料用于Southern印跡。[0072]對(duì)本發(fā)明而言，雜交是指在很低至很高的嚴(yán)緊條件下將核苷酸序列與經(jīng)標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，其中核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1所示核苷酸序列、SEQIDNO:1所含cDNA序列、其互補(bǔ)鏈、或其子序列。在這些條件下與核酸探針發(fā)生雜交的分子可用X射線(xiàn)膠片檢測(cè)。[0073]在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼多肽SEQIDNO:2或其子序列的核酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PDZA2-7中的核酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中，其中所述核酸序列編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PDZA2-7中的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。[0074]對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針來(lái)說(shuō)，很低至很高的嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，于42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200μg/ml經(jīng)剪切且經(jīng)變性的鮭精DNA、和用于很低和低嚴(yán)謹(jǐn)度的25%甲酰胺、用于中等和中等-高嚴(yán)謹(jǐn)度的35%甲酰胺、或用于高和很高嚴(yán)謹(jǐn)度的50%甲酰胺中進(jìn)行最佳12-24小時(shí)的預(yù)雜交和雜交。[0075]對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針來(lái)說(shuō)，最后優(yōu)選于至少45°C(很低嚴(yán)謹(jǐn)度)、更優(yōu)選于至少50°C(低嚴(yán)謹(jǐn)度)、更優(yōu)選于至少55°C(中等嚴(yán)謹(jǐn)度)、更優(yōu)選于至少60°C(中等-高嚴(yán)謹(jǐn)度)、甚至更優(yōu)選于至少65°C(高嚴(yán)謹(jǐn)度)、且最優(yōu)選于至少70°C(很高嚴(yán)謹(jǐn)度)將載體材料用2XSSC、0.2%SDS清洗3次，每次15分鐘。[0076]對(duì)于長(zhǎng)度為大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針來(lái)說(shuō)，嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，于比根據(jù)Bolton和McCarthy(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)的計(jì)算方法計(jì)算得到的Tm值低大約5°C至大約10°C的溫度，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClρΗ7.6、6mMEDTA、0.5%NP_40、IXDenhardt氏溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0.1mMATPjP0.2mg/ml酵母RNA中進(jìn)行最佳12至24小時(shí)的預(yù)雜交、雜交、和雜交后清洗。[0077]對(duì)于長(zhǎng)度為大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針來(lái)說(shuō)，于比Tm計(jì)算值低大約5°C至10°C的溫度將載體材料用6XSCC加0.1%SDS清洗I次15分鐘，然后用6XSSC清洗兩次，每次15分鐘。[0078]在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含SEQIDNO:2或其同源序列或其成熟多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代、刪除、和/或插入的人工變體。優(yōu)選的是，氨基酸改變的性質(zhì)較小，也就是說(shuō)不會(huì)明顯影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基酸替代；一般是I個(gè)至大約30個(gè)氨基酸的小段刪除；小段氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端的甲硫氨酸殘基；可達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小段接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或另一功能而易于純化的小段延伸，諸如多組氨酸序列段、抗原性表位、或結(jié)合域。[0079]保守取代的例子在堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)各組內(nèi)。通常不改變特異活性的氨基酸替代是本領(lǐng)域已知的，例如H.Neurath和R.L.Hill在《TheProteins》中所述(1979,AcademicPress,NewYork)。最常發(fā)生的替代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。[0080]除20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，也可用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(諸如4-羥基脯氨酸、6-N-甲基賴(lài)氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸、和α-甲基絲氨酸)來(lái)替代野生型多肽的氨基酸殘基?？捎糜邢迶?shù)目的非保守氨基酸、并非由遺傳密碼編碼的氨基酸、和非天然氨基酸來(lái)替代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后受到修飾，和/或在它們的側(cè)鏈上具有與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。可化學(xué)合成非天然氨基酸，優(yōu)選的是可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)，包括哌啶酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。[0081]或者，氨基酸改變的本質(zhì)是改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基酸改變可提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最佳PH等等。[0082]可根據(jù)本領(lǐng)域已知程序來(lái)確定親本多肽中的關(guān)鍵氨基酸，諸如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(alanine-scanningmutagenesis)(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)。在后一種技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基處引入單一的丙氨酸突變，并對(duì)得到的突變分子測(cè)試生物學(xué)活性(即增強(qiáng)分解纖維素活性)以鑒定對(duì)分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。也可參見(jiàn)Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。也可結(jié)合假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變，通過(guò)諸如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記等技術(shù)的測(cè)定，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。例如參見(jiàn)deVos等人，1992，Science255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；fflodaver等人，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。也可從與本發(fā)明多肽相關(guān)的多肽的同一性分析來(lái)推斷關(guān)鍵氨基酸的身份。[0083]可用已知的誘變、重組、和/或改組(shuffling)方法來(lái)進(jìn)行單一或多個(gè)氨基酸替代并檢測(cè)，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，諸如Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156；W095/17413；或W095/22625所公開(kāi)的?？墒褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)PCR、噬菌體展示(例如Lowman等人，1991，Biochem.30:10832-10837;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，223,409;W092/06204)、和定區(qū)誘變(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等人，1986,Gene46:145；Ner等人，1988,DNA7:127)。[0084]可將誘變/改組方法與高通量、自動(dòng)篩選方法相結(jié)合，用于檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、經(jīng)誘變的多肽的活性(Ness等人，1999,NatureBiotechnologyl7:893_896)?？墒褂帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的經(jīng)誘變DNA分子并快速測(cè)序。這些方法可快速測(cè)定目的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并可應(yīng)用于結(jié)構(gòu)未知的多肽。[0085]SEQIDNO:2第23至250位氨基酸中氨基酸替代、缺失、和/或插入的總數(shù)為10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、甚至更優(yōu)選3、最優(yōu)選2、且甚至最優(yōu)選I。[0086]具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的來(lái)源[0087]可從任何屬的微生物中獲得本發(fā)明的多肽。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“從...獲得”在本文與指定的來(lái)源聯(lián)用時(shí)，應(yīng)當(dāng)意指由核苷酸序列編碼的多肽是由該來(lái)源產(chǎn)生的，或是來(lái)自于該來(lái)源的核苷酸序列已經(jīng)插入其中的菌株產(chǎn)生的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，從指定來(lái)源獲得的多肽分泌到細(xì)胞外。[0088]本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的多肽，諸如芽孢桿菌屬(BaciIIus)的多肽，例如嗜堿芽孢桿菌(BaciIIusalkalophiIus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)的多肽；或鏈霉菌屬(Streptomyces)的多肽，例如淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)的多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌的多肽，例如大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌(Pseudomonassp.)的多肽。[0089]本發(fā)明的多肽還可以是真菌多肽，且更優(yōu)選酵母多肽，諸如假絲酵母屬(Candida)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia屬的多妝；或更優(yōu)選絲狀真菌的多肽，諸如Acremonium屬、曲霉屬(Aspergillus)、短柄霉屬(Aureobasidium)λ隱球酵母屬(Cryptocoecus)、Filibasidium屬、德抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe屬、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix屬、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(PeniciIlium)、Piromyces屬、裂糟菌屬(Schizophyllum)、Talaromyces屬、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭抱殼屬(ThieIavia)、Tolypocladium屬、或木霉屬(Trichoderma)的多肽。[0090]在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽是卡爾斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道拉斯糖酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗糖酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地糖酵母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽。[0091]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、棉色二抱(Diplodiagossyppina)、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、谷抱德抱(Fusariumcereals)、Fusariumcrookwellense、黃色德抱(Fusariumculmorum)、禾谷德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporium)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖抱德抱(Fusariumoxysporum)、網(wǎng)狀德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、近念珠狀德抱(Fusariumtorulosum)、單端抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、有毒德抱(Fusariumvenenatum)、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、Magnaporthegrisea、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Phanerochaetechrysosporium、淡黑假黑盤(pán)菌(Pseudoplectanianigrella)、禮色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)Λ瑞氏木霉(Trichodermareesei)、綠色木霉(Trichodermaviride)、或Trichophaeasaccata的多月太。[0092]在一個(gè)更優(yōu)選的方面，多肽是橙色嗜熱子囊菌的多肽，例如具有氨基酸序列SEQIDNO:2的多肽。`[0093]應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于上述物種，不管已知的種名是什么，本發(fā)明既包括完全階段(perfectstate)和不完全階段(imperfectstate)，還包括其它分類(lèi)學(xué)等價(jià)物，例如無(wú)性型。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易的識(shí)別適當(dāng)?shù)葍r(jià)物的身份。[0094]這些物種的菌株可容易的在許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)為公眾所得到，諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)、德國(guó)微生物和培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSM)、荷蘭培養(yǎng)物保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures,CBS)、和美國(guó)農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專(zhuān)利培養(yǎng)物保藏中心北部研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollectionNorthernRegionalResearchCenter,NRRL)。[0095]此外，利用上述探針可從其它來(lái)源，包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等)分離的微生物中鑒定和獲得這些多肽。從自然生境中分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)是眾所周知的。然后可通過(guò)類(lèi)似的篩選這樣一種微生物的基因組或cDNA文庫(kù)來(lái)獲得多核苷酸。一旦用探針檢測(cè)出編碼多肽的多核苷酸序列，就可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)(例如參見(jiàn)Sambrook等人,1989,同上)分離或克隆此多核苷酸。[0096]本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端?？赏ㄟ^(guò)將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)融合來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列使得它們處于同一讀碼框中且融合多肽的表達(dá)受相同啟動(dòng)子和終止子的控制。[0097]多核苷酸[0098]本發(fā)明還涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。[0099]在一個(gè)優(yōu)選的方面，核苷酸序列為SEQIDN0:1所不。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,核苷酸序列是質(zhì)粒PDZA2-7中所含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQIDN0:1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，核苷酸序列是質(zhì)粒PDZA2-7中所含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。本發(fā)明還涵蓋編碼具有氨基酸序列SEQIDNO:2的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，它與SEQIDNO:1因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同。本發(fā)明還涉及編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的SEQIDN0:2之片段的SEQIDNO:1之子序列。[0100]本發(fā)明還涉及在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一處突變的突變多核苷酸，其中突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸組成的多肽。[0101]用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或者兩者的組合。例如，通過(guò)利用眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用抗體篩選表達(dá)文庫(kù)以檢測(cè)出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，可以實(shí)現(xiàn)從這些基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸序列。例如參見(jiàn)Innis等人，1990,《PCR:AGuidetoMethodsandApplication)),AcademicPress,NewYork。還可以使用其它核酸擴(kuò)增程序，諸如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)、和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)?？蓮乃箧邭倬昊蛘吡硗獾幕蛳嚓P(guān)的生物體克隆多核苷酸，因此它可以是例如核苷酸序列中多肽編碼區(qū)的等位或種丨0]變體。[0102]本發(fā)明還涉及具有如下核苷酸序列的編碼活性多肽的多核苷酸，該核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列(即第67至796位核苷酸)具有至少70%、優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、且甚至最優(yōu)選至少97%、98%或99%的同一性程度。[0103]為了合成與本發(fā)明多肽基本上類(lèi)似的多肽，可能必需修飾編碼多肽的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)與多肽“基本上類(lèi)似”是指多肽的非天然存在形式。這些多肽可能因某些改造而區(qū)別于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如在比活、熱穩(wěn)定性、最佳PH等方面不同的人工變體?？梢栽赟EQIDN0:1多肽編碼區(qū)所呈現(xiàn)的核苷酸序列基礎(chǔ)上構(gòu)建變體序列，例如其子序列，和/或通過(guò)引入不會(huì)導(dǎo)致由核苷酸序列編碼的多肽具有另一種氨基酸序列、而是使之符合意圖用來(lái)生產(chǎn)酶的宿主生物體的密碼子使用率的核苷酸替代，或通過(guò)引入可導(dǎo)致不同氨基酸序列的核苷酸替代。對(duì)于核苷酸替代的一般說(shuō)明可參見(jiàn)例如Ford等人，1991，ProteinExpressionandPurification2:95_107o[0104]對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見(jiàn)的是這些種替代可在分子功能的關(guān)鍵區(qū)域之外進(jìn)行并且仍然可得到活性多肽?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域的已知程序來(lái)鑒別對(duì)于由本發(fā)明的分離多核苷酸所編碼的多肽的活性來(lái)說(shuō)至關(guān)重要的因此優(yōu)選不進(jìn)行替代的氨基酸殘基，諸如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(例如參見(jiàn)Cunningham和Wells，1989，Science244:1081-1085)。在后一種技術(shù)中，在分子中每一帶正電荷殘基處引入突變，然后對(duì)得到的突變分子測(cè)試增強(qiáng)分解纖維素活性以鑒定對(duì)分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可通過(guò)三維結(jié)構(gòu)分析來(lái)確定，其中三維結(jié)構(gòu)可由諸如核磁共振分析、晶體學(xué)、或光親和標(biāo)記等技術(shù)來(lái)測(cè)定(例如參見(jiàn)deVos等人，1992，Science255:306-312；Smith等人，1992，JournalofMolecularBiology224:899-904;Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBSLetters309:59-64)D[0105]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸，它在很低嚴(yán)緊條件、優(yōu)選低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中等-高嚴(yán)緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊度條件、且最優(yōu)選很高嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDN0:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；或其等位變體和子序列發(fā)生雜交(Sambrook等人，1989,同上),正如本文所定義的。[0106]本發(fā)明還涉及通過(guò)如下獲得的編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的分離多核苷酸，即(a)在很低、低、中等、中等-高、高、或很高嚴(yán)緊條件下將DNA群體與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii),(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸。[0107]在一個(gè)優(yōu)選的方面，DNA群體在低嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，DNA群體是在中等嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，DNA群體在中等一高嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，DNA群體在高嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。[0108]核酸構(gòu)建體[0109]本發(fā)明還涉及包含與一種或多種控制序列可操作連接的本發(fā)明的分離多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述控制序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞中在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。[0110]可利用多種方法操作編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。根據(jù)表達(dá)載體的不同，可能希望或必需在將多核苷酸序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是為本領(lǐng)域眾所周知的。[0111]控制序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，即受到宿主細(xì)胞識(shí)別來(lái)表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列包含調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的、和雜合的啟動(dòng)子，而且可從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因中獲得。[0112]用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的實(shí)例，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，是從大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核生物的β_內(nèi)酸胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)中獲得的啟動(dòng)子，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。還有“Usefulproteinsfromrecombinantbacteria，，，ScientificAmerican,1980,242:74-94及Sambrook等人，1989,同上中描述的其它啟動(dòng)子。[0113]用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的實(shí)例是從米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、有毒鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、有毒鐮孢Daria(W000/56900)、有毒鐮孢Quinn(W000/56900)、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、瑞氏木霉β-葡糖苷酶、瑞氏木霉纖維二糖水解酶1、瑞氏木霉纖維二糖水解酶I1、瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、瑞氏木霉木聚糖酶1、瑞氏木霉木聚糖酶I1、瑞氏木霉β-木糖苷酶基因中獲得的啟動(dòng)子，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的雜合啟動(dòng)子)；及其突變的、截短的、和雜合的啟動(dòng)子。[0114]在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(ΤΡΙ)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因中所獲得的。還有Romanos等人，1992，Yeast8:423-488中描述了用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用啟動(dòng)子。[0115]控制序列也可以是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，即由宿主細(xì)胞識(shí)別來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的3’端。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可用于本發(fā)明。[0116]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得的。[0117]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)、和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因中獲得的。還有Romanos等人，1992，同上中描述的用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用終止子。[0118]控制序列還可以是適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列，即對(duì)宿主細(xì)胞翻譯很重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’端。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。[0119]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因中獲得的。[0120]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列是從釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因中獲得的。[0121]控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，即可操作連接于核苷酸序列3’端的序列，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)可由宿主細(xì)胞識(shí)別為將聚腺苷殘基添加到轉(zhuǎn)錄的mRNA上的信號(hào)。在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明。[0122]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖昔酶的基因獲得的。[0123]Guo和Sherman等人，1995,MolecularCellularBiologyl5:5983-5990中描述了對(duì)酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列。[0124]控制序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，它編碼的氨基酸序列連接于多肽的氨基末端并指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5’端可固有的包含信號(hào)肽編碼區(qū)，它在翻譯讀碼框中與編碼分泌多肽的編碼區(qū)段天然連接?；蛘撸幋a序列的5’端可以包含對(duì)編碼序列是外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)。如果編碼序列天然不含信號(hào)肽編碼區(qū)，則可能需要外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)?；蛘撸鈦?lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單的替換天然信號(hào)肽編碼區(qū)以便增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選擇宿主細(xì)胞分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。[0125]用于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是從芽孢桿菌NCIB11837的生麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌的β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的`中性蛋白酶類(lèi)(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌的prsA基因獲得的信號(hào)妝編碼區(qū)。還有Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57=109-137中描述的其它信號(hào)肽。[0126]對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicolainsolens纖維素酶、Humicolainsolens內(nèi)切葡聚糖酶V、和Humicolalanuginosa脂肪酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)。[0127]在一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)是編碼SEQIDN0:2第I至22位氨基酸的SEQIDNO:1第I至66位核苷酸。[0128]對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得的。還有Romanos等人，1992，同上中描述了的其它有用的信號(hào)肽編碼區(qū)。[0129]控制序列還可以是前肽(prop印tide)編碼區(qū)，它編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽稱(chēng)為酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或有時(shí)候稱(chēng)作酶原(zymogen))。多肽原一般是沒(méi)有活性的，且可通過(guò)前肽的催化或自催化切割從多肽原轉(zhuǎn)變成成熟有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得。[0130]當(dāng)信號(hào)肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時(shí)，前肽區(qū)位于靠近多肽氨基末端的位置，而信號(hào)肽區(qū)位于靠近前肽區(qū)的氨基末端位置。[0131]還可能需要加上調(diào)節(jié)序列以使多肽的表達(dá)可以相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是能響應(yīng)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而引起基因表達(dá)的開(kāi)啟或關(guān)閉的那些。在原核系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些包括在氨甲喋呤存在時(shí)擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，以及有重金屬存在時(shí)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作連接。[0132]表達(dá)載體[0133]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體?？梢詫⒈疚乃龅母鞣N核酸和控制序列連接起來(lái)以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，此重組表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制性位點(diǎn)使得在這些位點(diǎn)可插入或替換編碼多肽的核苷酸序列?；蛘撸景l(fā)明的核苷酸序列可通過(guò)將核苷酸序列或含有序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，將編碼序列置于載體中以使編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列可操作連接。[0134]重組表達(dá)載體可以是可方便的接受重組DNA操作并能引起核苷酸序列表達(dá)的任何載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇一般取決于載體與引入此載體的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線(xiàn)性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。[0135]載體可以是自主復(fù)制載體，即載體可以染色體外實(shí)體的形式存在，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包含任何用于確保自我復(fù)制的手段?；蛘撸d體可以是這樣的一種載體，它在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，整合到基因組中并與整合的染色體一起復(fù)制。此外，可使用單一載體或質(zhì)粒，或是一起含有待引入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的兩種或多種載體或質(zhì)粒，或者轉(zhuǎn)座子。[0136]本發(fā)明載體優(yōu)選包含一種或多種選擇標(biāo)記，所述選擇標(biāo)記允許易于選擇轉(zhuǎn)化的、轉(zhuǎn)染的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的等細(xì)胞。選擇標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物有助于產(chǎn)生抗微生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型變成原養(yǎng)型等等。[0137]細(xì)菌選擇標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性諸如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。適于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。在絲狀宿主細(xì)胞中使用的選擇標(biāo)記包括但不限于:amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷_5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(sulfateadenyltransferase))、和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)及其等價(jià)物。優(yōu)選用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。[0138]本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細(xì)胞基因組中或者允許載體在細(xì)胞中不依賴(lài)于基因組自主復(fù)制的元件。[0139]對(duì)整合到宿主細(xì)胞基因組來(lái)說(shuō)，載體可依賴(lài)編碼多肽的多核苷酸序列或任何其它載體元件通過(guò)同源或非同源重組整合到基因組中。或者，載體可包含附加的核苷酸序列用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組在染色體精確位置整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。為了提高在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選包含足夠數(shù)目的與對(duì)應(yīng)靶序列具有高度同一性的核酸，諸如100-10，000個(gè)堿基對(duì)、優(yōu)選400-10，000個(gè)堿基對(duì)、且最優(yōu)選800-10，000個(gè)堿基對(duì)，從而提高同源重組的幾率。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。[0140]對(duì)自主復(fù)制來(lái)說(shuō)，載體還可包含能使載體在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的調(diào)節(jié)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制因子。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文中定義為能使質(zhì)?；蜉d體在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。[0141]細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是使得在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及使得在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點(diǎn)。[0142]用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2μπι復(fù)制起點(diǎn)、ARSl、ARS4、ARSl和CEN3的組合、及ARS4和CEN6的組合。[0143]可用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例有AMAl和ANSKGems等人，1991，Gene98:61-67;Cullen等人，1987，NucleicAcidsResearchl5:9163-9175;TO00/24883)。AMAl基因的分離和包含該基因的質(zhì)粒或載體的構(gòu)建可根據(jù)W000/24883中所公開(kāi)的方法來(lái)完成。[0144]可將本發(fā)明多核苷酸一個(gè)以上的拷貝插入宿主細(xì)胞中以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。提高多核苷酸拷貝數(shù)可通過(guò)將序列的至少一個(gè)附加拷貝整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中或通過(guò)將可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因加入多核苷酸來(lái)獲得，在其中包含選擇標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝的細(xì)胞，以及因此多核苷酸的附加拷貝可在存在適當(dāng)?shù)倪x擇劑時(shí)通過(guò)培養(yǎng)此細(xì)胞選擇得出。[0145]用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(例如參見(jiàn)Sambrook等人，1989,同上)。[0146]宿主細(xì)胞[0147]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，它們可有利的用于多肽的重組生產(chǎn)。如前所述，可將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞以使載體保持為染色體的整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括所有那些由于在復(fù)制期間出現(xiàn)的突變而不同于親本細(xì)胞的親本細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上依賴(lài)于編碼多肽的基因和它的來(lái)源。[0148]宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。[0149]有用的單細(xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)胞，諸如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillusclausi1、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細(xì)胞，例如淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細(xì)菌，諸如大腸桿菌和假單胞菌。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、或枯草桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細(xì)胞是嗜堿的芽孢桿菌。[0150]將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可通過(guò)例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如Chang和Cohen，1979,MolecularGeneralGeneticsl68:111_115)、利用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)例如Young和Spizizen,1961,JournalofBacteriology81:823-829;或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)、電穿孔(參見(jiàn)例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)、或接合(參見(jiàn)例如Koehler和Thorne,1987,JournalofBacteriologyl69:5771-5278)來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0151]宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，諸如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、或真菌細(xì)胞。[0152]在一個(gè)優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞?！罢婢痹谟糜诒疚臅r(shí)包括子囊菌門(mén)(Acomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、和接合菌門(mén)(Zygomycota)(如Hawksworth等人，在《AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi》,第八版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義的)，以及卵菌門(mén)(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995,同上第171頁(yè)中所引用的)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995,同上)。[0153]在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞?！敖湍浮痹谟糜诒疚臅r(shí)包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目Endomycetales)、產(chǎn)擔(dān)孢子酵母、和屬于不完全真菌的酵母(芽生菌綱Blastomycetes)。由于酵母的分類(lèi)今后還會(huì)變化,對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，酵母應(yīng)該是如在《BiologyandActivitiesofYeast》(Skinner,F.A.、Passmore,S.M.和Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9,1980)中所定義的。[0154]在一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、或Yarrowia屬細(xì)胞。[0155]在一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾斯伯糖酵母、釀酒酵母、糖化糖酵母、道拉斯糖酵母、克魯弗糖酵母、諾第糖酵母、或卵形糖酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面,酵母宿主細(xì)胞是YarrowiaIipolytica細(xì)胞。[0156]在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(mén)(Eumycota)和卵菌門(mén)亞門(mén)的所有絲狀體(如Hawksworth等人，1995,同上中所定義的)。絲狀真菌通常是以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、及其他復(fù)合多糖組成的菌絲壁為特征。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)表現(xiàn)為菌絲伸長(zhǎng)，碳代謝是專(zhuān)性需氧的。相反，酵母諸如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)表現(xiàn)為單細(xì)胞菌體的出芽而碳代謝可以是發(fā)酵性的。[0157]在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Acremonium屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬(Bjerkandera)、Ceriporiopsis屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球酵母屬、Filibasidium屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe屬、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix屬、脈孢霉菌、擬青霉屬、青霉屬、Phanerochaete屬、射脈菌屬(Phlebia)、Piromyces屬、側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、裂裙菌屬、Talaromyces屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬、栓菌屬(Trametes)、或木霉屬的細(xì)胞。[0158]在一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、谷孢鐮孢、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、網(wǎng)狀鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬枝孢鐮孢、硫色鐮孢、近念珠狀鐮孢、單端孢鐮孢、或有毒鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、Ceriporiopsisaneirina、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsissubvermispora、灰色鬼傘、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糖脈抱菌、產(chǎn)紫青霉、Phanerochaetechrysosporium、福射射脈菌(Phlebiaradiata)>Pleurotuseryngi1、Thielaviaterrestris、Trametesvillosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、瑞氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。[0159]真菌細(xì)胞可以本身已知的方式通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、和細(xì)胞壁再生的過(guò)程進(jìn)行轉(zhuǎn)化。EP238023和Yelton等人，1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述了適合曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程。Malardier等人，1989，Gene78:147-159和W096/00787中描述了適合轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的方法?？衫肂ecker和Guarente在A(yíng)belson,J.N.和Simon,Μ.1.編的《GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology》，MethodsinEnzymology,Vol.194,ppl82_187,AcademicPress公司，NewYork;Ito等人，1983,JournalofBacteriologyl53:163;及Hinnen等人，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所描述的程序轉(zhuǎn)化酵母。[0160]生產(chǎn)方法[0161]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠在其野生型產(chǎn)生多肽；并6)回收所述多肽。優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是嗜熱子囊菌屬細(xì)胞，更優(yōu)選的是橙色嗜熱子囊菌。[0162]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并6)回收所述多肽。[0163]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含如下突變核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述突變核苷酸序列在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區(qū)中具有至少一處突變，其中突變核苷酸序列編碼由SEQIDN0:2第23至250位氨基酸組成的多肽，并(b)回收所述多肽。[0164]在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，利用本領(lǐng)域眾所周知的方法在適于產(chǎn)生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，細(xì)胞培養(yǎng)可在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和可使所述多肽表達(dá)和/或分離的條件下，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、補(bǔ)料-分批、或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的程序在含有碳和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。適宜的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或者可根據(jù)已公布的配方來(lái)制備(例如參見(jiàn)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。如果多肽分泌到培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么可從細(xì)胞裂解物中進(jìn)行回收。[0165]可利用本文描述的方法來(lái)檢測(cè)具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽。[0166]所得多肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可通過(guò)常規(guī)流程從培養(yǎng)基中回收，包括但不限于:離心、過(guò)濾、萃取、噴射-干燥、蒸發(fā)、或沉淀。[0167]本發(fā)明的多肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種程序純化，包括但不限于:層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳(例如制備性等電聚焦)、差異溶解(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(例如參見(jiàn)《ProteinPurification)),J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989),以獲得基本上純的多妝。[0168]植物[0169]本發(fā)明還涉及經(jīng)編碼本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化而以可回收量表達(dá)和產(chǎn)生多肽的轉(zhuǎn)基因植物、植株部分、或植物細(xì)胞。所述多肽可從植物或植株部分回收?；蛘?，將含有重組多肽的植物或植株部分就此用于改善食物或飼料的質(zhì)量，例如提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、可口性和流變性、或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。[0170]轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例有草(grasses)，例如草地草(藍(lán)草，早熟禾屬(Poa));草料草，諸如羊矛屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);溫帶草,例如剪股穎屬(Agrostis);和谷類(lèi),例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。[0171]雙子葉植物的實(shí)例有煙草，豆科作物諸如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆、和大豆，和十字花科植物(十字花科Brassicaceae)，諸如花椰菜、油菜籽、和親緣很近的模式生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。[0172]植株部分的實(shí)例有莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、和塊莖，以及構(gòu)成這些部分的單獨(dú)組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、脈管組織、分生組織。特殊的植物細(xì)胞小室，諸如葉綠體、質(zhì)外體、線(xiàn)粒體、液泡、過(guò)氧化物酶體、和細(xì)胞質(zhì)也認(rèn)為是植株部分。此外,任何植物細(xì)胞，無(wú)論什么組織來(lái)源，也認(rèn)為是植株部分。類(lèi)似的，植株部分，諸如有利于本發(fā)明應(yīng)用的特定的分離組織和細(xì)胞也認(rèn)為是植株部分，例如胚、胚乳、糊粉、和種皮。[0173]這些植物、植株部分、和植物細(xì)胞的后代也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。[0174]表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的構(gòu)建可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，植物或植物細(xì)胞的構(gòu)建可通過(guò)將一種或多種編碼本發(fā)明多肽的表達(dá)構(gòu)建體摻入植物宿主基因組中并將所得的經(jīng)修飾植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。[0175]表達(dá)構(gòu)建體方便的是核酸構(gòu)建體，它含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸且該多核苷酸可操作連接在所選定的植物或植株部分中表達(dá)此核苷酸序列所需的適當(dāng)調(diào)控序列。而且，表達(dá)構(gòu)建體可包含用于鑒定整合了此表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記，和將此構(gòu)建體導(dǎo)入所討論的植物所需要的DNA序列(后者取決于所用導(dǎo)入DNA的方法)。[0176]例如，根據(jù)希望在何時(shí)、在何處、和怎樣表達(dá)多肽來(lái)選擇調(diào)控序列，諸如啟動(dòng)子和終止子序列和任選的信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成性的或可誘導(dǎo)的，或者是發(fā)育、階段、或組織特異的，基因產(chǎn)物可以是靶向特定組織或植株部分諸如種子或葉。調(diào)控序列有例如Tague等人，1988,PlantPhysiology86:506所述。[0177]對(duì)于組成性表達(dá)，可使用35S_CaMV、玉蜀黍泛蛋白1、和水稻肌動(dòng)白I啟動(dòng)子(Franck等人，1980，Cell21:285-294；Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18:675-689;Zhang等人，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來(lái)自忙藏庫(kù)組織(storagesinktissues)諸如種子、馬鈴薯塊莖、和果實(shí)(Edwards和Coruzzi,1990,AnnRevGenet24:275-303),或來(lái)自于代謝庫(kù)(metabolicsinktissues)組織諸如分生組織(Ito等人，1994，PlantMolBiol24:863_878)，種子特異性啟動(dòng)子諸如來(lái)自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或清蛋白啟動(dòng)子(Wu等人，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),來(lái)自香?(Viciafaba)?球蛋白Β4和未知種子蛋白基因的香豆啟動(dòng)子(Conrad等人，1998,JournalofPlantPhysiologyl52:708-711),來(lái)自種子油體(seedoilbody)蛋白的啟動(dòng)子(Chen等人，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941),來(lái)自歐洲油菜(Brassicanapus)的忙藏蛋白napA啟動(dòng)子，或者本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異啟動(dòng)子，例如W091/14772中所述。此外，啟動(dòng)子可以是葉特異性啟動(dòng)子，諸如來(lái)自水稻或番爺?shù)膔bcs啟動(dòng)子(Kyozuka等人，1993,PlantPhysiologyl02:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85-93),或來(lái)自水稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等人，1995,MolecularandGeneralGenetics248:668-674),或者傷口誘導(dǎo)性啟動(dòng)子諸如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等人，1993,PlantMolecularBiology22:573_588)。同樣，啟動(dòng)子可通過(guò)非生物處理例如溫度、干旱、或鹽度變化來(lái)誘導(dǎo)，或通過(guò)外源施加能激活啟動(dòng)子的物質(zhì)，例如乙醇、雌激素、植物激素諸如乙烯、脫落酸和赤霉酸以及重金屬來(lái)誘導(dǎo)。[0178]還可使用啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件，從而在植物中獲得本發(fā)明多肽的更高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是位于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如Xu等人，1993，同上中公開(kāi)了利用水稻肌動(dòng)蛋白I基因的第一個(gè)內(nèi)含子來(lái)增強(qiáng)表達(dá)。[0179]選擇標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可選自本領(lǐng)域可利用的那些范圍。[0180]可根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體摻入植物基因組中，包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)、和電穿孔(Gasser等人，1990，Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等人，1989,Nature338:274)。[0181]目前,根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium.tumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的首選方法(其綜述可參見(jiàn)Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMolecularBiologyl9:15_38)，而且也可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管這些植物常使用其它轉(zhuǎn)化方法。目前，選擇用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是粒子轟擊(以轉(zhuǎn)化用DNA包被的金或鶴微粒)胚的愈傷組織或發(fā)育中的胚(Christou,1992,PlantJournal2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasil等人，1992,Bio/TechnologylO:667_674)。如Omirulleh等人，1993,PlantMolecularBiology21:415-428中所描述的，單子葉植物轉(zhuǎn)化的替代方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行的。[0182]在轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選出已摻入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并使其再生成為完整植株。通常轉(zhuǎn)化程序設(shè)計(jì)成在再生期間或在后代中選擇性清除選擇基因，例如通過(guò)兩種不同T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過(guò)特異重組酶進(jìn)行的選擇基因的位點(diǎn)特異切除來(lái)進(jìn)行。[0183]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下，培養(yǎng)含有如下多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽；并6)回收所述多肽。[0184]增強(qiáng)分解纖維素活性的消除或降低[0185]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)親本細(xì)胞突變體的方法，包括破壞或刪除編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列或其部分，這導(dǎo)致突變體細(xì)胞產(chǎn)生的多肽比在相同條件下培養(yǎng)的親本細(xì)胞少。[0186]可使用本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】眾所`周知的方法通過(guò)降低或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變體細(xì)胞，例如使用插入、破壞、替換、或刪除。在一個(gè)優(yōu)選的方面，將核苷酸序列失活。例如，要修飾或失活的核苷酸序列可以是編碼區(qū)或?qū)蚱浠钚员匦璧牟糠郑蚓幋a區(qū)表達(dá)所需要的調(diào)控元件。這種調(diào)控或控制序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分?？尚揎椀钠渌刂菩蛄邪ǖ幌抻谇皩?dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄激活因子。[0187]核苷酸序列的修飾或失活可通過(guò)將親本細(xì)胞誘變，并選擇所述核苷酸序列的表達(dá)降低或消除的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。所述誘變可以是特異的或隨機(jī)的，例如通過(guò)使用適宜的物理或化學(xué)誘變劑、通過(guò)使用適宜的寡核苷酸、或通過(guò)對(duì)DNA序列PCR產(chǎn)生誘變來(lái)進(jìn)行。此外，誘變可通過(guò)使用這些誘變劑的任意組合來(lái)進(jìn)行。[0188]適于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)的誘變劑的實(shí)例包括紫外線(xiàn)(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類(lèi)似物。[0189]在使用這些試劑時(shí)，誘變一般是這樣進(jìn)行的:在適宜條件下，在存在所選的誘變處理試劑下保溫用于誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇展示基因表達(dá)降低或不表達(dá)的突變細(xì)胞來(lái)。[0190]核苷酸序列的修飾或失活可通過(guò)在基因中或在其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需要的調(diào)控元件中引入、替換、或消除一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)進(jìn)行。例如，可插入或消除核苷酸從而形成終止密碼子的引入、起始密碼子的消除、或開(kāi)放讀碼框的改變。這些修飾或滅活可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生誘變來(lái)完成。雖然，原則上，修飾可在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)要修飾的核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，優(yōu)選的是如下面實(shí)例中所示在體外進(jìn)行修飾。[0191]適宜的消除或降低細(xì)胞核苷酸序列表達(dá)的方法的實(shí)例是以基因替換、基因刪除、或基因破壞技術(shù)為基礎(chǔ)的。例如，在基因破壞方法中，將相當(dāng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化到親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò)同源重組，缺陷的核酸序列替換內(nèi)源核苷酸序列。所希望的是，缺陷的核苷酸序列還編碼可用于選擇核苷酸序列已經(jīng)修飾或破壞了的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，諸如用本文所述選擇標(biāo)記來(lái)破壞核苷酸序列。[0192]或者，核苷酸序列的修飾或失活可通過(guò)已建立的反義或RNAi技術(shù)使用與核苷酸序列互補(bǔ)的序列來(lái)進(jìn)行。更具體的說(shuō)，細(xì)胞核苷酸序列的表達(dá)可通過(guò)引入與基因核苷酸序列互補(bǔ)的序列來(lái)降低或消除，其中該引入的序列可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并能與細(xì)胞中所產(chǎn)生的mRNA發(fā)生雜交。在允許互補(bǔ)的反義核苷酸序列與mRNA發(fā)生雜交的條件下，所翻譯蛋白質(zhì)的量由此降低或消除。[0193]本發(fā)明此外涉及在編碼所述多肽的多核苷酸序列或其控制序列中包含破壞或刪除的親本細(xì)胞的突變細(xì)胞，這導(dǎo)致突變細(xì)胞產(chǎn)生的所述多肽比親本細(xì)胞少或不產(chǎn)生多肽。[0194]這樣構(gòu)建的多肽缺陷的突變細(xì)胞作為宿主細(xì)胞用于天然和/或異源蛋白質(zhì)的表達(dá)特別有用。因此，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)天然或異源蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；并6)回收所述多肽。術(shù)語(yǔ)“異源蛋白質(zhì)”在本文中定義為對(duì)宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)不是天然的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)修飾改變了天然序列的天然蛋白質(zhì)，或是經(jīng)過(guò)重組DNA技術(shù)處理宿主細(xì)胞從而使其表達(dá)發(fā)生了量變的天然蛋白質(zhì)。[0195]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵生成本發(fā)明多肽和目的蛋白質(zhì)產(chǎn)物二者的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)本質(zhì)上沒(méi)有增強(qiáng)分解纖維素活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，其中在發(fā)酵完成之前、當(dāng)中、或之后通過(guò)往發(fā)酵液中加入有效量的可抑制增強(qiáng)分解纖維素活性的試劑，并從發(fā)酵液中回收目的產(chǎn)物，以及任選進(jìn)行回收產(chǎn)物的進(jìn)一步純化。[0196]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)下列步驟來(lái)生產(chǎn)本質(zhì)上沒(méi)有增強(qiáng)分解纖維素活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，在允許產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并使所得培養(yǎng)液進(jìn)行PH和溫度聯(lián)合處理以便顯著地降低增強(qiáng)分解纖維素活性，并從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物。或者，PH和溫度聯(lián)合處理可在從培養(yǎng)液中回收的酶制備物上進(jìn)行。任選地，pH和溫度聯(lián)合處理增強(qiáng)可與分解纖維素抑制劑處理結(jié)合。[0197]根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面,可能消除至少60%、優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少85%、仍更優(yōu)選至少95%、且最優(yōu)選至少99%的增強(qiáng)分解纖維素活性。通過(guò)使用這種方法可實(shí)現(xiàn)完全消除增強(qiáng)分解纖維素活性。[0198]pH和溫度聯(lián)合處理優(yōu)選在pH為4-5和溫度為80_90°C進(jìn)行足夠的一段時(shí)間以達(dá)到預(yù)期的效果。[0199]可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)和目的產(chǎn)物的純化。[0200]本發(fā)明用于生產(chǎn)本質(zhì)上不含增強(qiáng)分解纖維素的產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)，諸如酶的生產(chǎn)中特別令人感興趣。例如，酶可選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶、或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的實(shí)例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、ct-或β-葡糖苷酶、鹵代過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。增強(qiáng)分解纖維素缺陷的細(xì)胞還可用于表達(dá)具有藥學(xué)價(jià)值的異源蛋白質(zhì)，諸如激素、生長(zhǎng)因子、受:體等等。[0201]應(yīng)理解的是術(shù)語(yǔ)“真核多肽”不僅`包括天然多肽，還包括經(jīng)過(guò)氨基酸替代、刪除或添加的修飾或是用以提高活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等等其它類(lèi)似修飾的多肽，例如酶。[0202]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的本質(zhì)上沒(méi)有增強(qiáng)分解纖維素活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。[0203]組合物[0204]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽的組合物。優(yōu)選的是，組合物富集了這類(lèi)多肽。術(shù)語(yǔ)“富集”是指組合物的增強(qiáng)分解纖維素活性已經(jīng)被提高，例如富集因子為至少1.1。[0205]所述組合物可包含本發(fā)明的多肽作為主要組分，例如單一組分組合物?；蛘撸M合物還可含有一種或多種酶活性，諸如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。通過(guò)屬于下列屬的微生物可產(chǎn)生附加的酶，例如曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、谷孢鐮孢、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、網(wǎng)狀鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、近念珠狀鐮孢、單端孢鐮孢、或有毒鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選Humicolainsolens或Humicolalanuginosa;或木霉屬,優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、5而氏木霉、或綠色木霉。[0206]可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備多肽組合物，并且它可以是液體或干燥組合物。例如，多肽組合物可以是顆?；蛭⒘５男问健？梢员绢I(lǐng)域已知的方法穩(wěn)定包含在組合物中的多肽。[0207]下文給出了本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的實(shí)施例。本發(fā)明多肽組合物的劑量和使用組合物的其它條件可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定。[0208]生物材料降解或轉(zhuǎn)化為單糖、二糖、和多糖[0209]本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括:在存在有效量的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)，用有效量的分解纖維素的蛋白質(zhì)處理纖維素材料，其中所述具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的存在與不存在所述具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)相比增加了纖維素材料的降解。[0210]本發(fā)明的多肽和宿主細(xì)胞可用于從生物質(zhì)生產(chǎn)單糖、二糖、和多醣，作為化學(xué)或發(fā)酵原料，用于生產(chǎn)乙醇、塑料、或其它產(chǎn)品或中間體。具體而言，通過(guò)纖維素或半纖維素的部分或完全溶解，本發(fā)明的多肽和宿主細(xì)胞可用于提高加工殘余物(干酒糟、釀酒的酒糟、甘蔗渣等等)的價(jià)值。如下所述，在分解纖維素的蛋白質(zhì)促進(jìn)纖維素材料加工成葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖的過(guò)程中，也產(chǎn)生了它們的聚合物或由其衍生的產(chǎn)物。該多肽可以是含有或不含細(xì)胞的粗制發(fā)酵液的形式，或者是半純化或者純化的酶制備物的形式。該增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)可以是單組分制備物，例如家族61蛋白質(zhì)，多組分蛋白質(zhì)制備物，例如許多家族61蛋白質(zhì)，或者多組分和單組分蛋白質(zhì)制備物的組合。增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)可在酸性、中性、或堿性pH范圍內(nèi)提高分解纖維素的蛋白質(zhì)的活性?；蛘?，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可在生物材料的發(fā)酵過(guò)程中用作該多肽的來(lái)源。宿主細(xì)胞還可以含有天然的或異源的編碼分解纖維素的蛋白質(zhì)以及對(duì)加工生物材料有用的其它酶的基因。[0211]生物材料可包括但不限于:木材資源、城市固體廢物、廢紙、農(nóng)作物、和農(nóng)作物殘余物(參見(jiàn)例如Wiselogel等人，1995,在((HandbookonBioethanol》中，CharlesE.Wyman編，pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719;Mosier等人，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，T.Scheper主編，Vol.65，pp.23-40，Springer-Verlag,NewYork)。[0212]生物質(zhì)原生(primary)細(xì)胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，而第三是果膠。細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生的次生(secondary)細(xì)胞壁也含有多糖，而且它通過(guò)與半纖維素共價(jià)交聯(lián)的聚合木質(zhì)素得到強(qiáng)化。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此為線(xiàn)狀的i3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纖維素包含多種化合物，諸如具有多種取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的木聚糖、木糖葡聚糖、阿糖木聚糖、和甘露聚糖。雖然纖維素通常是多形的，但在植物組織中發(fā)現(xiàn)的纖維素主要是以平行葡聚糖鏈的不溶性晶體基質(zhì)的形式存在。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵結(jié)合，這有助于穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。[0213]在本發(fā)明的方法中，分解纖維素的蛋白質(zhì)可以是參與將纖維素材料加工成葡萄糖或?qū)肜w維素加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、它們的聚合物、或由其衍生的產(chǎn)物的任何蛋白質(zhì)，正如下文所述。分解纖維素的蛋白質(zhì)可以是單組分制備物，例如纖維素酶，多組分制備物，例如下文定義的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖水解酶、β-葡萄糖苷酶，或多組分和單組分蛋白質(zhì)制備物的組合。分解纖維素的蛋白質(zhì)可在酸性、中性或堿性PH范圍內(nèi)具有活性，即水解纖維素。[0214]分解纖維素的蛋白質(zhì)可以是真菌或細(xì)菌來(lái)源，可以從已知能夠產(chǎn)生纖維素分解酶的微生物中獲得或分離和純化，例如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鬼傘屬、梭孢殼屬、鐮孢屬、毀絲霉屬、Acremonium屬、頭孢屬(Cephalosporium)、柱頂孢屬(Scytalidium)、青霉屬或曲霉屬的物種(參見(jiàn)例如ΕΡ458162),尤其是那些由選自如下物種的菌株產(chǎn)生的那些:Humicolainsolens(重新分類(lèi)為嗜熱柱頂孢(Scytalidiumthermophilum),參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，435，307)、灰蓋鬼傘、尖孢鐮孢、嗜熱毀絲霉、Meripilusgiganteus、土生梭抱殼(Thielaviaterrestris)、Acremoniumsp.、Acremoniumpersicinum、Acremoniumacremonium、Acremoniumbrachypenium、Acremoniumdichromosporum、Acremoniumobclavaturn、Acremoniumpinkertoniae、Acremoniumroseogriseum、Acremoniumincoloratum和Acremoniumfuratum;優(yōu)選來(lái)自如下物種:HumicolainsolensDSM1800、尖孢鐮孢DSM2672、嗜熱毀絲霉CBS117.65、頭孢RYM—202、Acremoniumsp.CBS478.94、Acremoniumsp.CBS265.95、AcremoniumpersicinumCBS169.65、AcremoniumacremoniumAHU9519、頭抱CBS535.71、AcremoniumbrachypeniumCBS866.73、AcremoniumdichromosporumCBS683.73、AcremoniumobclavatumCBS31L74、AcremoniumpinkertoniaeCBS157.70、AcremoniumroseogriseumCBS134.56、AcremoniumincoloratumCBS146.62和AcremoniumfuratumCBS299.70H。分解纖維素的蛋白質(zhì)也可由木霉屬(特別是綠色木霉、瑞氏木霉和康寧木霉)、嗜堿性芽孢桿菌(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，844，890和EP458162)和鏈霉菌屬(參見(jiàn)例如EP458162)獲得。還包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程突變體。[0215]尤其合適的分解纖維素的蛋白質(zhì)是堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的實(shí)例有EP495,257、EP531,372、W096/11262、W096/29397、W098/08940中描述的纖維素酶。其它實(shí)例有諸如W094/07998、EP531,315、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，435，307、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，457，046、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，648，263、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，686，593、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，691，178、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，763，254、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，776，757、W089/09259、W095/24471、W098/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纖維素酶變體。[0216]本發(fā)明方法中使用的分解纖維素的蛋白質(zhì)和增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)可通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的程序?qū)⑸衔乃鑫⑸锞暝诤泻线m的碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)(參見(jiàn)例如Bennett,J.W.和LaSure，L.編，《MoreGeneManipulationsinFungi)),AcademicPress,CA,1991)。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商處獲得，或者可根據(jù)發(fā)表的組成(例如在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)來(lái)制備。適于生長(zhǎng)和生產(chǎn)分解纖維素的蛋白質(zhì)的溫度范圍和其它條件是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Bailey,J.E.和Ollis1D.F.,((BiochemicalEngineeringFundamentals)),McGraw-Hi11BookCompany,NY,1986)。[0217]發(fā)酵可以是培養(yǎng)細(xì)胞而導(dǎo)致分解纖維素的蛋白質(zhì)或增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)表達(dá)或分離的任何方法。因此，可將發(fā)酵理解為包括搖瓶培養(yǎng)、在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中在合適的培養(yǎng)基中和在允許分解纖維素的蛋白質(zhì)或增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料-分批或固態(tài)發(fā)酵)。[0218]通過(guò)上述方法產(chǎn)生的所得分解纖維素的蛋白質(zhì)或增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)可從發(fā)酵培養(yǎng)基中通過(guò)常規(guī)程序回收，包括但不限于離心、過(guò)濾、噴霧-干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可通過(guò)多種層析，例如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等將回收的蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化。[0219]分解纖維素的蛋白質(zhì)可水解或水解羧甲基纖維素(CMC)，由此降低保溫混合物的粘度。所得粘度降低可通過(guò)振動(dòng)粘度計(jì)(vibrationviscosimeter)(例如來(lái)自法國(guó)Sofraser的MIVI3000)來(lái)測(cè)定。依照纖維素酶粘度單位(CEVU)測(cè)量的纖維素酶活性的測(cè)定通過(guò)測(cè)量樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力來(lái)定量樣品中存在的催化活性的量。該測(cè)定法以適于分解纖維素的蛋白質(zhì)和底物的溫度和PH進(jìn)行。對(duì)于Celluzyme?(NovozymesA/S,BagSVierd,丹麥)，測(cè)定法于40°C在0.1M磷酸鹽pH9.0緩沖液中以CMC作為底物(33.3g/L羧甲基纖維素Hercules7LFD)和大約3.3-4.2CEVU/ml的酶濃度進(jìn)行30分鐘。相對(duì)于公告的酶標(biāo)準(zhǔn)物，諸如Celluzyme?Standardl7_l194(來(lái)自NovozymesA/S),計(jì)算CEVU活性。[0220]適用于本發(fā)明的分解纖維素的制備物的實(shí)例包括例如CELLUCLAST?(可從NovozymesA/S獲得)和N0V0ZYM?188(可從NovozymesA/S獲得)。包含可使用的纖維素酶的其它商品化制備物包括CELLUZYME?、CEREFL0?和ULTRAFL0?(NovozymesA/S)、LAMINEX?和SPEZYME?CP(GenencorInt.)及R0HAMENT?7069W(RohmGmbH)。纖維素酶以固體重量的大約0.001%至大約5.0%、更優(yōu)選固體重量的大約0.025%至大約4.0%、和最優(yōu)選固體重量的大約0.005%至大約2.0%的有效量加入。[0221]如上所述，用于本發(fā)明方法的分解纖維素的蛋白質(zhì)或增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)可以是單組分制備物，即本質(zhì)上不含其它分解纖維素組分的組分。該單組分可以是重組組分，即通過(guò)克隆編碼該單組分的DNA序列隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)而產(chǎn)生的(參見(jiàn)例如W091/17243和W091/17244)。單組分分解纖維素的蛋白質(zhì)的其它實(shí)例包括但不限于JP-07203960-A和W0-9206209中公開(kāi)的那些。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對(duì)于宿主來(lái)說(shuō)是外源的)，但在某些條件下所述宿主也可以是同源宿主(酶對(duì)于宿主來(lái)說(shuō)是天然的)。單組分分解纖維素的蛋白質(zhì)還可以通過(guò)從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化所述蛋白來(lái)制備。[0222]可用于實(shí)施本發(fā)明方法的單組分分解纖維素的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。[0223]術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中定義為內(nèi)切-1，4-(1,3;1，4)-β-D-葡聚糖4_葡聚糖水解酶(E.C.N0.3.2.1.4)，它催化纖維素、纖維素衍生物(諸如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)和地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷鍵，混合的β-1，3葡聚糖諸如谷類(lèi)β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖，和含有纖維素組分的其它植物原料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，內(nèi)切葡聚糖酶活性根據(jù)Ghose,1987,PureandApp1.Chem.59:257-268的程序，使用羧甲基纖維素(CMC)水解來(lái)測(cè)定。[0224]外切-1，4-β-D-葡聚糖酶包括纖維二糖水解酶和葡糖水解酶。`[0225]術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”在本文中定義為1，4-β-?-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91),它催化纖維素、纖維寡糖(cel10ligosaccharides)、或含有β-1,4_連接葡萄糖的任何聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原性或非還原性末端釋放纖維二糖。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，纖維二糖水解酶活性根據(jù)Lever等人，1972,Anal.Biochem.47:273-279和vanTilbeurgh等人，1982，F(xiàn)EBSLettersl49:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLettersl87:283-288描述的程序來(lái)測(cè)定。在本發(fā)明中，采用Lever等人的方法來(lái)評(píng)估玉米秸桿中的纖維素水解，而將vanTilbeurgh等人的方法用于測(cè)定對(duì)熒光二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。[0226]術(shù)語(yǔ)“葡糖水解酶”在本文中定義為1，4_β-D-葡聚糖葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.74)，它催化1，4-β-D-葡聚糖中1，4-鍵(O-糖基鍵)的水解，以除去連續(xù)的葡萄糖單元。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，外切葡聚糖酶活性根據(jù)Himmel等人，1986，J.Biol.Chem.261:12948-12955描述的方法來(lái)測(cè)定。[0227]術(shù)語(yǔ)“β-葡萄糖苷酶”在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，它催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解并釋放β-D-葡萄糖。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，β-葡萄糖苷酶活性根據(jù)Venturi等人,2002,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本程序來(lái)測(cè)定，只是如本文所述采用不同的條件。一個(gè)單位的葡萄糖苷酶活性定義為于50°C、pH5在IOOmM檸檬酸鈉、0.01%Tween-20中從作為底物的4mM對(duì)硝基苯基-β-D-批喃型葡萄糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0μmole對(duì)硝基苯酹。[0228]用本發(fā)明的多肽結(jié)合分解纖維素的蛋白質(zhì)來(lái)降解生物質(zhì)底物的纖維素組分(參見(jiàn)例如Brigham等人，1995,在《HandbookonBioethanol》中，CharlesE.Wyman編，pp.119-141,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Lee,1997,JournalofBiotechnology56:1_24)。[0229]具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽和分解纖維素的蛋白質(zhì)的最佳用量取決于幾個(gè)因素，包括但不限于分解纖維素的蛋白質(zhì)組分的混合物、纖維素底物、纖維素底物的濃度、纖維素底物的預(yù)處理、溫度、時(shí)間、pH、和發(fā)酵生物(例如同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵的酵母)的引入。術(shù)語(yǔ)“分解纖維素的蛋白質(zhì)”(cellulolyticproteins)在本文中定義為在測(cè)試條件下證明能夠水解或轉(zhuǎn)化或降解纖維`素的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物。其用量通常是通過(guò)普通的測(cè)定法諸如BCA(雙辛可寧酸(bicinchoninicacid)，P.K.Smith等人，1985,Anal.Biochem.150:76)來(lái)測(cè)量的，而且優(yōu)選的添加量與水解的生物質(zhì)的量成比例。[0230]在一個(gè)優(yōu)選的方面，每g纖維素材料中具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的量是每g纖維素材料大約0.01至大約2.0mg、優(yōu)選大約0.025至大約1.5mg、更優(yōu)選大約0.05至大約1.25mg、更優(yōu)選大約0.075至大約1.25mg、更優(yōu)選大約0.1至大約1.25mg、甚至更優(yōu)選大約0.15至大約1.25mg、且最優(yōu)選大約0.25至大約1.0mg。[0231]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，每g纖維素材料中分解纖維素的蛋白質(zhì)的量是每g纖維素材料大約0.5至大約50mg、優(yōu)選大約0.5至大約40mg、更優(yōu)選大約0.5至大約25mg、更優(yōu)選大約0.75至大約20mg、更優(yōu)選大約0.75至大約15mg、甚至更優(yōu)選大約0.5至大約10mg、且最優(yōu)選大約2.5至大約10mg。[0232]在一個(gè)優(yōu)選的方面，每g分解纖維素的蛋白質(zhì)中具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的量是每g分解纖維素的蛋白質(zhì)大約0.005至大約1.0g、優(yōu)選大約0.01至大約1.0g、更優(yōu)選大約0.15至大約0.75g、更優(yōu)選大約0.15至大約0.5g、更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g、甚至更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g、且最優(yōu)選大約0.05至大約0.2g。[0233]本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料加工成許多有用的有機(jī)產(chǎn)品、化學(xué)品和燃料。除了乙醇之外，能夠由纖維素生產(chǎn)的一些物品和專(zhuān)用化學(xué)品包括木糖、丙酮、乙酸鹽或酯(acetate)、甘氨酸、賴(lài)氨酸、有機(jī)酸(例如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醒、聚羥基鏈焼酸鹽或酯(polyhydroxyalkanoates)、順，順-粘康酸(cis，cis-muconicacid)、和動(dòng)物飼料(Lynd，LR.ΛWyman,C.Ε.和GerngrossjΤ.U.，1999，BiocommodityEngineering，Biotechnol.Prog.15:777-793;Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,在〈〈HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization))中，Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC，179-212;及Ryu，D.D.Y.和Mandels，M.,1980,Cellulases!biosynthesisandapplications，Enz.Microb.Technol.2:91_102)。可能的共生產(chǎn)效益不僅僅是由可發(fā)酵的碳水化合物合成多種有機(jī)產(chǎn)品?？蓪⑸飳W(xué)加工之后剩余的富含木質(zhì)素的殘余物轉(zhuǎn)化為源自木質(zhì)素的化學(xué)品，或用于發(fā)電。[0234]根據(jù)本發(fā)明的方法用于加工纖維素材料的常規(guī)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是完全理解的。可使用經(jīng)過(guò)配置以依照本發(fā)明運(yùn)作的任何常規(guī)生物材料加工設(shè)備來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。[0235]這樣的設(shè)備可包括分批攪拌反應(yīng)器(batch-stirredreactor)、帶超濾的連續(xù)流攬拌反應(yīng)器(continuousflowstirredreactorwithultrafiltration)、連續(xù)活塞流柱反應(yīng)器(continuousplug-flowcolumnreactor)(Gusakov,A.V.和Sinitsyn，A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346_352)、磨碎反應(yīng)器(attritionreactor)(Ryu,S.K.和Lee，J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor，Biotechnol.Bioeng.25:53-65)或具有由電磁場(chǎng)誘導(dǎo)的強(qiáng)攬拌的反應(yīng)器(Gusakov，A.V.、Sinitsyn,A.P.、Davydkinj1.Υ.、DavydkinjV.Υ.、Protasj0.V.，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield，App1.Biochem.Biotechnol.56:141_153)。[0236]所述常規(guī)方法包括但不限于糖化、發(fā)酵、單獨(dú)水解和發(fā)酵(SHF)、同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)、同時(shí)糖化和共發(fā)酵(SSCF)、雜合水解和發(fā)酵(hybridhydrolysisandfermentation,HHF)、及直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。[0237]SHF使用單獨(dú)的加工步驟，首先用酶將纖維素水解成葡萄糖，然后將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。在SSF中，將纖維素的酶促水解和葡萄糖變成乙醇的發(fā)酵組合在一個(gè)步驟中(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,在《HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization》中，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis，Washington,DC，179_212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan，J.和Himmel，M.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy^sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)0HHF包括在同一反應(yīng)器中但在不同溫度進(jìn)行的兩個(gè)單獨(dú)的步驟，即高溫酶促糖化，后續(xù)在發(fā)酵菌株能耐受的較低溫度進(jìn)行的SSF。DMC將所有三種過(guò)程(纖維素酶生成、纖維素水解和發(fā)酵)組合在一個(gè)步驟中(Lynd,L.R.、Weimer,P.J.、vanZyl,W.H.和Pretorius,1.S.,2002,Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)o[0238]“發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法包括但不限于用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括醇類(lèi)(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3_羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸);酮類(lèi)(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、絲氨酸和蘇氨酸);氣體(例如甲烷、氫(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵方法還包括用于食用醇工業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳品加工業(yè)(例如發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的發(fā)酵方法。[0239]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的方法，包括:(a)在存在有效量的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)，用有效量的分解纖維素的蛋白質(zhì)將纖維素材料糖化，其中所述具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的存在與不存在所述具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽相比增加了纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物將步驟(a)糖化的纖維素材料發(fā)酵；并(C)從發(fā)酵物中回收有機(jī)物質(zhì)。具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽可以是含有或沒(méi)有細(xì)胞的粗制發(fā)酵液的形式，或是半純化或純化的酶制備物的形式。增強(qiáng)分解纖維素的蛋白質(zhì)可以是單組分制備物，例如一種家族61蛋白質(zhì)，多組分蛋白質(zhì)制備物，例如多種家族61蛋白質(zhì)，或者多組分和單組分蛋白質(zhì)制備物的組合。[0240]所述有機(jī)物質(zhì)可以是從發(fā)酵得到的任何物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)物質(zhì)是醇?？衫斫獾氖切g(shù)語(yǔ)“醇”涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)羥基部分的有機(jī)物。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見(jiàn)例如Gong,C.S.,Cao,N.J.、Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology))中，Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124；Ezeji,T.C.>Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnologyl9(6):595_603。[0241]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，有機(jī)物質(zhì)是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是富馬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋(píng)果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見(jiàn)例如Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_448。[0242]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，有機(jī)物質(zhì)是酮?？梢岳斫獾氖切g(shù)語(yǔ)“酮”涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)酮部分的有機(jī)物。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見(jiàn)例如Qureshi和Blaschek,2003,同上。[0243]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，有機(jī)物質(zhì)是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴(lài)氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見(jiàn)例如Richard,A.，和Margaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o[0244]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，有機(jī)物質(zhì)是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見(jiàn)例如Kataoka,N.、A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria，WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47；及GunaseelanV.Ν.，BiomassandBioenergyVol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。[0245]由纖維素材料生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)通常需要四個(gè)主要步驟。這四個(gè)步驟是預(yù)處理、酶促水解、發(fā)酵和回收。下面例舉的是生產(chǎn)乙醇的方法，但應(yīng)理解的是類(lèi)似的方法可用于生產(chǎn)其它有機(jī)物質(zhì)，例如上文所述物質(zhì)。[0246]預(yù)處理。在預(yù)處理或預(yù)水解步驟中，將纖維素材料加熱以破壞木質(zhì)素和碳水化合物結(jié)構(gòu)，使大部分半纖維素溶解，并使纖維素級(jí)分可被纖維素分解酶接近。直接用蒸氣或者在漿液中進(jìn)行加熱，在所述漿液中也可將催化劑加入原料以加速反應(yīng)。催化劑包括強(qiáng)酸，諸如硫酸和SO2，或堿，諸如氫氧化鈉。預(yù)處理階段的目的在于促進(jìn)酶和微生物的透過(guò)(penetration)。也可將纖維素生物材料進(jìn)行濕熱蒸汽噴發(fā)(hydrothermalstreamexplosion)預(yù)處理(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0020164730)。[0247]趣化。在酶促水解(也稱(chēng)為糖化)步驟中，將本文所述酶加入預(yù)處理的原料以將纖維素級(jí)分轉(zhuǎn)化為葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在pH、溫度和混合條件受控的攪拌槽反應(yīng)器(stirred-tankreactor)和發(fā)酵罐中進(jìn)行。糖化步驟可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)200個(gè)小時(shí)。糖化可于大約30°C至大約65°C、特別是大約50°C的溫度，和大約4至大約5，尤其是大約pH4.5的pH進(jìn)行。為了生產(chǎn)能被酵母代謝的葡萄糖，通過(guò)在存在β_葡萄糖苷酶時(shí)進(jìn)行水解。[0248]發(fā)醛。在發(fā)酵步驟中，將作為預(yù)處理和酶促水解步驟的結(jié)果由纖維素材料釋放的糖通過(guò)發(fā)酵生物諸如酵母發(fā)酵成乙醇。發(fā)酵也可與酶促水解在同樣pH、溫度和混合條件受控的同一容器中同時(shí)進(jìn)行。當(dāng)糖化和發(fā)酵在同一容器中同時(shí)進(jìn)行時(shí)，該過(guò)程通常稱(chēng)為同時(shí)糖化和發(fā)酵或SSF。[0249]任何合適的纖維素底物或原材料可用于本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程。通常根據(jù)預(yù)期的發(fā)酵產(chǎn)品，即要由發(fā)酵得到的有機(jī)物質(zhì)，和采用的方法來(lái)選擇底物，正如本領(lǐng)域眾所周知的。適用于本發(fā)明方法的底物的實(shí)例包括含有纖維素的材料，諸如木材或植物殘余物或由加工的纖維素材料得到的低分子糖DP1-3，它們可由發(fā)酵微生物代謝，且可通過(guò)直接添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中來(lái)提供。[0250]術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”將理解為指發(fā)酵微生物加入之前的培養(yǎng)基，諸如由糖化過(guò)程得到培養(yǎng)基，以及用于同時(shí)糖化和發(fā)酵過(guò)程(SSF)的培養(yǎng)基。[0251]“發(fā)酵微生物”指適用于期望發(fā)酵過(guò)程的任何微生物。根據(jù)本發(fā)明的合適的發(fā)酵微生物能夠發(fā)酵，即直接或間接將糖，諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖轉(zhuǎn)化為所需發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵微生物的實(shí)例包括真菌生物體，諸如酵母。優(yōu)選的酵母包括糖酵母菌種的菌株，特別是釀酒酵母。商品化的酵母包括例如RedStar?/TM/LeSaffreEthanolRed(可從美國(guó)的RedStar/Lesaffre獲得)、FALI(可從美國(guó)的BurnsPhilpFoodInc.的Fleischmann，sYeast部門(mén)獲得)、SUPERSTART(可從Alltech獲得)、GERTSTRAND(可從瑞典的GertStrandAB獲得)和FERM10L(可從DSMSpecialties獲得)。[0252]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是糖酵母菌種。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是糖化糖酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是葡萄汁糖酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,所述酵母是克魯維氏酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromycesfragilis)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母為假絲酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是Candidapseudotropicalis。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是Candidabrassicae。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,所述酵母是Clavispora屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是ClavisporaIusitaniae0在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是Clavisporaopuntiae。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,所述酵母是酒香酵母屬(Brettannomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,所述酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,在〈〈HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization〉〉中，Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。[0253]能有效將葡萄糖發(fā)酵為乙醇的細(xì)菌包括例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zymomonasmobilis)和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996,同上)。[0254]本領(lǐng)域眾所周知上述生物體還可用于生產(chǎn)其它有機(jī)物質(zhì)，正如本文所述。[0255]在釀酒酵母中(Chen,Z.、Ho,N.W.Y.,1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho,N.ff.Y.、Chen,Z.、Brainard,A.P.,1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859)，或在細(xì)菌諸如大腸桿菌(Beall,D.S.、Ohta,Κ.、Ingram,L.0.，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296_303)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(Ingram,L.0.、Gomes,P.F.、Lai,X.、Moniruzzaman,M.、Wood,B.E.>Yomano,L.P.>York,S.ff.,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單抱菌(Zhang,Μ.、Eddy,C.、Deanda,K.、Finkelstein,M.和Picataggio,S.,1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243；Deanda,K.、Zhang,M.、Eddy,C.和Picataggio,S.,1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470)中克隆異源基因?qū)е履軐⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化為乙醇(共發(fā)酵)的生物體的構(gòu)建。[0256]通常將酵母或另一種微生物加入降解的纖維素或水解產(chǎn)物，而發(fā)酵進(jìn)行大約24至大約96小時(shí)，諸如大約35至大約60小時(shí)。溫度通常在大約26°C至大約40°C，特別是在大約32°C，和在大約pH3至大約pH6，特別是pH4_5左右。[0257]在一個(gè)優(yōu)選的方面，將酵母或另一種微生物施用于降解的纖維素或水解物，而發(fā)酵進(jìn)行大約24至大約96小時(shí)，諸如通常35-60小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，溫度通常在大約26至大約40°C之間，特別是在大約32°C，而pH通常為大約pH3至大約pH6，優(yōu)選pH4_5左右。優(yōu)選將酵母或另一種微生物以每ml發(fā)酵培養(yǎng)液(fermentationbroth)大約IO5至1012、優(yōu)選大約IO7至10'尤其是大約5xl07活菌計(jì)數(shù)的量施用。在乙醇生產(chǎn)階段期間，酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)優(yōu)選在大約IO7至101°的范圍內(nèi)，尤其是大約2xl08左右。關(guān)于使用酵母發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可見(jiàn)于例如《TheAlcoholTextbook))(K.Jacques、Τ.P.Lyons和D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom,1999),將其引入作為參考。[0258]本領(lǐng)域中最廣泛使用的方法是同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)方法，其中沒(méi)有糖化的保持階段(holdingstage),這意味著酵母和酶一起加入。[0259]對(duì)于乙醇生產(chǎn)而言，發(fā)酵后將醪液(mash)蒸餾以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的乙醇可用作例如燃料乙醇；飲料乙醇，即可飲用酒精(potableneutralspirits);或工業(yè)乙醇。[0260]發(fā)酵刺激物(fermentationstimulator)可與本文描述的任何酶促過(guò)程組合使用以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法，特別是發(fā)酵微生物的性能，諸如速率增加和乙醇產(chǎn)量。“發(fā)酵刺激物”指用于發(fā)酵微生物特別是酵母的生長(zhǎng)的刺激物。優(yōu)選的用于生長(zhǎng)的發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素(multivitamins)、生物素、泛酸、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡哆醇、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、及維生素A、B、C、D^PE。參見(jiàn)例如Alfenore等人,ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag,2002,將其引入本文作為參考。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營(yíng)養(yǎng)的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。[0261]Ml。從發(fā)酵的纖維素材料分離乙醇，并通過(guò)蒸餾的常規(guī)方法純化?？傻玫郊兌葹楦哌_(dá)大約96vol.%乙醇的乙醇，它可用作例如燃料乙醇、飲料乙醇即可飲用酒精、或工業(yè)乙醇。[0262]對(duì)于其它有機(jī)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，可使用本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳(例如制備性等電聚焦)、溶解度差異(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、蒸餾或萃取。[0263]在本發(fā)明的方法中，可用一種或多種附加的酶活性補(bǔ)充分解纖維素酶的蛋白質(zhì)和增強(qiáng)分解纖維素的多肽以改進(jìn)纖維素材料的降解。優(yōu)選的附加酶是半纖維素酶、酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶和/或角質(zhì)酶)、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶或其混合物。[0264]在本發(fā)明的方法中，可將附加的酶在發(fā)酵前或發(fā)酵過(guò)程中加入，包括發(fā)酵微生物繁殖的過(guò)程中或之后。[0265]本文所指的酶可源自或得自任何合適的來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動(dòng)物來(lái)源。術(shù)語(yǔ)“得到”在本文中指酶可分離自天然產(chǎn)生該酶作為固有酶(nativeenzyme)的生物體。術(shù)語(yǔ)“得到”在本文中還指酶可在宿主生物體中重組產(chǎn)生,其中所述重組產(chǎn)生的酶對(duì)于宿主生物體來(lái)說(shuō)是天然的或外源的或具有經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸序列，例如刪除、插入和/或替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，它是天然氨基酸序列的突變體和/或片段，或是通過(guò)本領(lǐng)域已知的核酸改組(shuffling)方法產(chǎn)生的酶。涵蓋在天然酶的意義中的有天然變體，而涵蓋在外源酶的意義中的有諸如通過(guò)定點(diǎn)誘變或改組而重組得到的變體。[0266]酶還可以是純化的。術(shù)語(yǔ)“純化的”在用于本文時(shí)涵蓋不含來(lái)自該酶的來(lái)源生物體的其它組分的酶。術(shù)語(yǔ)“純化的”還涵蓋不含來(lái)自得到所述酶的天然生物體的組分的酶。酶可以是純化的，只有少量的其它蛋白質(zhì)存`在。表述“其它蛋白質(zhì)”具體涉及其它酶。術(shù)語(yǔ)“純化的”在用于本文時(shí)還指去除其它組分，具體是其它蛋白質(zhì)，且最具體的是存在于本發(fā)明的酶的來(lái)源細(xì)胞中的其它酶。酶可以是“基本上純的”，即不含來(lái)自產(chǎn)生所述酶的生物體的其它組分，即例如用于重組產(chǎn)生酶的宿主生物體。在一個(gè)優(yōu)選的方面，酶是至少75%(w/w)、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、甚至更優(yōu)選至少98%、或最優(yōu)選至少99%純的。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酶是100%純的。[0267]用于本發(fā)明的酶可以是適用于本文描述的方法的任何形式，諸如例如含有或不含細(xì)胞的粗制發(fā)酵液、干粉或顆粒、非粉化顆粒(non-dustinggranulate)、液體、穩(wěn)定液體(stabilizedliquid)或受保護(hù)的酶的形式。顆?？衫缛缑绹?guó)專(zhuān)利號(hào)4，106，991和4，661，452中所公開(kāi)的來(lái)生產(chǎn)，且可任選通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法包衣。液體酶制備物可例如根據(jù)已確定的方法通過(guò)加入穩(wěn)定劑，諸如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或其它有機(jī)酸來(lái)穩(wěn)定。受保護(hù)的酶可根據(jù)EP238，216中公開(kāi)的方法來(lái)制備。[0268]半纖維素酶[0269]可通過(guò)多種真菌和細(xì)菌進(jìn)行半纖維素的酶促水解。與纖維素降解類(lèi)似，半纖維素水解需要許多酶的協(xié)調(diào)作用?？蓪肜w維素酶分成三種基本類(lèi)型:攻擊多糖鏈內(nèi)內(nèi)部鍵的內(nèi)作用酶(endo-actingenzyme),從多糖鏈的還原性或非還原性末端向前起作用的外作用酶(exo-actingenzyme),和附屬酶,水解木質(zhì)素糖苷鍵的乙酰酯酶(acetylesterase)和酯酶，諸如香豆酸(coumaricacid)酯酶和阿魏酸酯酶(Wong,K.K.Y.、Tan,L.U.L.和Saddler,J.N.,1988,Multiplicityofβ-1,4-xylanaseinmicroorganisms:Functionsandapplications,Microbiol.Rev.52:305-317；Tenkanen,M.和Poutanen,K.,1992,Significanceofesterasesinthedegradationofxylans,在((XylansandXylanases》，Visser,J.、Beldman,G.、Kuster-vanSomeren,M.A.和Voragen,A.G.J.編，Elsevier,NewYork,NY,203-212；Coughlan,M.P.和Hazlewood,G.P.,1993，《HemicelluloseandHemicellulases》，Portland,London,UK；Brigham,J.S.、Adney,ff.S.和Himmel,Μ.E.,1996,Hemicellulases:Diversityandapplications,在《HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization》，Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,119-141)。[0270]半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)切-半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯聚糖酶(arabinase)、外切-半乳聚糖酶及其混合物。內(nèi)作用半纖維素酶和附屬酶的實(shí)例包括內(nèi)阿拉伯聚糖酶(endoarabinanase)、內(nèi)切阿拉伯糖半乳聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切甘露聚糖酶、內(nèi)切木聚糖酶和feraxan內(nèi)切木聚糖酶。外作用半纖維素酶和附屬酶的實(shí)例包括a-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、a-l，2-L-巖藻糖苷酶、a-D-半乳糖苷酶、β_D_半乳糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-木糖苷酶、外切葡萄糖苷酶、外切纖維二糖水解酶、外切甘露二糖水解酶、外切甘露聚糖酶、外切木聚糖酶、木聚糖α-葡糖醛酸糖苷酶、和松柏苷葡萄糖苷酶。酯酶的實(shí)例包括乙酰酯酶(乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶)和芳基酯酶(香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶)。[0271]優(yōu)選的是，半纖維素酶是外作用半纖維素酶，而且更優(yōu)選在低于ρΗ7的酸性條件下具有水解半纖維素能力的外作用半纖維素酶。適用于本發(fā)明的半纖維素酶的實(shí)例包括VISC0ZYME?(可從NovozymesA/S獲得)。將半纖維素酶以固體重量的大約0.001%至大約5.0%、更優(yōu)選固體重量的大約0.025%至大約4.0%、且最優(yōu)選固體重量的大約0.005%至大約2.0%的有效量加入。[0272]木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)可由任何合適的來(lái)源獲得，包括真菌和細(xì)菌生物體，諸如曲霉屬、Disporotrichum、青霉屬、脈孢菌屬、鐮孢屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬、嗜熱霉屬(Thermomyces)和芽孢桿菌屬。含有木聚糖酶的優(yōu)選商品化制備物包括SHEARZYME?、BIOFEEDWHEAT?、BIO-FEEDPlus?L、CELLUCLAST?、ULTRAFLO?、VISCOZYME?、PENTOPANMONO?BG和PLUPZYME?HC(NovozymesA/S)；及LAMINEX?和SPEZYME?CP(GenencorInt.X[0273]酯酶[0274]可用于纖維素的生物轉(zhuǎn)化的酯酶包括乙酰酯酶，諸如乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶，以及水解木質(zhì)素糖苷鍵的酯酶，諸如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶。[0275]在用于本文時(shí)，“酯酶”也稱(chēng)為羧酸脂水解酶，指作用于酯鍵上的酶，包括根據(jù)酶命名法(《EnzymeNomenclature》，1992,AcademicPress,SanDiego,California,及分別在Eur.J.Biochem.223:1-5,1994；Eur.J.Biochem.232:1-6,1995；Eur.J.Biochem.237:1-5，1996；Eur.J.Biochem.250:1_6，1997；和Eur.J.Biochem.264:610-650,1999中的補(bǔ)遺I(1993)、補(bǔ)遺2(1994)、補(bǔ)遺3(1995)、補(bǔ)遺4(1997)和補(bǔ)遺5)歸入EC3.1.1羧酸脂水解酶的酶。酯酶的非限制性實(shí)例包括芳基酯酶、三酰甘油脂肪酶、乙酰酯酶、乙酰膽堿酯酶、膽堿酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果膠酯酶、留醇酯酶、葉綠素酶、L-阿拉伯糖酸內(nèi)酯酶、葡糖酸內(nèi)酯酶、糖醛酸內(nèi)酯酶、鞣酸酶、棕櫚酸視黃酯酯酶、羥基丁酸酯-二聚物水解酶、?；视椭久?、3-氧代己二酸烯醇內(nèi)酯酶、1，4-內(nèi)酯酶、半乳糖脂肪酶、4-吡哆醇內(nèi)酯酶、?；舛緣A水解酶、氨基酰基-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖酸內(nèi)酯酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、磷脂酶Al、6-乙酰葡糖脫乙?；?、脂蛋白脂肪酶、二氫香豆素脂肪酶、檸檬素-D-環(huán)-內(nèi)酯酶、類(lèi)固醇內(nèi)酯酶、三乙酸內(nèi)酯酶、放線(xiàn)菌素內(nèi)酯酶、苔色酸縮酚酸水解酶、頭孢菌素-C脫乙?；?、氯原酸水解酶、α-氨基酸酯酶、4-草酰乙酸甲酯酯酶(4-methyloxaloacetateesterase)、羧甲烯丁烯輕酸內(nèi)酯酶(carboxymethylenebutenolidase)、脫氧檸檬酸A-環(huán)-內(nèi)酯酶、2-乙?；?1-烷基甘油磷酸膽堿酯酶(2-acetyl-l-alkylglycerophosphocholine)、鐮孢氨酸-C鳥(niǎo)氨酸酯酶、芥子堿酯酶、蠟酯水解酶、佛波醇二酯水解酶、磷脂酰肌醇脫?；浮⑼僖核酧-乙酰酯酶、乙酰氧基丁基并噻吩脫乙酰基酶(acetoxybutynylbithiophenedeacetylase)、乙酰水楊酸脫乙酸基酶、乙酸甲基傘酮脫乙酸基酶(methylumbelliferyl-acetatedeacetylase)、2-批喃酮-4，6-二羧化物內(nèi)酯酶(2-pyrone-4,6-dicarboxylatelactonase)、N-乙酸半乳糖氨基聚糖脫乙?；?N-acetylgalactosaminoglycandeacetylase)、保幼激素酯酶、雙(2_乙基己基)鄰苯二甲酸酷酷酶(bis(2-ethylhexyl)phthalateesterase)、蛋白質(zhì)-谷氨酸酯甲基酯酶(protein-glutamatemethylesterase)>11-順式-棕櫚酸視黃酯水解酶、所有-反式-棕櫚酸視黃酯水解酶、L-鼠李糖-1，4-內(nèi)酯酶、5-(3，4-雙乙酸基丁-1-基)-2,2’-并噻吩脫酸基酶(5-(3,4-diacetoxybut-l-ynyl)_2，2’-bithiophenedeacetylase)、脂肪-酸基-乙基-酯合酶(fatty-acyl-ethyl-estersynthase)、木質(zhì)-1，4-內(nèi)酯酶(xylono-1，4-lactonase)、N-乙酰基葡糖胺基磷脂酰肌醇脫乙?；?、西曲酸酯苯甲基酯酶(cetraxatebenzylesterase)、乙酰基烷基甘油乙?；饷浮⒑鸵阴Ｄ揪厶酋ッ浮0276]用于本發(fā)明的優(yōu)選酯酶是脂肪分解酶，諸如脂肪酶(歸入EC3.1.1.3、EC3.1.1.23和/或EC3.1.1.26)和磷脂酶(歸入EC3.1.L4和/或EC3.1.1.32，包括歸入EC3.1.1.5的溶血磷脂酶)。其它優(yōu)選的酯酶有角質(zhì)酶(歸入EC3.1.1.74)。[0277]可將酯酶以有效量加入從而得到預(yù)期的優(yōu)勢(shì)以改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，例如改變發(fā)酵微生物內(nèi)部和/或外部，或發(fā)酵微生物的細(xì)胞膜中的脂質(zhì)組成/濃度，以在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生溶質(zhì)進(jìn)入和/或移出發(fā)酵微生物的運(yùn)動(dòng)中的改進(jìn)，和/或以提供更多可代謝的能量來(lái)源(諸如例如通過(guò)將諸如來(lái)自谷物底物的油等組分轉(zhuǎn)化為發(fā)酵微生物有用的組分，例如不飽和的脂肪酸和甘油)，以增加乙醇產(chǎn)量。有效量的酯酶的實(shí)例是大約0.01至大約400LU/gDS(干固體)。優(yōu)選的是，以大約0.1至大約100LU/gDS、更優(yōu)選大約0.5至大約50LU/gDS、和甚至更優(yōu)選大約I至大約20LU/gDS的量使用酯酶。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序，下文可獲得酯酶量的進(jìn)一步優(yōu)化。[0278]—個(gè)脂肪酶單位(LU)是以三丁精作為底物和阿拉伯樹(shù)膠作為乳化劑，于30°C、pH7.0(磷酸鹽緩沖液)，每分鐘釋放1.0μmol可滴定脂肪酸的酶量。[0279]在一個(gè)優(yōu)選的方面，酯酶是脂肪分解酶，更優(yōu)選脂肪酶。在用于本文時(shí)，“脂肪分解酶”指脂肪酶和磷脂酶(包括溶血磷脂酶)。脂肪分解酶優(yōu)選是微生物來(lái)源的，特別是細(xì)菌、真菌或酵母來(lái)源。所用脂肪分解酶可源自任何來(lái)源，包括例如犁頭霉屬(Absidia)的菌株，特別是Absidiablakesleena和傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)，無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)的菌株，特別是解毒無(wú)色桿菌(Achromobacteriophagus)，氣單抱菌屬(Aeromonas)的菌株，鏈格抱屬(Alternaria)的菌株，特別是Alternariabrassiciola,曲霉屬的菌株，特別是黑曲霉、米曲霉、煙曲霉和黃曲霉，無(wú)色桿菌屬的菌株，特別是解毒無(wú)色桿菌，短梗霉屬的菌株，特別是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，芽孢桿菌屬的菌株，特別是短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，白僵菌屬(Beauveria)的菌株，索絲菌屬(Brochothrix)的菌株，特別是熱殺索絲菌(Brochothrixthermosohata)，假絲酵母屬的菌株，特別是CandidacyIindracea(皺落假絲酵母(Candidarugosa))、Candidaparalipolytica和Candidaantarctica，色桿菌屬(Chromobacter)的菌株，特別是粘稠色桿菌(Chromobacterviscosum)，鬼傘屬的菌株，特別是灰蓋鬼傘，鐮孢屬的菌株，特別是禾谷鐮孢、尖孢鐮孢、腐皮鐮孢(Fusariumsolani)、Fusariumsolanipis1、黃色粉紅德抱(Fusariumroseumculmorum)和有毒德孢，Geotricum屬的菌株，特別是GeotricumpeniciIlatum，漢遜氏酵母屬的菌株，特別是異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)，腐質(zhì)霉屬的菌株，特別是Humicolabrevispora、Humicolabrevisvar.thermoidea和Humicolainsolens,Hyphozyma屬的菌株，乳桿菌屬(Lactobacillus)的菌株，特別是完全乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)，綠僵菌屬(Metarhizium)的菌株，毛霉屬的菌株，擬青霉屬的菌株，青霉屬的菌株，特別是圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)、皮落青霉(Penicilliumcrustosum)和擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)，假單胞菌屬的菌株，特別是銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、蔥頭假單胞菌(Pseudomonascepacia)(同義詞洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia))、焚光假單胞菌(PseudomonasfIuorescens)、莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonasfragi)、嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)、門(mén)多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)、Pseudomonasmephiticalipolytica、產(chǎn)堿假單胞菌、植物假單胞菌(Pseudomonasplantari)、類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)和Pseudomonaswisconsinensis，絲核菌屬(Rhizooctonia)的菌株，特別是立枯絲核菌(Rhizooctoniasolani)、根毛霉屬的菌株，特別是米赫根毛霉，根霉屬的菌株，特別是日本根霉(Rhizopusjaponicus)、小抱根霉(Rhizopusmicrosporus)和Rhizopusnodosus，紅冬抱酵母屬(Rhodosporidium)的菌株，特別是紅冬抱酵母(Rhodosporidiumtoruloides)，紅酵母屬(Rhodotorula)的菌株，特別是紅酵母(Rhodotorulaglutinis)，擲抱酵母屬(Sporobolomyces)的菌株，特別是Sporobolomycesshibatanus，嗜熱霉屬的菌株，特別是細(xì)毛嗜熱霉(ThermomycesIanuginosus)(以前稱(chēng)為細(xì)毛腐質(zhì)霉Humicolalanuginosa)，Thiarosporella的菌株，特另Ij是Thiarosporellaphaseolina，木霉屬的菌株，特別是哈茨木霉和瑞氏木霉，和/或輪枝孢屬(Verticillium)的菌株。[0280]在一個(gè)優(yōu)選的方面，脂肪分解酶源自曲霉屬、無(wú)色桿菌屬、芽孢桿菌屬、假絲酵母屬、色桿菌屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、Hyphozyma屬、假單胞菌屬、根毛霉屬、根霉屬或嗜熱霉屬的菌株。[0281]在更優(yōu)選的方面，脂肪分解酶是脂肪酶。在本文中可應(yīng)用脂肪酶在例如由谷物底物產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)基(包括發(fā)酵酵母)中修飾甘油三酸酯油和脂肪的結(jié)構(gòu)和組成的能力。脂肪酶催化不同類(lèi)型的甘油三酸酯轉(zhuǎn)化，諸如水解、酯化和酯交換(transesterification)。合適的脂肪酶包括酸性、中性和堿性脂肪酶，正如本領(lǐng)域眾所周知的，雖然酸性脂肪酶(諸如例如可從Amano獲得的脂肪酶GAMAN050)與中性或堿性脂肪酶相比，看起來(lái)在脂肪酶的較低濃度更有效。優(yōu)選用于本發(fā)明的脂肪酶包括Candidaantarcitca脂肪酶和Candidacylindracea脂肪酶。更優(yōu)選的脂肪酶是純化的脂肪酶,諸如Candidaantarcitca脂肪酶(脂肪酶A)、Candidaantarcitca脂肪酶(脂肪酶B)、Candidacylindracea脂肪酶和沙門(mén)柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)脂肪酶。[0282]脂肪酶可以是EP258，068-A中公開(kāi)的一種，或者可以是脂肪酶變體，諸如W000/60063或W000/32758中公開(kāi)的變體，引入本文作為參考。優(yōu)選的商品化脂肪酶包括LECITASE?、LIPOLASE?和LIPEX?(可從NovozymesA/S獲得)和GAMAN0?50(可從Amano獲得)。[0283]脂肪酶優(yōu)選以大約I至大約400LU/gDS、優(yōu)選大約I至大約10LU/gDS、和更優(yōu)選大約I至大約5LU/gDS的量加入。[0284]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，所述酯酶是角質(zhì)酶。角質(zhì)酶是能夠降解角質(zhì)的酶。角質(zhì)酶可源自任何來(lái)源。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述角質(zhì)酶源自曲霉屬的菌株，特別是米曲霉，鏈格孢屬的菌株，特別是Alternariabrassiciola,鐮孢屬的菌株,特別是腐皮鍵抱、Fusariumsolanipis1、黃色粉紅鍵抱或Fusariumroseumsambucium,長(zhǎng)螺抱屬(Helminthosporum)的菌株，特別是麥根腐長(zhǎng)螺孢(Helminthosporumsativum),腐質(zhì)霉屬的菌株，特別是Humicolainsolens,假單胞菌屬的菌株,特別是門(mén)多薩假單胞菌或惡臭假單胞菌，絲核菌屬的菌株，特別是立枯絲核菌，鏈霉菌屬的菌株，特別是瘡痂病鏈霉菌(Streptomycesscabies),或單格抱屬(Ulocladium),特別是UlocladiumConsortiale0在一個(gè)最優(yōu)選的方面，角質(zhì)酶源自Humicolainsolens的菌株，特別是菌株HumicolainsolensDSM1800。Humicolainsolens角質(zhì)酶在W096/13580中有描述，將其引入本文作為參考。角質(zhì)酶可以是變體，諸如W000/34450和W001/92502中公開(kāi)的變體之一，將其引入本文作為參考。優(yōu)選的角質(zhì)酶變體包括W001/92502的實(shí)施例2中列出的變體，將其明確引入本文作為參考。角質(zhì)酶的有效量為大約0.01至大約400LU/gDS、優(yōu)選大約0.1至大約100LU/gDS、且更優(yōu)選大約I至大約50LU/gDS。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序，下文可獲得角質(zhì)酶量的進(jìn)一步優(yōu)化。[0285]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酯酶是磷脂酶。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“磷脂酶”是具有針對(duì)磷脂的活性例如水解活性的酶。磷脂，諸如卵磷脂或磷脂酰膽堿，由外部(sn-Ι)和中間(sn-2)位置以?xún)蓚€(gè)脂肪酸酯化且第三個(gè)位置以磷酸酯化的甘油組成?？蓪⒘姿狨セ砂被??？蓞^(qū)分幾種類(lèi)型的磷脂酶活性，包括磷脂酶Al和A2，它們分別在sn-Ι和sn_2位置水解一個(gè)脂肪?；孕纬扇苎字?；和溶血磷脂酶(或磷脂酶B)，它水解溶血磷脂中殘余的脂肪?；Ａ字窩和磷脂酶D(磷酸二酯酶)分別釋放二?；视?diacylglycerol)或憐脂酸(phosphatidicacid)。[0286]術(shù)語(yǔ)“磷脂酶”包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(Al或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性、或磷脂酶D活性。術(shù)語(yǔ)“磷脂酶A”在用于本文時(shí)意圖涵蓋具有磷脂酶Al和/或磷脂酶A2活性的酶。也可通過(guò)具有其它活性的酶來(lái)提供磷脂酶活性，諸如例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。磷脂酶活性可例如來(lái)自具有磷脂酶副活性(sideactivity)的脂肪酶。在其它方面，通過(guò)本質(zhì)上只具有磷脂酶活性的酶來(lái)提供磷脂酶酶活性，而且其中磷脂酶酶活性不是副活性。[0287]磷脂酶可以是任何來(lái)源，例如動(dòng)物來(lái)源(例如哺乳動(dòng)物，例如?；蜇i胰)、或蛇毒或蜂毒?；蛘?，磷脂酶可以是微生物來(lái)源，例如來(lái)自絲狀真菌、酵母或細(xì)菌，諸如曲霉屬，例如泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉或米曲霉，網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium),例如盤(pán)基網(wǎng)柄菌(D.discoideum);鐮孢屬，例如黃色鐮孢、禾谷鐮孢、異孢鐮孢、腐皮鐮孢、尖孢鐮孢或有毒鐮孢；毛霉屬，例如，爪睡毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)或細(xì)孢毛霉(M.subtiIissimus);脈孢霉屬，例如粗糙脈孢菌；根毛霉屬，例如，微小根毛霉(R.pusillus);根霉屬，例如少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉或匍枝根霉(R.stolonifer);核盤(pán)菌屬(Sclerotinia),例如大豆核盤(pán)菌(S.1ibertiana);發(fā)癖菌屬(Trichophyton)，例如紅色發(fā)癖菌(T.rubrum)；Whetzelinia屬，例如ff.scIerotiorum;芽孢桿菌屬，例如巨大芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌；梓檬酸桿菌屬(Citrobacter),例如弗氏朽1檬酸桿菌(C.freundii);腸桿菌屬(Enterobacter),例如產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)或陰溝腸桿菌(E.cloacae);愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsiella),遲鈍愛(ài)德華氏菌(E.tarda);歐文氏菌屬(Erwinia),例如草生歐文氏菌(E.herbicola);埃希氏菌屬(Escherichia),例如大腸桿菌(E.coli)；克雷伯氏菌屬(Klebsiella),例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；變形菌屬(Proteus),例如普通變形菌(P.vulgaris);普羅威登斯菌屬(Providencia),例如斯氏普羅威登斯菌(P.stuartii);沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium);沙雷氏菌屬(Serratia),例如液化沙雷氏菌(S.1iquefasciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens);志賀氏菌屬(Shigella),例如弗氏志賀氏菌(S.fIexneri);鏈霉菌屬，例如，紫紅鏈霉菌(S.violeceoruber);或耶爾森氏菌屬(Yersinia),例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)。[0288]優(yōu)選的商品化磷脂酶包括LECITASE?和LECITASE?ULTRA(可從NovozymesA/S獲得)。[0289]磷脂酶的有效量為大約0.01至大約400LU/gDS、優(yōu)選大約0.1至大約100LU/gDS、且更優(yōu)選大約I至大約50LU/gDS。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序，下文可獲得磷脂酶量的進(jìn)一步優(yōu)化。[0290]蛋白酶[0291]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，將至少一種表面活性劑和至少一種碳水化合物生成酶與至少一種蛋白酶組合使用?？墒褂玫鞍酌咐鐏?lái)消化蛋白質(zhì)以產(chǎn)生游離的氨基氮(FAN)0所述游離的氨基酸起到酵母營(yíng)養(yǎng)物的作用，從而增強(qiáng)酵母的生長(zhǎng)，并因此增強(qiáng)乙醇的生產(chǎn)。[0292]可通過(guò)在存在至少一種蛋白酶時(shí)繁殖發(fā)酵微生物來(lái)產(chǎn)生用于發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵微生物。雖然不限于任何一`種操作理論，但相信當(dāng)發(fā)酵微生物后續(xù)用于發(fā)酵過(guò)程時(shí)，在含有有效量的至少一種蛋白酶的情況下繁殖發(fā)酵微生物與不加蛋白酶在相同條件下繁殖的發(fā)酵微生物相比縮短了發(fā)酵微生物的遲滯時(shí)間(lagtime)。相信蛋白酶在繁殖過(guò)程中的作用是直接或間接分別導(dǎo)致在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)于發(fā)酵微生物有害或有益基因的抑制或表達(dá)，從而縮短了遲滯時(shí)間并得到更快的發(fā)酵循環(huán)。[0293]蛋白酶是本領(lǐng)域眾所周知的，并指催化切割肽鍵的酶。合適的蛋白酶包括真菌和細(xì)菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即特征在于在低于PH7的酸性條件下水解蛋白質(zhì)的能力的蛋白酶。合適的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、假絲酵母屬、革蓋菌屬、內(nèi)座殼屬(Endothia)、Enthomophtra、f巴菌屬(Irpex)、青霉屬、小核菌屬(Sclerotium)和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌蛋白酶。尤其預(yù)期源自黑曲霉(參見(jiàn)例如Koaze等人，1964,Agr.Biol.Chem.Japan28:216)、齋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(參見(jiàn)例如Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan28:66)、泡盛曲霉(Hayashida等人，1977，Agric.Biol.Chem.42:927_933)、棘孢曲霉(TO95/02044)或米曲霉的蛋白酶；和源自微小毛霉或米赫毛霉的酸性蛋白酶。[0294]不是酸性蛋白酶的細(xì)菌蛋白酶包括商品化產(chǎn)品ALCALASE?和NEUTRASE?(可從NovozymesA/S獲得)。其它蛋白酶包括來(lái)自GenencorInt,Inc.(美國(guó))的GC106和來(lái)自NovozymesA/S的N0V0ZYM?50006。[0295]優(yōu)選的是，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，正如例如《HandbookofProteolyticEnzymes》(A.J.Barrett、N.D.Rawlings和J.F.Woessner編，AcademicPress,SanDiego,1998,第270章)中所述。天冬氨酸蛋白酶的合適實(shí)例包括例如Berka等人，1990,Gene96:313;Berka等人，1993，Genel25:195-198;及Gomi等人，1993，Biosc1.Biotech.Biochem.57:1095-1100中公開(kāi)的那些。[0296]討氣化物酶[0297]具有過(guò)氧化物酶活性的其它化合物可以是任何過(guò)氧化物酶(EC1.11.1.7)，或具有由其衍生的過(guò)氧化物酶活性、顯示過(guò)氧化物酶活性的任何片段。`[0298]優(yōu)選的是，過(guò)氧化物酶由植物(例如辣根或大豆過(guò)氧化物酶)或微生物諸如真菌或細(xì)菌產(chǎn)生。[0299]一些優(yōu)選的真菌包括屬于半知菌亞門(mén)(subdivisionDeuteromycotina)絲孢綱(classHyphomycetes)的菌株,例如鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、木霉屬、漆斑菌屬(Myrothecium)、輪枝孢屬(Verticillum)、Arthromyces屬、卡爾黑霉屬(Caldariomyces)、單隔孢屬、Embellisia屬、支抱屬(Cladosporium)或Dreschlera,特別是尖抱鍵抱(DSM2672)、Humicolainsolens、瑞氏木霉、撫抱漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)(IF06113)、黃萎輪枝抱菌(Verticillumalboatrum)、大_花輪枝抱菌(Verticillumdahlie)、Arthromycesramosus(FERMP-7754)>Caldariomycesfumago、紙單隔抱(Ulocladiumchartarum)、Embellisiaalii或Dreschlerahalodes。[0300]其它優(yōu)選的真菌包括屬于擔(dān)子菌亞門(mén)(subdivisionBasidiomycotina)擔(dān)子菌綱(classBasidiomycetes)的菌株,例如鬼傘屬、Phanerochaete屬、革蓋菌屬或栓菌屬,特別是Coprinuscinereusf.microsporus(IF08371)、長(zhǎng)根鬼傘(Coprinusmacrorhizus)、Phanerochaetechrysosporium(例如NA-12)或栓菌屬(以前稱(chēng)為多孔菌屬(Polyporus)),例如T.versicolor(例如PR428-A)。[0301]其它優(yōu)選的真菌包括屬于接合菌亞門(mén)(subdivisionZygomycotina)Mycoraceae綱的菌株，例如根霉屬或毛霉屬，特別是凍土毛霉(Mucorhiemalis)。[0302]—些優(yōu)選的細(xì)菌包括放線(xiàn)菌目(orderActinomycetales)的菌株，例如類(lèi)球形鏈霉菌(Streptomycesspheroides)(ATTC23965)、熱紫鏈霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)(IF012382)或輪枝鏈霉菌輪枝亞種(Streptoverticillumverticilliumssp.Verticillium)。[0303]其它優(yōu)選的細(xì)菌包括類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)、Rhodomonaspalustr1、乳鏈球菌(Streptococcuslactis)、Pseudomonaspurrocinia(ATCC15958)、突光假單胞菌(NRRLB-11)和芽孢桿菌屬菌株，例如短小芽孢桿菌(ATCC12905)和嗜熱脂肪芽孢桿菌。[0304]其它優(yōu)選的細(xì)菌包括屬于粘球菌屬(Myxococcus)的菌株，例如變綠粘球菌(M.virescens)。[0305]過(guò)氧化物酶也可以是通過(guò)如下方法產(chǎn)生的一種，所述方法包括在培養(yǎng)基中在允許過(guò)氧化物酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述重組DNA載體攜帶編碼過(guò)氧化物酶的DNA序列以及用于表達(dá)編碼過(guò)氧化物酶的DNA序列的DNA序列，并從培養(yǎng)物中回收過(guò)氧化物酶。[0306]在一個(gè)優(yōu)選的方面，重組產(chǎn)生的過(guò)氧化物酶是源自鬼傘菌種的過(guò)氧化物酶，特別是根據(jù)W092/16634的長(zhǎng)根鬼傘或灰蓋鬼傘。[0307]在本發(fā)明中，具有過(guò)氧化物酶活性的化合物包含過(guò)氧化物酶和源自細(xì)胞色素、血紅蛋白或過(guò)氧化物酶的過(guò)氧化物酶活性片段。[0308]一個(gè)過(guò)氧化物酶單位(POXU)是在如下條件下每分鐘催化轉(zhuǎn)化Iymole過(guò)氧化氫的酶量，所述條件為于30°C，在0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.0、0.88mM過(guò)氧化氫、和1.67mM2,2’-連氣基-二(3-乙基苯并喔唑琳-6-石黃酸鹽)(2，2，-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate))(ABTS)。監(jiān)測(cè)反應(yīng)60秒(混合后15秒)，即418nm吸光度的改變，它應(yīng)在0.15至0.30的范圍內(nèi)。為了計(jì)算活性，使用氧化ABTS的吸光系數(shù)36mm_1cm_1和化學(xué)計(jì)量關(guān)系每氧化2μmoleABTS轉(zhuǎn)化IμmoleH2O2。[0309]SB[0310]在本發(fā)明中，漆酶和漆酶相關(guān)酶包括歸入ECl.10.3.2的任何漆酶、歸入ECl.10.3.1的任何兒茶酚氧化酶、歸入ECl.3.3.5的任何膽紅素氧化酶、或歸入ECl.14.18.1的任何一元酚單加氧酶。[0311]上文所述酶可以是微生物的，即得自細(xì)菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)，或者它們可源自植物。[0312]來(lái)自真菌的合適實(shí)例包括得自如下菌株的漆酶:曲霉屬，脈孢菌屬，例如粗糙脈孢菌，柄孢殼屬(Podospora)，葡萄孢屬(Botrytis),金錢(qián)菌屬(Collybia),層孔菌屬(Fomes),香燕屬(Lentinus),側(cè)耳屬，栓菌屬，例如T.villosa和T.versicolor,絲核菌屬，例如立枯絲核菌，鬼傘屬，例如灰蓋鬼傘、毛頭鬼傘(C.comatus)、費(fèi)賴(lài)斯鬼傘(C.friesii)和裙紋鬼傘(C.plicatilis),小脆柄燕屬(Psathyrella),例如黃蓋小脆柄燕(P.condelleana),斑裙燕屬(Panaeolus),例如蝶形斑裙燕(P.papiIionaceus),毀絲霉屬，例如嗜熱毀絲霉，Schytalidium屬,例如S.thermophilum,多孔菌屬,例如P.pinsitus,密孔菌屬(Pycnoporus),例如朱紅密孔菌(P.cinnabarinus),射脈菌屬(Phlebia),例如射脈菌(P.radita)(W092/01046)，或革蓋菌屬，例如毛革蓋菌(JP2-238885)。[0313]來(lái)自細(xì)菌的合適實(shí)例包括得自芽孢桿菌菌株的漆酶。[0314]優(yōu)選得自鬼傘屬、毀絲霉屬、多孔菌屬、密孔菌屬、柱頂孢屬或絲核菌屬的漆酶；特別是得自灰蓋鬼傘、嗜熱毀絲霉、Polyporuspinsitus、朱紅密孔菌、嗜熱柱頂孢或立枯絲核菌的漆酶。[0315]商品化漆酶有NS51001(Polyporuspinsitius漆酶,可從NovozymesA/S獲得)和NS51002(嗜熱毀絲霉漆酶，可從NovozymesA/S獲得)。[0316]漆酶或漆酶相關(guān)酶也可以是通過(guò)如下方法產(chǎn)生的一種，所述方法包括在培養(yǎng)基中在允許漆酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述重組DNA載體攜帶編碼漆酶的DNA序列以及用于表達(dá)編碼漆酶的DNA序列的DNA序列，并從培養(yǎng)物中回收漆酶。[0317]漆酶活性(LACU)由需氧條件下于pH5.5的丁香醒連氮(syringaldazin)氧化來(lái)測(cè)定。產(chǎn)生的紫顏色在530nm用光度計(jì)測(cè)定。分析條件為19mM丁香醛連氮、23mM乙酸鹽緩沖液pH5.5，30°C，I分鐘反應(yīng)時(shí)間。一個(gè)漆酶單位(LA⑶)是上述條件下每分鐘催化1.0μmole丁香醛連氮轉(zhuǎn)化的酶量。[0318]漆酶活性(LAMU)由需氧條件下于pH7.5的丁香醛連氮氧化來(lái)測(cè)定。產(chǎn)生的紫顏色在530nm用光度計(jì)測(cè)定。分析條件為19mM丁香醛連氮、23mMTris/馬來(lái)酸鹽pH7.5，30°C，I分鐘反應(yīng)時(shí)間。一個(gè)漆酶單位(LAMU)是上述條件下每分鐘催化1.0μmole丁香醛連氮轉(zhuǎn)化的酶量。[0319]本發(fā)明的多肽可以聯(lián)合上文所述酶和/或分解纖維素的蛋白質(zhì)用于進(jìn)一步降解生物材料底物的纖維素組分(參見(jiàn)例如Brigham等人，1995,在《HandbookonBioethanol》中，CharlesE.Wyman編，pp.119-141,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Lee,1997,JournalofBiotechnology56:1_24)。[0320]洗滌劑組合物[0321]本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽可添加到洗滌劑組合物中并因此成為它的一種組分。[0322]例如，可以將本發(fā)明的洗滌劑組合物配制成手洗或機(jī)洗洗衣洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理污染織物的洗衣添加劑組合物和漂洗時(shí)添加的織物柔軟劑組合物，或配制成用于普通家庭硬面清洗操作的洗滌劑組合物，或配制成用于手洗或機(jī)洗洗碟操作的洗滌劑組合物。[0323]在一個(gè)具體的方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物中可包含一種或多種其它的酶，諸如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)、和/或過(guò)氧化物酶。[0324]通常，所選酶的性質(zhì)應(yīng)該與所選洗滌劑相容(即最佳pH、與其它酶和非酶組分的相容性等等)，并且所述酶應(yīng)該以有效量存在。[0325]纖維素酶:適宜的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌起源的那#。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。適宜的纖維素酶包括來(lái)自下列屬的纖維素酶:芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、Acremonium屬，例如在US4,435,307、US5,648,263、US5,691，178、US5,776，757、和W089/09259中公開(kāi)的由Humicolainsolens、嗜熱毀絲霉、和尖孢鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。[0326]尤其適宜的纖維素酶是有益于保護(hù)顏色的堿性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實(shí)例有EP0495257、EP0531372、W096/11262、W096/29397、W098/08940中描述的纖維素酶。其它實(shí)例有諸如在W094/07998、EP0531315、US5,457，046、US5,686，593、US5,763，254、W095/24471、W098/12307、和PCT/DK98/00299中描述的纖維素酶變體。[0327]市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)到的纖維素酶包括Celluzyme?和Carezyme?(NovozymesA/S)、Clazinase?和PuradaxHA?(GenencorInternationalInc.)、及KAC-500(B)?(KaoCorporation)。[0328]蛋白酶:適宜的蛋白酶包括那@動(dòng)物、棺物或微牛物起源的。優(yōu)選微生物起源的。包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶，尤其是那些來(lái)源于芽孢桿菌屬的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、和枯草桿菌蛋白酶168(描述在W089/06279中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如起源于豬或牛的)和鐮孢屬蛋白酶(描述于W089/06270和W094/25583中)。[0329]有用的蛋白酶的實(shí)例是W092/19729、TO98/20115、TO98/20116、和TO98/34946中所描述的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)如下位置發(fā)生替代的變體:27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274。[0330]優(yōu)選的市場(chǎng)上可買(mǎi)到的蛋白酶包括Alcalase?、Savinase?、Primase?、Duralase?、Esperase?和Kannase?(NovozymesA/S)、Maxatase?、Maxacal?、Maxapem?、Properase?>Purafect?>Purafect0xP?、FN2?和FN3?(GenencorInternationalInc.)。[0331]脂肪酶:適宜的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌起源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或經(jīng)蛋白質(zhì)工程改造的變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬(同義詞嗜熱霉屬Thermomyces)的月旨肪酶，例如EP258068和EP305216中所描述的H.lanuginosa(T.1anuginosus)或W096/13580中所描述的H.1nsolens;假單胞菌屬脂肪酶，例如產(chǎn)堿假單胞菌(P.alkaligenes)或類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、蔥頭假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GBl,372，034)、突光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌種菌株SD705(W095/06720)和W096/27002)、P.wisconsinensis(W096/12012);芽孢桿菌屬脂肪酶，例如枯草芽抱桿菌(Dartois等人，1993,BiochemicaetBiophysicsActa,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(JP64/744992)、或短小芽孢桿菌(W091/16422)。[0332]其它實(shí)例有諸如在W092/05249、W094/01541、EP407225、EP260105、W095/35381、W096/00292、W095/30744、W094/25578、W095/14783、W095/22615、W097/04079、和W097/07202中所描述的脂肪酶變體。[0333]優(yōu)選的市場(chǎng)上可買(mǎi)到的脂肪酶包括Lipolase?和LipolaseUltra?(NovozymesA/S)。[0334]淀粉酶:適宜的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌和真菌起源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。淀粉酶包括例如芽孢桿菌屬例如地衣芽孢桿菌特定菌株來(lái)源的α-淀粉酶，詳細(xì)說(shuō)明描述在GBl，296，839中。[0335]有用的淀粉酶的實(shí)例是在W094/02597、W094/18314、W096/23873、和W097/43424中所描述的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)如下位置發(fā)生替代的變體:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。[0336]市場(chǎng)上可買(mǎi)到的淀粉酶有Duramyl?、Termamyl?、Fungamyl?和BAN?(NovozymesA/S)、Rapidase?和Purastar?(GenencorInternationalInc.)。[0337]過(guò)氧化物酶/氧化酶:適宜的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括源自植物、細(xì)菌、或真菌的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的實(shí)例包括來(lái)自鬼傘屬例如灰蓋鬼傘的過(guò)氧化物酶及其變體，如在W093/24618、W095/10602、和W098/15257中所描述的那些。[0338]市場(chǎng)上可買(mǎi)到的過(guò)氧化物酶包括Guardzyme?(NovozymesA/S)。[0339]可通過(guò)添加含一種或多種酶的獨(dú)立的添加劑或通過(guò)添加包含所有這些酶的組合添加劑將酶組分包括在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即獨(dú)立的添加劑或組合添加劑，可配制成例如顆粒、液體、漿體等形式。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑為顆粒劑，特別是非粉化的顆粒劑；液體，特別是穩(wěn)定的液體；或漿體。[0340]例如可如在美國(guó)專(zhuān)利US4，106,991和4，661，452中所公開(kāi)的方法制備非粉化顆粒劑，并可任選使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實(shí)例有平均摩爾質(zhì)量為1000-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG);具有16-50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；具有15-80個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇，其中醇含12-20個(gè)碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單_、雙-和三甘油酯。GB1483591中給出了適于通過(guò)流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實(shí)例。例如，液體酶制備物可根據(jù)既定的方法通過(guò)加入多元醇諸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來(lái)穩(wěn)定。受保護(hù)的酶可根據(jù)EP238，216中所公開(kāi)的方法制備。[0341]本發(fā)明的洗滌劑組合物可采用任一種方便的形式，例如條、片、粉末、顆粒、膏、或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含可高達(dá)70%的水和0-30%的有機(jī)溶劑，或者是不含水的。[0342]洗滌劑組合物可含有一種或多種表面活性劑，可以是非離子的，包括半極性和/或陰離子和/或陽(yáng)離子和/或兩性離子的。表面活性劑的含量一般為以重量計(jì)的0.1%-60%。[0343]當(dāng)洗滌劑包含陰離子表面活性劑時(shí)，它通常含有大約1%到大約40%的陰離子表面活性劑，諸如線(xiàn)狀的烷基苯磺酸酯、α-石蠟磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、二級(jí)烷基磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或皂。[0344]當(dāng)洗滌劑中包含非離子型表面活性劑時(shí)，它通常含有大約0.2%到大約40%的非離子型表面活性劑，諸如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。[0345]洗滌劑可包含0-65%的洗滌劑助洗劑或絡(luò)合劑，諸如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽、或?qū)訝罟杷猁}(例如購(gòu)自Hoechst的SKS-6)。[0346]洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實(shí)例有羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯諸如聚丙烯酸酯、馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。[0347]洗滌劑可包含漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)可含有H2O2來(lái)源諸如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，可將其與形成過(guò)酸的漂白活化劑諸如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ趸交撬狨ハ嘟M合。或者，漂白系統(tǒng)可包含過(guò)氧酸，例如酰胺、亞胺、或砜型。[0348]可使用常規(guī)的穩(wěn)定劑穩(wěn)定本發(fā)明洗滌劑組合物的酶，例如多元醇，諸如丙二醇或丙三醇；糖或糖醇；乳酸；硼酸，或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物諸如4-甲酰苯基硼酸；且所述的組合物可如W092/19709和W092/19708中所描述的方法來(lái)配制。[0349]洗滌劑還可包含其它的常規(guī)洗滌劑成分，諸如包括粘土的織物調(diào)節(jié)劑、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑、防蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染色劑、殺菌劑、光漂白劑、水溶助長(zhǎng)劑、晦暗抑制劑、或芳香劑。[0350]在洗滌劑組合物中，任何酶都可以相當(dāng)于每升洗滌液0.01-1OOmg酶蛋白質(zhì)的量加入，優(yōu)選每升洗漆液0.05-5mg酶蛋白質(zhì),特別是每升洗漆液0.1-1mg酶蛋白質(zhì)。[0351]在清潔劑組合物中，本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽可以相當(dāng)于每升洗滌液0.0Ol-1OOmg蛋白質(zhì)、優(yōu)選0.005-50mg蛋白質(zhì)、更優(yōu)選0.01-25mg蛋白質(zhì)、甚至更優(yōu)選0.05-10mg蛋白質(zhì)、最優(yōu)選0.05-5mg蛋白質(zhì)、且甚至最優(yōu)選0.01-1mg蛋白質(zhì)的量加入。[0352]還可將本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽添加到如W097/07202所公開(kāi)的洗滌劑制劑中，這里收入所述文獻(xiàn)作為參考。[0353]其他用途[0354]一般而言，可以通過(guò)補(bǔ)充本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽來(lái)增強(qiáng)對(duì)任何植物細(xì)胞壁材料的處理。[0355]信號(hào)肽[0356]本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因且該基因與如下核苷酸序列可操作連接的核酸構(gòu)建體，所述核苷酸序列由SEQIDNO:1第I至66位核苷酸組成并編碼由SEQIDNO:2第I至22位氨基酸組成的、容許所述蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中的信號(hào)肽，其中所述基因?qū)τ谒龊怂嵝蛄卸允峭庠吹?。[0357]本發(fā)明還涉及含有這種核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。[0358]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞；并(13)回收所述蛋白質(zhì)。[0359]對(duì)宿主細(xì)胞所述蛋白質(zhì)可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”在本文中不是指規(guī)定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，而是涵蓋肽、寡肽、和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”還涵蓋兩種或多種多肽組合形成編碼產(chǎn)物。蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，它包括來(lái)自于至少兩種不同蛋白質(zhì)的部分或完整多肽序列的組合，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞可以是異源的或天然的。蛋白質(zhì)還包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白的天然存在的等位和改造(engineered)變異。[0360]優(yōu)選的是，蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報(bào)道分子。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。[0361]所述基因可從任何原核的、真核的、或其它來(lái)源中獲得。[0362]本發(fā)明可通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例[0363]材料[0364]用作緩沖液和底物的化學(xué)制品至少是試劑級(jí)的商品。[0365]菌株[0366]使用橙色嗜熱子囊菌菌株NN044936T002-5作為具有增強(qiáng)分解纖維素活性的GH61家族多肽的來(lái)源。使用米曲霉JaL250菌株(W099/61651)來(lái)表達(dá)具有增強(qiáng)分解纖維素活性的橙色嗜熱子囊菌多肽。[0367]培養(yǎng)基[0368]用于橙色嗜熱子囊菌的常規(guī)涂板和培養(yǎng)的固體馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)基的組成是每升39克馬鈴薯右旋糖瓊脂(DifcoBDBiosciences,FranklinLakes,NJ)。用于橙色嗜熱子囊菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的組成是每升24克馬鈴薯右旋糖肉湯。[0369]Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的組成是每升IOg胰胨、5g酵母提取物、和IOgNaCl。同樣也制備用于涂布的LB培養(yǎng)基，只是每升添加15g瓊脂。將5’-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal;GoldBiotechnology,Louis,MO)以每毫升40μg的儲(chǔ)液濃度溶解在N，N’-二甲基甲酰胺中，常規(guī)涂布在LB平板上用于差異菌落篩選。氨芐青霉素以每升50-100mg的終濃度添加到LB培養(yǎng)基中，用于選擇性生長(zhǎng)條件。[0370]NNCYP培養(yǎng)基的組成是每升5.0gNH4N03、0.5gMgSO4.7Η20、0.3gCaCl2、2.5g檸檬酸、5.0g細(xì)菌蛋白胨、1.0g酵母提取物、COVE痕量金屬、和足夠的K2HPO4以達(dá)到最終pH大約5。Cove痕量金屬溶液的組成是每升0.04gNa2B4O7.10Η20、0.4gCuSO4.5Η20、1.2gFeSO4.7Η20、0.7gMnSO4.H2O,0.8gNa2MoO2.2H20、和IOgZnSO4.7H20。[0371]實(shí)施例1:基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建[0372]從橙色嗜熱子囊菌生長(zhǎng)的PDA平板上取一塊瓊脂，接種裝有200ml含3%葡萄糖、pH5.0的NNCYP培養(yǎng)基的500毫升帶擋板燒瓶。將培養(yǎng)物于45°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)速170rpm。通過(guò)Whatman#l濾紙(WhatmanInc,CliftonNJ)過(guò)濾收集菌絲體并在液氮中冷凍。在已冷卻的研缽中將冷凍的菌絲體研磨成粉末并分裝到帶螺旋帽的試管中。將粉末懸浮在總體積40ml的含0.5%十二烷基硫酸鋰和0.5mMEDTA的50mMCAPS-NaOH緩沖液中。將懸浮液置于60°C并周期性地顛倒混合2小時(shí)。再加入等體積的經(jīng)中和的苯酚:氯仿(1:1)，并將試管在轉(zhuǎn)臺(tái)上于37°C混合2小時(shí)。在SorvalIHlOOOB轉(zhuǎn)頭(Kendro，Ashevi11e，NC)中以2500rpm離心10分鐘后，再提取出水相并如上所述進(jìn)行離心。向第二次抽提的水相加入乙酸銨至2.5M并置于-20°C直到凍結(jié)。融化后，將提取物以15，OOOXg離心20分鐘。棄去沉淀物，通過(guò)添加0.7倍體積的異丙醇使上清液中的核酸沉淀。以15，OOOXg離心后，將沉淀物用70%乙醇漂洗三次，風(fēng)干，并溶于1.0ml0.1XTE中。通過(guò)添加乙酸銨到2.0M和乙醇到63%使溶解的沉淀物再一次沉淀。將沉淀物用70%乙醇漂洗兩次，干燥，并溶于200μ10.1XTE中。一旦溶解，向DNA加KCl到20mM。[0373]利用TOPO?ShotgunSubcloningKit即亞克隆試劑盒(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)構(gòu)建橙色嗜熱子囊菌的基因組文庫(kù)。根據(jù)制造商的推薦,在IS氣下通過(guò)噴霧隨機(jī)剪切基因組DNA。通過(guò)TAE緩沖液中1%瓊脂糖凝膠上的制備性凝膠電泳，挑選2.5-5.0kb大小的插入物。[0374]根據(jù)制造商的說(shuō)明，將基因組DNA克隆到pCRK4Blunt-T0P0中，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10細(xì)胞(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)。通過(guò)在上文所述補(bǔ)充有氨節(jié)青霉素和X-Gal的LB瓊脂上的初始涂布，估計(jì)產(chǎn)生了大約64，000個(gè)克隆。在測(cè)定重組克隆的滴度后立即擴(kuò)增文庫(kù)。將每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)用于接種200ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。然后于37°C過(guò)夜培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)物至飽和，再通過(guò)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA并利用QiagenPlasmidMaxi試劑盒進(jìn)行純化。[0375]隨后將擴(kuò)增的文庫(kù)通過(guò)再轉(zhuǎn)化并將大腸桿菌T0P10細(xì)胞涂布在上文所述補(bǔ)充有氨芐青霉素和X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上來(lái)產(chǎn)生用于克隆分離克隆的菌落。根據(jù)制造商的說(shuō)明，利用Q-Pix機(jī)械臂進(jìn)行菌落挑取。最初將總共22，353個(gè)單獨(dú)的菌落挑取到96孔板中，然后在上文培養(yǎng)基部分概述的選擇性條件下培養(yǎng)，并于_80°C以甘油原種的形式保存。[0376]實(shí)施例2:滾環(huán)擴(kuò)增和微陣列的印制[0377]開(kāi)發(fā)了用于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和產(chǎn)物稀釋的機(jī)械臂法，以用于BiomekFX機(jī)械臂(BeckmanCoulter,Brea,CA)。將TempliPhiDNA測(cè)序模板擴(kuò)增試劑盒(AmershamBiosciencesCorp.,Piscataway,NJ)用于RCA,并在機(jī)械臂法中遵照制造商的方案。[0378]對(duì)來(lái)自文庫(kù)的9，972個(gè)克隆進(jìn)行RCA反應(yīng)。從文庫(kù)的9，600個(gè)RCA產(chǎn)物中制備出雙份384孔稀釋平板(Genemate,Kaysville,UT),并將這些克隆印在聚L-賴(lài)氨酸包被的載玻片上從而得到微陣列，每個(gè)微陣列呈現(xiàn)大約33Mb克隆的DNA。另外，將橙色嗜熱子囊菌cbhl(登記號(hào)AX657575)和xynA(登記號(hào)AJ132635)基因點(diǎn)在上面作為陽(yáng)性對(duì)照，并包括空的pCR:K4Blunt-T0P0載體和從未轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞制備的RCA作為陰性對(duì)照。利用美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，807，522描述的方法進(jìn)行陣列印制。[0379]實(shí)施例3:發(fā)酵和RNA提取[0380]所有的發(fā)酵都是在2升Applikon發(fā)酵罐中進(jìn)行的，分批補(bǔ)料5.2%(w/v)葡萄糖或5.2%纖維素碳源。基礎(chǔ)培養(yǎng)基是NNCYP，且纖維素培養(yǎng)物還含有0.4%葡萄糖以促進(jìn)初始細(xì)胞生長(zhǎng)。在發(fā)酵期間通過(guò)添加氫氧化銨或磷酸來(lái)控制pH。發(fā)酵于42°CpH5進(jìn)行大約120小時(shí)。在接種后第1-5天采取菌絲體樣品。通過(guò)Miracloth?(Calbiochem,SanDiego,CA)過(guò)濾迅速?gòu)呐囵B(yǎng)基中分離菌絲體樣品，然后在液氮中冷凍并保存于_80°C。[0381]遵照制造商的方案，用FastRNAli試劑盒(Q.BIOgene,Carlsbad,CA)從菌絲體樣品中提取RNA。通過(guò)在TBE緩沖液中在1%瓊脂糖凝膠上于55V進(jìn)行1-1.5小時(shí)的電泳，或通過(guò)使用Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)進(jìn)行的毛細(xì)管電泳分析，評(píng)估RNA的質(zhì)量。通過(guò)紫外分光光度法和/或Agilent2100生物分析儀的分析進(jìn)行定量測(cè)定。只有來(lái)自發(fā)酵第2、3和4天的樣品一貫產(chǎn)生足夠品質(zhì)以用于微陣列實(shí)驗(yàn)的RNA。[0382]實(shí)施例4:熒光探針構(gòu)建和微陣列雜交[0383]橙色嗜熱子囊菌樣品的低RNA產(chǎn)量必需利用線(xiàn)性放大方法(aRNA擴(kuò)增)以產(chǎn)生足夠數(shù)量以用于微陣列雜交的RNA。遵循制造商的說(shuō)明，用氨基烯丙基MessageAmp?aRNA試劑盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)進(jìn)行RNA的擴(kuò)增和突光標(biāo)記。[0384]簡(jiǎn)單的說(shuō)，通過(guò)以T701igo(dT)引發(fā)的反轉(zhuǎn)錄，從2yg總RNA產(chǎn)生cDNA第一鏈。隨后用T7啟動(dòng)子引物合成cDNA第二條鏈。純化雙鏈cDNA，并加到體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中以產(chǎn)生aRNA的多拷貝。氨基烯丙基-dUTP在體外轉(zhuǎn)錄中摻入aRNA，便于隨后熒光花青染料的標(biāo)記。純化所得aRNA,并根據(jù)制造商的說(shuō)明，通過(guò)將Cy3和Cy5突光團(tuán)(CyeDyePost標(biāo)記反應(yīng)染料，AmershamPharmaciaBiotech,ArlingtonHeights,IL)直接偶聯(lián)到aRNA上的經(jīng)氨基烯丙基修飾的UTP殘基上來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。[0385]將熒光探針合并，純化，并在真空下干燥，然后將其重懸浮于15.5μI水中并加入:3.6μ120ΧSSC,2.5μ1250mMHEPES(ρΗ7.0)、1.8μIpoly-dA(500μg/ml)、和0.54μ110%SDSo雜交前，用0.22μm濾器過(guò)濾溶液，加熱至100°C2分鐘并冷卻至室溫。[0386]在蓋玻片下，將探針(Cy3_和Cy5_標(biāo)記的aRNA各5μg)施加到微陣列上，并置于濕潤(rùn)的小室中。于63°C雜交過(guò)夜(15-16小時(shí))。掃描前，將陣列用含0.03%SDS的IXSSC、0.2XSSC、和0.05XSSC連續(xù)順序洗滌，并在桌面式離心機(jī)(SorvallR7，RTH-250轉(zhuǎn)子；Asheville,NC)中以500rpm離心2分鐘以除去多余的液體。[0387]用AxonGenePix?4000B掃描儀(AxonInstruments,Inc.,UnionCity,CA)對(duì)微陣列載玻片進(jìn)行成像。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明用GenePix?Pro5.0軟件進(jìn)行影像和數(shù)據(jù)分析。用GenePix?軟件測(cè)量微陣列斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值，并在減去默認(rèn)背景后計(jì)算每個(gè)斑點(diǎn)的Cy5與Cy3強(qiáng)度的比值。挑選重復(fù)陣列中Cy5/Cy3的強(qiáng)度比為2.0或更大的斑點(diǎn)用于DNA序列分析。[0388]微陣列分析后，從保存于-80°C的甘油細(xì)胞懸液中挑選并分離感興趣的克隆。通過(guò)堿裂解法制備用于測(cè)序的DNA。用位于pCRK4Blunt-T0P0載體的多接頭側(cè)翼的T7和M13反向引物(MWGBiotech,Inc.,HighPoint,NC)對(duì)每個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。用全新的序列設(shè)計(jì)引物，以延長(zhǎng)已知序列，隨后通過(guò)此引物步移策略得到全長(zhǎng)克隆。首先在DNA水平上利用blast(η)算法(Altschul等人，1990,JournalofMolecularBiology215:403-410)尋找同一性。隨后將DNA序列在六個(gè)可能的讀碼框中的假定翻譯物與公眾數(shù)據(jù)庫(kù)(例如SwissProt、SwalI>Trembl、Genpept和GeneseqP)條目利用fasty(Pearson等人，1997,Genomics46:24-36)和tblast(x)(Altschul等人，1990,同上)進(jìn)行對(duì)比。[0389]實(shí)施例5:PAlLo2表達(dá)載體的構(gòu)建[0390]表達(dá)載體pAILol是通過(guò)修飾pBANe6(美國(guó)專(zhuān)利6，461，837)而構(gòu)建的，它包含NA2-tpi啟動(dòng)子、黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子序列(AMG終止子)、和構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)。pBANe6的修飾是如下進(jìn)行的，即首先通過(guò)定點(diǎn)誘變從amdS選擇標(biāo)記除去位于2051、2722、和3397bp位置的三個(gè)NcoI限制位點(diǎn)。所有改變?cè)O(shè)計(jì)為“沉默的”，使得amdS基因的實(shí)際蛋白質(zhì)序列不改變。三個(gè)位點(diǎn)的清除是利用GeneEditor定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Promega,Madison,WI)根據(jù)制造商的說(shuō)明使用下面的引物(標(biāo)有下劃線(xiàn)的核苷酸代表改變的喊基)同時(shí)進(jìn)行的:[0391]AMDS3NcoMut(2050):[0392]5，-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQIDNO:3)[0393]AMDS2NcoMut(2721):[0394]5，-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQIDNO:4)[0395]AMDSlNcoMut(3396):[0396]5，-GGAGGCCATGMGTGGACCAACGG-3’(SEQIDNO:5)[0397]然后將包含所有三種期望序列改變的質(zhì)粒利用QuickChange誘變?cè)噭┖?Stratagene,LaJolla,CA)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以消除位于第1643位的AMG終止子末端的NcoI限制位點(diǎn)。將下列引物(標(biāo)有下劃線(xiàn)的核苷酸代表改變的堿基)用于誘變:[0398]用于誘變黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)終止子序列的上游引物:[0399]5，-CACCGTGAAAGCCATG￡TCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQIDNO:6)[0400]用于誘變黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)終止子序列的下游引物:[0401]5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGA￡CATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQIDNO:7)[0402]修飾pBANe6的最后一步是利用QuickChange誘變?cè)噭┖泻拖铝幸?標(biāo)有下劃線(xiàn)的核苷酸代表改變的堿基)在多接頭始端插入一個(gè)新的NcoI限制位點(diǎn)，從而產(chǎn)生pAILol(圖2)。[0403]用于誘變黑曲霉淀粉酶啟動(dòng)子(NA2_tpi)的上游引物:[0404]5，-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3，(SEQIDNO:8)[0405]用于誘變黑曲霉淀粉酶啟動(dòng)子(NA2_tpi)的下游引物:[0406]5，-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3，(SEQIDNO:9)[0407]用構(gòu)巢曲霉pyrG基因替換pAILol的amdS基因。將質(zhì)粒pBANelO(圖3)用作pyrG基因的來(lái)源。分析pBANelO的序列表明pyrG標(biāo)記包含在NsiI限制片段中，并且不含NcoI或PacI限制位點(diǎn)。因?yàn)閍mdS的也為NsiI限制位點(diǎn)所側(cè)翼包夾，所以用于轉(zhuǎn)換選擇標(biāo)記的策略是進(jìn)行NsiI限制片段的簡(jiǎn)單替換。用限制酶NsiI消化來(lái)自pAILol和pBANelO的質(zhì)粒DNA，并利用標(biāo)準(zhǔn)程序通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化產(chǎn)物。將源自pBANelO的含有pyrG基因的NsiI片段連接到pAILol骨架中以替換包含amdS基因的原始NsiIDNA片段。通過(guò)限制消化分析重組克隆以測(cè)定它們是否含有正確的插入片段和方向是否正確。選擇以反時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄PyrG基因的克隆。新的質(zhì)粒稱(chēng)為pAILo2(圖4)。[0408]實(shí)施例6:米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建[0409]設(shè)計(jì)如下的兩條合成寡核苷酸引物，從編號(hào)3基因組克隆PCR擴(kuò)增編碼假定GH61A家族的橙色嗜熱子囊菌基因。無(wú)需限制消化和連接，使用InFusion克隆試劑盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA)將片段直接克隆到表達(dá)載體pAILo2中。[0410]正向引物:5，-CACAACTGGATTTACCATGTCCTTTTCCAAG_3，(SEQIDNO:10)[0411]反向引物:5’-AGTCACCTCTAGTTATTAACCAGTATACAG-3’(SEQIDNO:11)[0412]粗體字母代表編碼序列。剩余序列與pAILo2的插入位點(diǎn)是同源的。[0413]將上述每種引物各200pmol用于終體積50μ1的PCR反應(yīng)，其組成是代表含有GH61A編碼序列的原始橙色嗜熱子囊菌編號(hào)3基因組克隆的DNAUOmMKCl、20mMTris-HClρΗ8.8、10mM(NH4)2S04、2mMMgS04、0.l%TritonΧ_100、200μI每種脫氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)、和2個(gè)`單位VentR'KDNA聚合酶(所有PCR相關(guān)的酶和試劑都來(lái)自NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA)。擴(kuò)增條件為I個(gè)循環(huán)的95°CI分鐘；30個(gè)循環(huán)每個(gè)94°C30秒、50°C30秒、72°CI分鐘；及最后一個(gè)循環(huán)72°C7分鐘。然后將加熱塊轉(zhuǎn)到4°C浸泡(soak)循環(huán)。[0414]然后用InFusion克隆試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明將片段克隆到pAILo2表達(dá)載體中。用NcoI和PacI在制造商推薦的條件下消化載體。用MinElute?ReactionCleanupKit(QIAGEN，Valencia，CA)純化片段。將基因片段和線(xiàn)性化載體在反應(yīng)中連接起來(lái)，產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pDZA2(圖5)，其中GH61A家族基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動(dòng)子的控制之下。質(zhì)粒PDZA2缺失pAlLo2的152bp。連接反應(yīng)含有大約IOOng經(jīng)NcoI和PacI消化的pAlLo2及IOOng純化的橙色嗜熱子囊菌GH61APCR產(chǎn)物。連接條件按照Infusion克隆試劑盒制造商的方案。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級(jí)感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene,LaJolla,CA)。通過(guò)對(duì)由大腸桿菌純化的質(zhì)粒的GH61A編碼序列進(jìn)行DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)構(gòu)建體的身份。將一個(gè)含有重組質(zhì)粒的克隆命名為大腸桿菌PDZA2-7。[0415]實(shí)施例7:編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的GH61家族多肽的橙色嗜熱子囊菌基因組序列的鑒定[0416]使用AppliedBiosystems3700型自動(dòng)DNA測(cè)序儀利用3.1版BigDye終止物化學(xué)法和dGTP化學(xué)法(AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity,CA)和引物步移策略對(duì)橙色嗜熱子囊菌GH61A基因組克隆15進(jìn)行DNA測(cè)序。利用VectorNTI8套裝軟件包(Informax,Inc.,Frederick,MD)的ContigExpress組件裝配和比較核苷酸序列。[0417]圖1顯示了具有增強(qiáng)分解纖維素活性的橙色嗜熱子囊菌多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。該編碼序列編碼250個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該編碼序列有799bp，包含終止密碼子，中間有46bp的單一內(nèi)含子。編碼區(qū)有48.7%的G+C。利用SignalP程序(Nielsen等人，1997，ProteinEngineeringlO:1-6),預(yù)測(cè)了22個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，表明成熟多肽含有228個(gè)氨基酸。[0418]利用blastp算法(Higgins,1989,同上)使用ParacelBioViewWorkbench軟件(Paracel,Pasadena,CA)及blosum62矩陣測(cè)定了氨基酸序列的比較性對(duì)比。成對(duì)比對(duì)參數(shù)采用的是缺口罰分，存在(existence):11和延伸(extension):1。該比對(duì)表明編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的GH61家族多肽的橙色嗜熱子囊菌基因的推導(dǎo)氨基酸序列與來(lái)自構(gòu)巢曲霉推測(cè)蛋白AN1041.2(登錄號(hào)EAA65609)、構(gòu)巢曲霉推測(cè)蛋白AN7891.2(登錄號(hào)EAA59545)、和構(gòu)巢曲霉推測(cè)蛋白AN9524.2(登錄號(hào)EAA66740)的61家族蛋白質(zhì)推導(dǎo)氨基酸序列分別享有67%、63%、和58%的同一性。[0419]含有質(zhì)粒pDZA2_7的大腸桿菌XLl-Blue(Stratagene,LaJolla,CA)保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專(zhuān)利培養(yǎng)物保藏中心，北方區(qū)域研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604)，保藏編號(hào)NRRLB-30704，保藏日期2004年I月30日。[0420]實(shí)施例8:編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的GH61A家族多肽的橙色嗜熱子囊菌基因在米曲霉JaL250中的表達(dá)[0421]根據(jù)Christensen等人，1988,Bio/Technology6:1419-1422的方法制備米曲霉JaL250原生質(zhì)體。用大約1.5μgpDZA2轉(zhuǎn)化米曲霉JAL250。以質(zhì)粒pAILo2作為對(duì)照。[0422]用pDZA2轉(zhuǎn)化米曲霉JaL250獲得大約11個(gè)轉(zhuǎn)化體。將10個(gè)轉(zhuǎn)化體分離到單獨(dú)的PAD板上。[0423]用5ml0.01%吐溫20洗滌所有轉(zhuǎn)化體的鋪滿(mǎn)的PDA板，分別接種125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養(yǎng)基，并于34°C以250rpm進(jìn)行培養(yǎng)。保溫6天后，使用8_16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)根據(jù)制造商的說(shuō)明分析取自每份培養(yǎng)物的5μI上清液。SDS-PAGE分析顯示，10個(gè)轉(zhuǎn)化體中有9個(gè)轉(zhuǎn)化體的GH61A帶以略微大于25kDa的表觀(guān)分子量進(jìn)行遷移。[0424]實(shí)施例9:具有增強(qiáng)分解纖維素活性的橙色嗜熱子囊菌GH61A的鑒定[0425]在美國(guó)能源部國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn)室(theU.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory,NREL)用稀硫酸對(duì)玉米稻桿進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理?xiàng)l件如下:于190°C，0.048g硫酸/g干生物量，25%w/w干固體，大約I分鐘。根據(jù)NREL，在經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)中不溶于水的固體含有52%纖維素、3.6%半纖維素和29.8%木質(zhì)素。纖維素和半纖維素是利用NREL標(biāo)準(zhǔn)分析程序#002通過(guò)兩級(jí)硫酸水解及后續(xù)高效液相色譜對(duì)糖類(lèi)的分析而測(cè)定的。木質(zhì)素是利用NREL標(biāo)準(zhǔn)分析程序#003在用硫酸水解纖維素和半纖維素成分后通過(guò)重量測(cè)定而測(cè)定的。在酶促水解前，用大量的DDI水洗滌PCS;水洗后的PCS的干重為20.6%。[0426]如實(shí)施例8所述在米曲霉中表達(dá)橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽，將培養(yǎng)液以9500xg離心，然后利用裝備有PMlO膜(Millipore，Billerica,MA)的Amicon攪拌器濃縮上清液，并利用Econo-PaclODG柱(BioRadLaboratories,Hercules,CA)脫鹽。[0427]用1.1mlImmunoware微量試管(Pierce,Rockford,IL)進(jìn)行PCS(每ml50mMρΗ5.0乙酸鈉緩沖液IOmg)水解，總反應(yīng)體積1.0ml0對(duì)橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽測(cè)試其增強(qiáng)纖維素酶制備物水解能力的能力，所述纖維素酶制備物是從NovozymesA/S(Bagsvaerd，丹麥)獲得的、由表達(dá)米曲霉β-葡糖苷酶的瑞氏木霉(W002/095014)發(fā)酵得到的，下稱(chēng)Tr/AoBG0PCS水解的進(jìn)行是采用每克PCS2.5mgTr/AoBG，且每克PCS補(bǔ)充0.2mg橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽。于50°C(TSAutoflowCO2夾套保溫箱)進(jìn)行PCS水解。進(jìn)行兩份同樣的反應(yīng)，而且在水解期間采集小樣。將每份水解產(chǎn)物的20μI小樣與180μ10.1lMNaOH(終止試劑)混和，使PCS水解反應(yīng)終止。對(duì)每份樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪B續(xù)稀釋?zhuān)脤?duì)羥基苯甲酸酰肼(PHBAH,SigmaChemicalC0.,St.Louis,MO)測(cè)定法來(lái)測(cè)定還原糖含量,該測(cè)定法經(jīng)修改適應(yīng)96孔微量滴定板格式，如下所述。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將適當(dāng)稀釋樣品的90μI小樣置于96孔錐底微量滴定板中。向每個(gè)孔中加入60μI溶于2%Na0H的1.5%(w/v)PHBAH以起動(dòng)反應(yīng)。將平板于95°C加熱10分鐘，不加蓋。使平板冷卻至室溫(RT)，并向每個(gè)孔中加入50μI蒸餾Η20。從每個(gè)孔中取出100μI小樣轉(zhuǎn)移到平底96孔板中，并用SpectraMax微板讀數(shù)儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)測(cè)量A41tlnm的吸光率。用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(0.1-0.0125mg/ml，用0.4%氫氧化鈉稀釋)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將得到的A41tol值轉(zhuǎn)換成葡萄糖的相當(dāng)量。用所得的相當(dāng)量計(jì)算每個(gè)反應(yīng)PCS纖維素轉(zhuǎn)化的百分比。[0428]利用下面的方程式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化成還原糖的程度(轉(zhuǎn)化，%):[〇429]轉(zhuǎn)化w=RS(mg/ml)*100*162/(纖維素(mg/ml)*180)=[0430]=RS(mg/ml)*100/(纖維素(mg/ml)*l.111)[0431]在此方程式中，RS是溶液中按葡萄糖相當(dāng)量(mg/ml)計(jì)量的還原糖濃度，而系數(shù)1.111反映了纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖時(shí)的重量增量。[0432]表1概括給了通過(guò)單獨(dú)的Tr/AoBG(2.5mg/gPCS)或者補(bǔ)充橙色嗜熱子囊菌GH6IA多肽(每克PCS0.2mg)的纖維素轉(zhuǎn)化。[0433]表1:由單獨(dú)的Tr/AoBG或補(bǔ)充橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽的Tr/AoBG于50°CpH5.0保溫115小時(shí)的纖維素轉(zhuǎn)化[0434]【權(quán)利要求】1.選自下列的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的分離多肽:(a)具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少70%的同一性；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在至少低嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交；和(c)在SEQIDNO:2第23至250位氨基酸中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的變體。2.權(quán)利要求1的多肽，具有與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少70%同一性的氨基酸序列。3.權(quán)利要求2的多肽，具有與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少75%同一性的氨基酸序列。4.權(quán)利要求3的多肽，具有與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少80%同一性的氨基酸序列。5.權(quán)利要求4的多肽，具有與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。6.權(quán)利要求5的多肽，具有與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少95%同一性的氨基酸序列。7.權(quán)利要求6的多肽，具有與SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少97%同一性的氨基酸序列。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽，包含S`EQIDNO:2的氨基酸序列。9.權(quán)利要求1-8中的多肽，由SEQIDNO:2或其具有增強(qiáng)纖維素分解活性的片段組成。10.權(quán)利要求9的多肽，由SEQIDNO:2組成。11.權(quán)利要求9的多肽，由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸組成。12.權(quán)利要求1的多肽，由在至少中等嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交的多核苷酸編碼。13.權(quán)利要求1的多肽，由在至少中等一高嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，⑴或(ii)的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交的多核苷酸編碼。14.權(quán)利要求1的多肽，由在至少高嚴(yán)緊條件下與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii),⑴或(ii)的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交的多核苷酸編碼。15.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽是在SEQIDNO:2第23至250位氨基酸中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的變體。16.權(quán)利要求1的多肽，由質(zhì)粒PDZA2-7所含多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。17.包含編碼權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。18.權(quán)利要求17的分離多核苷酸，在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變，其中突變的核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸組成的多肽。19.包含權(quán)利要求17或18的多核苷酸的核酸構(gòu)建體,所述多核苷酸與指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中產(chǎn)生的一種或多種控制序列可操作連接。20.包含權(quán)利要求18的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。21.包含權(quán)利要求18的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。22.生產(chǎn)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的多肽的方法,包括:(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞的野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；并(b)回收所述多肽。23.生產(chǎn)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的多肽的方法,包括:(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含如下核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；并(b)回收所述多肽。24.生產(chǎn)親本細(xì)胞突變體的方法，包括破壞或刪除編碼權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，導(dǎo)致突變體產(chǎn)生的多肽要比親本細(xì)胞少。25.通過(guò)權(quán)利要求24的方法產(chǎn)生的突變細(xì)胞。26.權(quán)利要求24的突變細(xì)胞，還包含編碼天然或異源蛋白的基因。27.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括:(a)在有利于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求26的突變細(xì)胞；并(b)回收所述蛋白質(zhì)。28.通過(guò)如下獲得的分離多核苷酸，即(a)在中等嚴(yán)緊條件下使DNA群體與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii),(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸，其編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽。29.權(quán)利要求28的分離多核苷酸，其通過(guò)如下獲得，即(a)在中等一高嚴(yán)緊條件下使DNA群體與⑴SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸，其編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽。30.權(quán)利要求29的分離的多核苷酸，其通過(guò)如下獲得，即(a)在高嚴(yán)緊條件下使DNA群體與⑴SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，⑴或(ii)的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸，其編碼具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽。31.產(chǎn)生具有突變核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括:(a)在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中引入至少一個(gè)突變，其中突變的核苷酸序列編碼由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸組成的多肽；并(b)回收包含突變核苷酸序列的多核苷酸。32.通過(guò)權(quán)利要求31的方法產(chǎn)生的突變多核苷酸。33.生產(chǎn)多肽的方法，包括:(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的權(quán)利要求32的突變多核苷酸的細(xì)胞；并(b)回收所述多肽。34.包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中所述基因可操作連接由SEQIDΝΟ:1第I至66位核苷酸組成的編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄卸允钱愒吹摹?5.包含權(quán)利要求34的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。36.包含權(quán)利要求34的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。37.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括:(a)在有利于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求36的重組宿主細(xì)胞；并(b)回收所述蛋白質(zhì)。38.生產(chǎn)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的多肽的方法,包括:(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含如下多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，該多核苷酸編碼本發(fā)明具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽；并(b)回收所述多肽。39.經(jīng)編碼權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。40.含有權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽、纖維素分解活性、和表面活性劑的清潔劑組合物。41.降解或者轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括:在存在有效量的權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)，用有效量的分解纖維素的蛋白質(zhì)處理纖維素材料，其中與不存在具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)相比，具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解。42.權(quán)利要求41的方法，其中纖維素材料選自草本植物材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙漿和造紙廠(chǎng)的殘余物。43.權(quán)利要求41的方法，其中纖維素材料是玉米秸桿。44.權(quán)利要求41的方法，其中一種或多種纖維素分解酶選自纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、和葡糖苷酶。45.權(quán)利要求41的方法，還包括用有效量的一種或多種選自半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或過(guò)氧化物酶的酶處理纖維素材料。46.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法是預(yù)處理方法。47.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法是同步糖化與發(fā)酵方法(SSF)中的步驟。48.權(quán)利要求41的方法，其中所述方法是混合水解與發(fā)酵方法(HHF)中的步驟。49.權(quán)利要求41的方法，還包括回收降解的纖維素材料。50.權(quán)利要求49的方法，其中降解的纖維素材料是糖類(lèi)。51.權(quán)利要求50的方法,其中所述糖類(lèi)選自葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖。52.權(quán)利要求41的方法，其中分解纖維素的蛋白質(zhì)和/或具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽是含有或者不含細(xì)胞的發(fā)酵液形式。53.生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的方法，包括:(a)在存在有效量的權(quán)利要求8的具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)，用有效量的分解纖維素的蛋白質(zhì)糖化纖維素材料，其中與不存在具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽時(shí)相t匕，具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物對(duì)步驟(a)的已糖化纖維素材料進(jìn)行發(fā)酵；并(C)由發(fā)酵回收有機(jī)物質(zhì)。54.權(quán)利要求53的方法，其中纖維素材料選自草本植物材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙漿和造紙廠(chǎng)的殘余物。55.權(quán)利要求53的方法，其中纖維素材料是玉米秸桿。56.權(quán)利要求53的方法，其中一種或多種纖維素分解酶選自纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、和葡糖苷酶。57.權(quán)利要求53的方法，還包括用有效量的一種或多種選自半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或過(guò)氧化物酶的酶處理纖維素材料。58.權(quán)利要求57的方法，其中酯酶是脂肪酶、磷脂酶、角質(zhì)酶、或其混合物。59.權(quán)利要求53的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時(shí)進(jìn)行。60.權(quán)利要求53的方法，其中有機(jī)物質(zhì)是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸、或氣體。61.權(quán)利要求60的方法，其中醇是阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨糖醇、或木糖醇。62.權(quán)利要求60的方法，其中有機(jī)酸是乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸。63.權(quán)利要求60的方法，其中酮是丙酮。64.權(quán)利要求60的方法，其中氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸、絲氨酸、或蘇氨酸。65.權(quán)利要求60的方法,其中氣體是甲燒、氫、二氧化碳、或一氧化碳。66.權(quán)利要求53的方法，其中分解纖維素的蛋白質(zhì)和/或具有增強(qiáng)分解纖維素活性的多肽是含有或者不含細(xì)胞的發(fā)酵液形式?！疚臋n編號(hào)】C12N1/21GK103667215SQ201310362275【公開(kāi)日】2014年3月26日申請(qǐng)日期:2005年2月4日優(yōu)先權(quán)日:2004年2月6日【發(fā)明者】威廉.多森,詹妮弗.格里尼爾,丁晗澍申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司