磷脂酶c及其產生菌株的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種分離的表達磷脂酶C的菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.7506。利用本發明所提供菌株和制備方法制備所得的磷脂酶C可以用于油脂精煉，脫膠效果良好，可以廣泛應用于油脂精煉、添加劑、醫藥等領域。CGMCC No750620130422
【專利說明】磷脂酶C及其產生菌株

【技術領域】
[0001] 本發明屬于酶脫膠領域，具體說是一種磷脂酶C及其產生菌株。

【背景技術】
[0002] 磷脂酶（Phospholipase, PL)是生物體內存在的能水解甘油磷脂的酶，水解產物 為各種磷脂酸和氨基醇，如膽胺、膽堿、絲氨酸、乙醇胺等。根據磷脂酶水解甘油磷脂的位點 不同，可將憐脂酶分為憐脂酶A(Phospholipase A，PLA)、憐脂酶B(Phospholipase B，PLB)、 憐脂酶 C(Phospholipase C，PLC)和憐脂酶 D (Phospholipase D，PLD)，如圖 1 所不。
[0003] 磷脂酶可廣泛應用于油脂精練、磷脂改性、飼料改良劑、食品工業和醫藥等方面。 脫膠是植物油精煉過程中的一個重要環節，對提高油的品質至關重要，脫膠主要是脫除磷 月旨，脫膠若不徹底，會影響油品的深加工和油品的穩定性，減低油品貨架期。酶法脫膠可以 克服傳統脫膠方法脫膠脫除率低，同時中性油損失高等的問題。而在酶法脫膠工藝中，現有 文獻多報道磷脂酶PLA用于植物油脫膠。磷脂酶PLA (包括PLAl和PLA2)，脫膠后可產生極 性溶血磷脂和極性脂肪酸，PLA脫膠工藝僅僅損失油中總的磷脂分子，來減少精煉損耗。而 磷脂酶PLC酶通過選擇性水解磷酸酯官能團與磷脂反應，生成甘油二酯（DAG)和磷脂酸基 團，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脫膠工藝通過保留原始的磷脂分子而僅去除磷酸酯 官能團來減少精煉損耗，不存在PLA脫膠工藝中產生的能提高脫膠油酸價的極性脂肪酸的 問題，PLC用于脫膠優勢明顯好于PLA。
[0004] 磷脂酶C (PLC)可來源于動物和微生物。文獻報道磷脂酶C細菌來源的有： 粘質沙雷氏菌武漢株（Serratia marcescens wuhan strain)、假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridum perfringens)、諾氏梭狀芽孢桿 菌（Closrtidium novyi)、雙酶梭狀芽抱桿菌（clostridium bifermantans)、洋蔥假單 胞菌（Pseudomonas cepacia)、金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus)、錯狀芽抱 桿菌（Bacillus cereus)、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)、類鼻疽伯克 氏菌（burkholderia pseudomallei)。憐脂酶C霉菌來源的有：煙曲霉（Aspergillus fumigates)、黃曲霉（Aspergillus flavus)、自佐氏曲霉菌（Aspergillus saitoi)。憐脂 酶C酵母來源的有白色念珠菌（canidia Albicans)。JP50-1017183報道斯谷假單胞菌 (Pseudomonas schuylkilliensis)可以產憐脂酶 C。JP49-55893 報道來源于 streptomyces hachi jyoensis 的憐脂酶 C。
[0005] 磷脂酶C的芽孢桿菌來源相關報道中，蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌來源的 PLC的相關文獻和專利報道的比較多，并未有來源于枯草芽孢桿菌的磷脂酶C的相關報道。 US6284517公開了蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌有磷脂酶C活性。JP55034039報道蘇云 金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)可以產磷脂酶C。US3909360報道錯樣芽孢桿菌產 磷脂酶A和磷脂酶C。
[0006] 蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌是引起水源和食物等污染的常見菌，蠟樣芽孢桿 菌可厭氧生長、有運動性、該菌呈長桿狀，寬度大于1微米。而有報道的真菌煙曲霉和黃曲 霉來源的磷脂酶C，煙曲霉和黃曲霉也是公認的致病菌，無法在食品工業中使用。
[0007] 枯草芽孢桿菌自身無致病性，而且枯草芽孢桿菌是GRAS (Generally Recognized as Safe，GRAS是美FDA評價食品添加劑的安全性指標）菌株，枯草芽孢桿菌在飼料中的 應用，可直接用作畜禽的復合微生態制劑（CN201010232600. 2)，也可以用于發酵秸桿飼 料（CN201010164201. 7)，提高飼料的蛋白量?？莶菅挎邨U菌是一些重要工業酶制劑的生 產菌，枯草芽孢桿菌能夠分泌多種酶，其中能夠應用到醫藥領域的酶主要有絲氨酸纖溶性 蛋白酶(納豆激酶）和脂肪酶兩種。我國的豆豉纖溶酶和韓國的大豆發酵食品中分離的 纖溶酶也都是枯草芽孢桿菌分泌的絲氨酸纖溶性蛋白酶的一種。枯草芽孢桿菌可以發酵 生產堿性蛋白酶（CN03144206. 4, CN201110220386. 3)，還可以用于提升白酒釀造的風味 (CN201110233172. X)等等，所以，枯草芽孢桿菌更安全可靠。
[0008] 但目前尚沒有發現枯草芽孢桿菌產磷脂酶PLC的報道。


【發明內容】

[0009] 本發明的一個目的在于，提供一種分離的表達磷脂酶C的菌株。
[0010] 本發明提供的分離的表達磷脂酶C的菌株，命名為WBRD01280,保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 7506。
[0011] 本發明還有一個目的在于，提供一種生產磷脂酶C的方法。
[0012] 本發明提供的生產磷脂酶C的方法包括：培養前述的菌株以使所述菌株或細胞生 產磷脂酶C，收獲磷脂酶C。
[0013] 在本發明的一個優選實施例中，所述培養為在適宜所述菌株生長和/或適宜所述 菌株表達磷脂酶C的條件下培養所述菌株，優選的，所述培養為在適宜所述菌株生長的條 件下培養所述菌株，以增加所述菌株數量，然后再于適宜所述菌株表達磷脂酶C的條件下 培養所述菌株，以表達所述磷脂酶C。
[0014] 在本發明的一個優選實施例中，所述培養為在25-40°C、120-250rpm培養所述菌 株6-24h。
[0015] 在本發明的一個優選實施例中，所述收獲包括分離和收集含有分泌或釋放到胞外 的磷脂酶C的培養物上清液，由此獲得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；優選地，所述方法還 包括對所述磷脂酶C酶液進行濃縮。
[0016] 本發明還有一個目的在于，提供一種磷脂酶C。
[0017] 本發明提供的磷脂酶C為用前述方法制得。
[0018] 本發明還有一個目的在于，提供一種磷脂酶C酶液。
[0019] 本發明提供的磷脂酶C酶液為用前述方法制得。
[0020] 本發明還有一個目的在于，提供一種脫膠的方法。
[0021] 本發明提供的脫膠的方法為使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液進行脫膠，優選 的，所述脫膠為油脂脫膠。
[0022] 本發明還有一個目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脫膠 的用途，優選的，所述脫膠為油脂脫膠。
[0023] 本發明還有一個目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂 改性、食品添加劑、飼料改良劑和醫藥工業的用途。
[0024] 本發明的產磷脂酶C的細菌--枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)WBRD01280 及使用該菌株獲得的酶液和磷脂酶C可以用于油脂精煉，脫膠效果良好，由于枯草芽孢桿 菌是GRAS菌株，因此，可以直接用于食品工業，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精 煉。同樣枯草芽孢桿菌來源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加劑、飼料改良劑 和醫藥工業等方面。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1顯示磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D的酶切作用示意圖。
[0026] 圖2顯示枯草芽孢桿菌WBRD01280發酵濃縮酶液水解磷脂酰膽堿的TLC檢測結 果，其中泳道1為1，2二油酸甘油酯,泳道2為1，3二油酸甘油酯,泳道3為三油酸甘油酯， 泳道4為枯草芽孢桿菌來源粗磷脂酶C酶液水解磷脂酰膽堿后的樣品。
[0027] 圖3顯示枯草芽孢桿菌WBRD01280發酵濃縮酶液的最適溫度檢測結果。
[0028] 圖4顯示枯草芽孢桿菌WBRDO1280發酵濃縮酶液的最適pH檢測結果。
[0029] 圖5顯示枯草芽孢桿菌WBRD01280發酵濃縮酶液在不同溫度下孵育后酶活檢測結 果。
[0030] 圖6顯示不同金屬離子對枯草芽孢桿菌WBRD01280發酵濃縮酶液的酶活的影響。
[0031] 本發明的菌株WBRD01280已于2013年4月22日保藏在"中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心（CGMCC)"（北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生 物研究所，郵編100101)，保藏號是CGMCC No. 7506,分類命名為：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

【具體實施方式】
[0032] 以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本 發明而非用于限定本發明的范圍。
[0033] 在本發明中，如果沒有特別的說明，百分數（％ )或者份都指相對于組合物的重量 百分數或者重量份。
[0034] 在本發明中，如果沒有特別的說明，所涉及的各組分或其優選組分可以相互組合 形成新的技術方案。
[0035] 在本發明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有實施方式以及優選實施方 式可以相互組合形成新的技術方案。
[0036] 在本發明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有技術特征以及優選特征可 以相互組合形成新的技術方案。
[0037] 在本發明中，如果沒有相反的說明，組合物中各組分的含量之和為100%。
[0038] 在本發明中，如果沒有相反的說明，組合物中各組分的份數之和可以為100重量 份。
[0039] 在本發明中，除非有其他說明，數值范圍"a_b"表示a到b之間的任意實數組合的 縮略表示，其中a和b都是實數。例如數值范圍"0-5"表示本文中已經全部列出了 "0-5" 之間的全部實數，"0-5"只是這些數值組合的縮略表示。
[0040] 在本發明中，除非有其他說明，整數數值范圍"a-b"表示a到b之間的任意整數組 合的縮略表示，其中a和b都是整數。例如整數數值范圍"1-N"表示1、2……N，其中N是 整數。
[0041] 在本發明中，除非有其他說明，"其組合"表示所述各元件的多組分混合物，例如兩 種、三種、四種以及直到最大可能的多組分混合物。
[0042] 如果沒有特別指出，本說明書所用的術語"一種"指"至少一種"。
[0043] 如果沒有特別指出，本發明所述的百分數(包括重量百分數）的基準都是所述組合 物的總重量。
[0044] 本文所公開的"范圍"以下限和上限的形式?？梢苑謩e為一個或多個下限，和一個 或多個上限。給定范圍是通過選定一個下限和一個上限進行限定的。選定的下限和上限限 定了特別范圍的邊界。所有可以這種方式進行限定的范圍是包含和可組合的，即任何下限 可以與任何上限組合形成一個范圍。例如，針對特定參數列出了 60 - 120和80 - 110的 范圍，理解為60 - 110和80 - 120的范圍也是預料到的。此外，如果列出的最小范圍值1 和2,和如果列出了最大范圍值3,4和5,則下面的范圍可全部預料到：1 一 3、1 一 4、1 一 5、 2 - 3、2 - 4、和 2 - 5。
[0045] 在本文中，除非另有說明，各組分的比例或者重量都指干重。
[0046] 在本文中，除非另有說明，各反應都在常溫常壓下進行。
[0047] 在本文中，除非另有說明，各個反應步驟可以順序進行，也可以不按順序進行。例 如，各個反應步驟之間可以包含其他步驟，而且反應步驟之間也可以調換順序。優選地，本 文中的反應方法是順序進行的。
[0048] 本發明的發明人從中國新疆艾丁湖土壤樣品中篩選獲得了一株枯草芽孢桿菌 (Baci I Ius subti I is ) WBRDO1280，經檢測，該菌株能夠生產出具有磷脂酰膽堿（PC)活性的 磷脂酶PLC，該磷脂酶C脫膠效果良好。由于枯草芽孢桿菌是GRAS菌株，因此，可以用于食品 工業，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精煉。同樣，本發明提供的枯草芽孢桿菌來 源的磷脂酶C，還可以安全的用于磷脂改性、食品添加劑、飼料改良劑和醫藥工業等方面。例 如，制備磷脂酶改性磷脂，使磷脂在營養價值、乳化性能以及色、味等方面大為改進和提高， 從而大大拓展了磷脂在食品、保健品工業中的應用范圍和使用價值；在食品添加劑方面，本 發明的磷脂酶C可以用于烘焙，可使面團形成膠狀復合體，可以減少淀粉回生，調節和改善 面團的穩定性，因此在烘焙行業應用也非常廣泛；在醫藥研究方面，將本發明提供的磷脂酶 C作為疫苗，可用于防治各種病原菌的感染，用本發明提供的磷脂酶C開發抗血小板聚集類 藥物，可治療或預防心腦血管疾病等，本發明提供的磷脂酶C還可被應用于抗腫瘤藥物的 研制等。
[0049] 本發明提供了一種分離的表達磷脂酶C的菌株，命名為WBRD01280,保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 7506。
[0050] 本發明提供了一種生產磷脂酶C的方法。
[0051] 本發明提供的生產磷脂酶C的方法包括：培養前述的菌株CGMCC No. 7506以使所 述菌株或細胞生產磷脂酶C，收獲磷脂酶C。
[0052] 菌株CGMCC No. 7506的培養方法可米用枯草芽孢桿菌的常規培養方法，例如使用 LB培養基、YH)培養基或土豆培養基進行培養。
[0053] 菌株CGMCC No. 7506的培養可以在適宜所述菌株生長和/或適宜所述菌株表達磷 脂酶C的條件下培養所述菌株，優選的，所述菌株CGMCC No. 7506的培養為在適宜所述菌株 生長的條件下培養所述菌株，以增加所述菌株數量，然后再于適宜所述菌株表達磷脂酶C 的條件下培養所述菌株，以表達所述磷脂酶C。
[0054] 菌株CGMCC No. 7506的培養條件可以但不限于為：于25-40°C、120-250rpm培養， 培養時間為6-24h，優選的，培養菌株CGMCC No. 7506至對數生長期。
[0055] 菌株CGMCC No. 7506可將生產的磷脂酶C分泌到胞外的培養基中。在本發明的一 個優選實施例中，所述收獲磷脂酶C包括分離和收集含有分泌或釋放到胞外的磷脂酶C的 培養物上清液，由此獲得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。
[0056] 實施方式之一中，對本發明的磷脂酶C酶液進行了濃縮，這樣可以提高磷脂酶C酶 液的磷脂酶C活性。本發明的酶液可以直接使用?？梢圆捎妹腹こ填I域已知的各種方法從 本發明的酶液中進一步分離和純化磷脂酶C，由此獲得本發明的磷脂酶C。
[0057] 本發明還提供了一種磷脂酶C，本發明提供的磷脂酶C為采用前述方法制得。
[0058] 本發明還提供了一種磷脂酶C酶液，本發明提供的磷脂酶C酶液為用前述方法制 得。在本發明的一個優選實施例中，該酶液為含有分泌或釋放到胞外的磷脂酶C的培養物 上清液。在本發明的另一個優選實施例中，對本發明的磷脂酶C酶液進行了濃縮，這樣可以 提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性。
[0059] 本發明還提供了一種脫膠的方法。
[0060] 本發明提供的脫膠的方法為使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液進行脫膠，由于 枯草芽孢桿菌是GRAS菌株，因此，本發明的磷脂酶C或磷脂酶C酶液可用于油脂，特別是可 食用油脂的脫膠。
[0061] 本發明還提供了前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脫膠的用途，優選的， 所述脫膠為油脂，特別是可食用油脂的脫膠。
[0062] 本發明還有一個目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂 改性、食品添加劑、飼料改良劑和醫藥工業的用途。
[0063] 在本發明的下述實施例中，菌株鑒定方法如下：
[0064] 16SrDNA鑒定：參考謝永麗；徐志偉；馬莉貞.兩株生防芽孢桿菌的分子鑒定及拮 抗活性測定[J]西北農業學報，2012, 32-37 ;
[0065] 生理生化鑒定：參考東秀珠等，常見細菌系統鑒定手冊[M]，科學出版社， 2001. 62-64.。
[0066] 在本發明的下述實施例中，
[0067] 枯草芽孢桿菌磷脂酶C的活力測定方法，采用pNPPC法，具體參考Michael Birch,et. al. Evidence of Multiple Extracellular Phospholipase Activities of Aspergillus fumigates[J]· INFECTION AND IMMUNITY, Mar. 1996,p. 751 - 755。
[0068] TLC檢測方法如下：
[0069] 緩沖液：0. 25M Tris-HCL PH值7. 5,磷脂酰膽堿：4%，發酵后經離心和濃縮的粗酶 液，反應體系：共2. 5ml，分別是緩沖液0. 5ml，底物I. 5ml，酶液0. 5ml。37°C水浴180rpm， 反應24小時時取樣lml，等體積加入正己烷萃取，振蕩混勻，12000rpm離心2分鐘，取出上 層正己烷部分，再等體積加入正己烷，重復兩次萃取，收集兩次的萃取液，開蓋，置于通風櫥 中揮發正己烷至干。每管中加15ul異丙醇，充份溶解。取5ul點薄層板。
[0070] 在本發明的下述實施例中，使用的毛油為大豆粗榨毛油，參考劉玉蘭.油脂制取 與加工工藝學[M].科學出版，2003,496-499.中的方法制備，所制備的毛油中：
[0071] 磷含量檢測方法：參考文獻GB/T5537。
[0072] 在本發明的下述實施例中，使用的培養基配方如下：
[0073] 卵磷脂平板：A :硫酸銨0. 1 %，酵母提取粉0. 5%，蛋白胨0. 5%，K2HP040. 1 %， KC10. 5 %，七水硫酸鎂0. 05 %，硫酸鋅0. 05%，無水氯化鈣0. 05%，瓊脂1. 8%，pH自然。
[0074] B:卵磷脂混合物 3g/45mlll5°C 15min 滅菌。
[0075] 滅菌后，AllOml和B90ml混合倒平板。
[0076] LB培養基：胰蛋白胨1%，酵母提取物(λ 5%，氯化鈉1%，ρΗ7· 0。
[0077] LB培養基平板：在LB培養基中加入瓊脂1. 5%。
[0078] 發酵培養基組成：蔗糖5%、蛋白胨5%、酵母浸出粉10%、牛肉膏5%，K2HPO 4O. 5%、 MgSO4 · 7Η200· 5%、CaCl2O. 5%，硫酸鋅 0· 5%，ρΗ7· 0。
[0079] 實施例
[0080] 實施例1、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis) WBRD01280的分離篩選及鑒定
[0081] 取采自于中國新疆艾丁湖土壤樣品10g，置于IOOmL含I. 0%Tween80的無菌水中。 充分振蕩30min后，無菌狀態下用濾紙濾除大顆粒不溶雜質，收集濾出液。
[0082] 將濾出液分別稀釋IO1UO^ IO3UO4倍，并將各個稀釋度的樣品涂布于卵磷脂平板 上，于28°C培養。
[0083] 每24h觀察卵磷脂平板上是否有乳白色沉淀圈出現。培養48-72小時后挑取乳白 色沉淀比較明顯的細菌進行進一步的劃線分離以獲得純種菌株，結果發現有一株乳白色沉 淀十分顯著的菌株，命名為WBRD01280。
[0084] 經過對該菌的16S rRNA測序，發現其rRNA序列如SEQ ID NO: 1所示，進行比對后 發現該菌與 Bacillus subtilis (GENBANK 號 NR024931.1)，Bacillus subtilis (GENBANK 號 AY162133. 1)及 Bacillus subtilis (GENBANK 號 AY553095. 1)的同源性均達到 100%。
[0085] 將菌株WBRD01280在LB培養基上劃線接種，28°C培養48h后，觀察其生長情況。
[0086] 結果顯示：該菌株呈乳白色，圓形，粘性，表面光滑有凸起。該菌呈桿狀，長度在 0. 7-3. 0 μ m，寬度在0. 5-0. 8 μ m。該菌為革蘭氏陽性細菌，經生理生化鑒定，能水解明膠和 淀粉，鹽酸鹽還原到亞鹽酸鹽，不形成吲哚，芽孢〇. 6?1. 5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中 央或稍偏，根據以上結果，篩選獲得的菌株WBRD01280符合枯草芽孢桿菌的特征，為枯草芽 孢桿菌。
[0087] 該菌株已于2013年4月22日保藏在"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC)"（北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號是CGMCC No. 7506,分類命名為：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。
[0088] 實施例2、來源于枯草芽孢桿菌磷脂酶C的制備
[0089] 2. 1、枯草芽孢桿菌磷脂酶C的發酵
[0090] 將枯草芽孢桿菌WBRD01280,接種至30ml種子培養基（LB培養基）中，于28°C、 180rpm，培養 24h。
[0091] 液體種子培養好后，以1%的接種量接種至30ml發酵培養基中，以28°C、180rpm的 條件培養24h。
[0092] 將枯草芽孢桿菌發酵培養液于1200rpm離心10分鐘，收集獲得離心上清液 約45ml，檢測離心上清液的磷脂酶C活力，結果顯示，離心上清液的磷脂酶C酶活約為 0·015 μ mol/ml〇
[0093] 2. 2、枯草芽孢桿菌磷脂酶粗酶液的濃縮
[0094] 按廠商提供的方法，采用3_30kDa的膜（Omega,美國PALL公司）對離心上清液進 行超濾濃縮，再用超純水清洗兩次，獲得濃縮酶液約IOml。
[0095] 檢測濃縮酶液酶活，結果顯示，濃縮酶液的枯草芽孢桿菌磷脂酶C活力約為 0.050 μ mol/ml〇
[0096] 使用所獲得的濃縮酶液水解磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine, PC),其中，酶液 用量為0. 5ml，pH值7. 5的Tris-HCL緩沖液0. 5ml，4%磷脂酰膽堿I. 5ml，37°C水浴150rpm 反應24小時，取樣lml，加入等體積Iml正己烷萃取，振蕩混勻，12000rpm離心2分鐘，取上 層正己烷萃取液，向沉淀及水相中加入Iml己烷萃取，收集合并兩次的萃取液，置于通風櫥 中揮發正己烷至干。每管中加15UL異丙醇，充份溶解。取5ul點薄層板，TLC檢測結果見 圖2,根據圖2結果，水解產物中出現甘油二酯，因此該酶為磷脂酶C。
[0097] 實施例3 :枯草芽孢桿菌WBRD01280產磷脂酶C的酶學性質
[0098] 3. 1、枯草芽孢桿菌磷脂酶C的最適溫度
[0099] 分別在 0 ?、10 ?、20 ?、30 ?、40 ?、45 ?、50 ?、55 ?、60 ?，70 ? 和 75 ? 水浴溫度 下測定實施例2濃縮制備所得的枯草芽孢桿菌磷脂酶C的酶活。
[0100] 以最高PLC酶活的溫度點的PLC酶活作為100%酶活，其它溫度點的PLC酶活除以 該最高酶活，從而得到該溫度點的相對酶活，以相對酶活為縱坐標，溫度點為橫坐標，以平 滑曲線依次連接各溫度點的相對酶活，將這些相對酶活以平滑曲線連接，結果見圖3。
[0101] 圖3結果顯示，WBRD01280發酵粗酶液PLC酶活最適溫度為55°C，溫度在50-70°C 的相對酶活在80%及以上。
[0102] 3. 2、枯草芽孢桿菌磷脂酶C的最適pH值
[0103] 用0. IM的檸檬酸和0. IM的檸檬酸鈉配制pH值為6. 0緩沖體系；配制0. IM的Tris 用HCL調節pH值，配制pH值為6· 5、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5的緩沖體系；配制0· IM的甘氨酸，用 氫氧化鈉調節pH值，配制pH值為9. 0和9. 5的緩沖體系。
[0104] 分別在 pH 值為 6·0、6·5,7·0、7·5、8·0、8·5、9·0、9·5 的 300ul 緩沖體系中，加入 5ul的實施例2制備的濃縮酶液，在37°C水浴鍋中溫浴30分鐘后，測定酶活。
[0105] 以最高PLC酶活的pH的PLC酶活作為100%酶活，其它pH的PLC酶活除以該最高 酶活，從而得到該PH的相對酶活，以相對酶活為縱坐標，pH值為橫坐標，以平滑曲線依次連 接各pH的相對酶活，結果見圖4。圖4結果顯示，WBRD01280發酵粗酶液PLC酶活最適pH 值在9.0。
[0106] 3. 3、枯草芽孢桿菌磷脂酶C的溫度穩定性
[0107] 將酶液取500111分裝成小份，分別放置于01：、301：、401：、501：、601：和701：的水 浴鍋中保溫，在保溫1小時和2小時后分別從各水浴鍋中取出酶液，檢測酶活，
[0108] 以最高PLC酶活的溫度點的PLC酶活作為100%酶活，其它溫度測得的的PLC酶活 除以該最高酶活，從而得到其相對酶活，以相對酶活為縱坐標，反應時間為橫坐標，以平滑 曲線依次連接每一溫度下各時間點的相對酶活，獲得不同溫度下孵育時間與酶活的曲線， 結果見圖5。
[0109] 根據圖5結果，181?01280粗酶液的？1^(：活性在0、301：、401：501：條件下靜置1小 時，活性較穩定。在60°C和70°C下靜置1小時后，活性分別下降到原來的79%和70%，隨后 再接著靜置1小時，PLC活性在50°C、60°C和70°C條件下，分別下降到原來的70. 3%、62%和 56%。
[0110] 3. 4、金屬離子對枯草芽孢桿菌磷脂酶C活性的影響
[0111] 分別配制250mM的各金屬離子鈷離子、銨離子、錳離子、鋅離子、鎂離子、鉀離子、 鈣離子、鈉離子、銅離子、鎳離子和鐵離子)母液，取6ul的金屬離子加到300ul的Tris-HCl 和底物的反應體系中，各金屬離子的最終濃度為5mM，再加入酶液，在37°C水浴30分鐘，檢 測酶活，其中使用的對照不加任何金屬離子，結果見圖6。
[0112] 根據圖6結果，鈷離子、銨離子、錳離子、鋅離子、鎂離子、鉀離子、鈣離子和鈉離子 對WBRD01280發酵粗酶液PLC酶活有不同程度的激活作用，而銅離子、鎳離子和鐵離子對 WBRD01280發酵粗酶液PLC酶活有抑制作用。
[0113] 根據上述實驗結果，枯草芽孢桿菌來源的磷脂酶C，該磷脂酶C的最適酶活溫度為 55°C，最適pH為9. 0,可被鈷尚子、銨尚子、猛尚子、鋅尚子、鎂尚子、鉀尚子、I丐尚子和鈉尚 子激活，被銅離子、鎳離子和鐵離子所抑制，在0、30°C、40°C 50°C條件下靜置1小時，酶活較 穩定。
[0114] 實施例4 :軺鈍水脫膠
[0115] 毛油中的含磷量321ppm。
[0116] 將200g大豆毛油在攪拌下加熱至70_80°C，添加6g超純水，將油水混合物剪切1 分鐘，在7〇-75°C溫度下，在磁力攪拌器上160rpm攪拌30分鐘，然后于1200rpm離心10分 鐘該水處理的油，收集分離的油和濕膠，脫膠油中的殘留磷為110. lOppm。
[0117] 實施例5 :PLC (來源于DSM)酶法脫膠
[0118] 將200g大豆毛油在攪拌下加熱至70_80°C，添加0. 16g的45%檸檬酸溶液，將 混合物剪切1分鐘，在70-75°C溫度下，用磁力攪拌器攪拌30分鐘，冷卻該油，直至油溫 為55-65 °C，然后添加0. 5g8%氫氧化鈉溶液，將混合物剪切混合30秒，將溫度維持在 50-55°C，添加超純水5. 30g和19個單位酶活的PLC酶液，然后混合剪切1分鐘，在溫度為 50-55°C下，攪拌反應5小時，然后離心該PLC處理的油，收集分離的油和濕膠，脫膠油中的 殘留磷為11. 52ppm。
[0119] 實施例6 :枯草芽孢桿菌WBRD01280磷脂酶C的酶法脫膠
[0120] 用實施例2濃縮制備所得的枯草芽孢桿菌磷脂酶C進行酶法脫膠，將200g大 豆毛油在攪拌下加熱至70-80°C，添加0. 16g的45%檸檬酸溶液，將混合物剪切1分鐘， 在70-75°C溫度下，用磁力攪拌器攪拌30分鐘，冷卻該油，直至油溫為55-65°C，然后添加 0. 5g8%氫氧化鈉溶液，將混合物剪切混合30秒，將溫度維持在50-55°C，添加10. 06個單位 酶活的濃縮磷脂酶C酶液，然后混合剪切1分鐘，在溫度為50-55°C下，攪拌反應5小時，然 后離心該酶處理的油，收集分離的油和濕膠，脫膠油中的殘留磷為19. 81ppm。
[0121] 實施例4-6的結果顯示，200g植物油中添加10. 06U單位的PLC，最后脫膠植物 油中無機磷含量為19. 81ppm，說明枯草芽孢桿菌來源的粗酶PLC具有脫膠效果，而商品 PLC(DSM-PLC)在200g植物油中添加19U單位，最后植物油中的無機磷含量為11. 52ppm，兩 者相當，但均明顯強于水的脫膠效果。
[0122] 根據上述結果，本發明提供的枯草芽孢桿菌WBRD01280在適宜的發酵條件下可以 產生一定量的磷脂酶C，在100克大豆毛油中添加5. 03酶活單位的磷脂酶C粗酶液，可以 達到比較好的脫膠效果，由于枯草芽孢桿菌是GRAS菌株，因此，可以用于食品工業，安全可 靠，例如可以安全方便的用于油脂精煉。同樣枯草芽孢桿菌來源的磷脂酶C可以安全的用 于磷脂改性、食品添加劑、飼料改良劑和醫藥工業等方面。磷脂酶改性磷脂，使磷脂在營養 價值、乳化性能以及色、味等方面大為改進和提高，從而大大拓展了磷脂在食品、保健品工 業中的應用范圍和使用價值。在食品添加劑方面，磷脂酶可以用于烘焙，磷脂酶可使面團形 成膠狀復合體，可以減少淀粉回生，調節和改善面團的穩定性。因此在烘焙行業應用也非常 廣泛。在醫藥研究方面，將微生物磷脂酶作為疫苗，用于防治各種病原菌的感染；用磷脂酶 開發抗血小板聚集類藥物，治療或預防心腦血管疾病等，如PLC被應用于抗腫瘤藥物的研 制等。
【權利要求】
1. 一種分離的表達磷脂酶C的菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏號為CGMCC No. 7506。
2. -種生產磷脂酶C的方法，包括：培養權利要求1所述的菌株以使所述菌株或細胞 生產磷脂酶C，收獲磷脂酶C。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養為在適宜所述菌株生長和/或適宜 所述菌株表達磷脂酶C的條件下培養所述菌株，優選的，所述培養為在適宜所述菌株生長 的條件下培養所述菌株，以增加所述菌株數量，然后再于適宜所述菌株表達磷脂酶C的條 件下培養所述菌株，以表達所述磷脂酶C。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養為在25-40°C、120-250rpm培養所 述菌株6-24h。
5. 如權利要求2-4中任一項所述的方法，所述收獲包括分離和收集含有分泌或釋放到 胞外的磷脂酶C的培養物上清液，由此獲得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；優選地，所述方 法還包括對所述磷脂酶C酶液進行濃縮。
6. -種磷脂酶C，用權利要求2-5中任一項所述方法制得。
7. -種磷脂酶C酶液，用權利要求5所述方法制得。
8. -種脫膠的方法，使用權利要求6的磷脂酶C或權利要求7的磷脂酶C酶液進行脫 膠，優選的，所述脫膠為油脂脫膠。
9. 權利要求1所述的菌株或權利要求6的磷脂酶C或權利要求7的磷脂酶C酶液用于 脫膠的用途，優選的，所述脫膠為油脂脫膠。
10. 權利要求1所述的菌株或權利要求6的磷脂酶C或權利要求7的磷脂酶C酶液用 于磷脂改性、食品添加劑、飼料改良劑和醫藥工業的用途。
【文檔編號】C12R1/125GK104419651SQ201310362007
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】周美鳳, 徐正軍, 許駿 申請人:豐益(上海)生物技術研發中心有限公司