核酸和檢測轉基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及試劑盒及其用途
【專利摘要】本發明提供了一種核酸，該核酸為轉基因水稻EB7001S的旁側序列的核酸。本發明還提供了一種檢測轉基因水稻的方法，該方法包括：（1）使用針對如上所述的核酸的特異性引物對，對取自待測水稻的核酸樣品進行PCR擴增，得到PCR擴增后的產物；（2）檢驗所述PCR擴增后的產物中是否含有所述特異性引物對產生的特異性目的片段；如果所述PCR擴增后的產物中含有所述特異性目的片段，則指示所述待測水稻為所述轉基因水稻EB7001S或者含有該核酸的衍生系。本發明還提供了一種試劑盒及該試劑盒的用途。通過上述技術方案，本發明成功地實現了轉基因水稻EB7001S或者含有該核酸的衍生系的檢測。
【專利說明】核酸和檢測轉基因水稻EB7001S及其衍生系的方法以及試 劑盒及其用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及農業生物【技術領域】，具體地，涉及一種核酸、一種檢測轉基因水稻的方 法、一種試劑盒以及該試劑盒在檢測轉基因水稻中的應用。

【背景技術】
[0002] 水稻（Oryza sativa L )作為世界上最重要的糧食作物之一，人們對其遺傳轉化 和育種利用等方面進行了深入細致的研究。我國在水稻轉基因研究領域取得了一系列重大 成果，很多轉基因水稻品種已被獲準進行環境釋放和生產性試驗，2009年轉Bt基因抗螟蟲 水稻"華恢1號"和"Bt汕優63"獲得生產應用安全證書，標志著我國轉基因水稻具備了商 業化生產的基本條件。為了平衡貿易利益、滿足公眾關切、控制潛在風險、加強工商監管，許 多國家相繼建立了轉基因生物及其產品的安全評價和標識制度。我國現行對于農業轉基因 生物的管理依據的是國務院2001年5月23日頒布的《農業轉基因生物安全管理條例》，以 及農業部2002年1月5日發布的《農業轉基因生物安全評價管理辦法》、《農業轉基因生物 進口安全管理辦法》和《農業轉基因生物標識管理辦法》3個配套規章。為了實現對轉基因 生物及其產品的標識管理，保障轉基因產品的有效監管和轉基因產業的健康發展，對轉基 因檢測技術的準確度和靈敏度提出了嚴格要求。
[0003] 國際農業生物技術應用服務組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, ISAAA)統計報告顯不，2012年全球28個國家種植轉基因 作物，種植面積達到1. 703億公頃，比2011年的1. 6億公頃增長了 6%。水稻是世界上最重 要的糧食作物之一，自第1批轉基因水稻植株1988年問世以來，含有各種優良性狀，如抗 蟲、抗除草劑、抗菌、抗病毒或營養改良的轉基因水稻相繼研發成功。但各國對轉基因水稻 的商業化生產態度謹慎，1999年美國批準了 2個抗除草劑轉基因水稻品種LL62和LL06的 商業化種植，2004年伊朗開始規模化種植抗蟲轉基因水稻，2009年中國農業部批準了華中 農業大學的轉Bt基因抗蟲水稻華恢1號和Bt汕優63的生產應用安全證書，但至今還沒有 獲得品種審定，即商業化生產許可。
[0004] 轉基因植物中外源基因在染色體上插入位置的旁側序列是轉基因植物品系最重 要的分子特征之一，是區別不同轉化事件的唯一性標識，是建立轉基因植物品系特異性檢 測方法的重要技術資料。如：王恒波等(轉基因大豆GTS40-3-2轉化事件特異性PCR檢測 [J].基因組學與應用生物學，2010,（06) :1177-83)建立了抗草甘膦轉基因大豆GTS40-3-2 的品系特異性PCR檢測方法。翟志芳等(轉基因玉米LY038轉化事件的特異性檢測[J]. 農業生物技術學報，2011，（03) :577-82.)采用修飾接頭連接PCR獲得了轉基因玉米LY038 的外源基因與玉米基因組之間的5'端側翼序列，據此建立了轉基因玉米LY038轉化事件 特異性定性檢測方法。就水稻而言，目前國內獲得了轉基因水稻克螟稻(轉Xa21基因水 稻抗優97特異性檢測方法的建立；中國植物病理學會2006年學術年會，中國湖南長 沙，F，2006[C] )、Bt汕優63 (CN101824411A)、科豐6號（轉基因水稻Bt汕優63外源插 入結構驗證和定量檢測方法建立[D];中國農業科學院，2008)、兩系早稻恢復系B2A68 (201310068126. 8 :核酸和檢測轉基因水稻B2A68及其衍生系的方法以及試劑盒及其用途） 等的外源插入片段的旁側序列，并建立了品系特異性的檢測方法。
[0005] 利用密碼子優化的Epspss基因和Bar基因共同轉化水稻，可以獲得抗兩種除草劑 的水稻（參考專利申請201110270905. 7, CN102994526A)。既抗除草劑草甘膦，又抗除草劑 草銨膦的轉基因水稻不育系不僅能方便除草，而且有利于實現機械化制種，還可以實現除 草劑的交替使用、有效降低由于長期使用一種除草劑而導致雜草產生抗性的風險。本發明 的發明人通過密碼子優化的Epsps s基因和Bar基因轉化水稻，獲得了一個轉基因水稻新品 系EB700IS。由于農桿菌轉化水稻外源基因的插入具有隨機性，轉基因水稻品系EB700IS的 外源基因在基因組中插入位置并不清楚，因此，難以實現對轉基因水稻品系EB7001S的特 異性檢測。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種核酸及檢測含有該核酸的轉基因水稻品系的方法。
[0007] 轉基因水稻新品系EB7001S已經在專利文獻（CN102994526A)中公開，可以通過 向中國科學院亞熱帶農業生態研究所來函索取的方式獲得，中國科學院亞熱帶農業生態研 究所保證從本發明的申請日起二十年內按照國家法規要求向公眾發放轉基因水稻新品系 EB7001S。
[0008] 由于外源基因的插入具有隨機性，導致不同轉化事件中，外源基因幾乎沒有機會 在水稻基因組的同一位置插入，因此，每個獨立的轉化事件都具有唯一性，所以外源基因序 列與水稻基因組序列拼接而成的旁側序列也具有唯一性。因此，旁側序列的核酸是一種全 新的核酸分子，本發明的發明人得到了轉基因水稻品系EB7001S外源基因旁側序列的具體 序列信息，由此建立的檢測方法是檢測轉基因水稻品系EB7001S及含有該核酸衍生水稻系 的特異性方法。
[0009] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種核酸，該核酸為轉基因水稻 EB7001S的旁側序列的核酸，所述轉基因水稻EB7001S的旁側序列為SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段，SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段；其中，SEQ ID No. 1的片段至少包括 SEQ ID No. 1的第149-190位的序列，優選至少包括SEQ ID No. 1的第139-200位的序列， 更優選至少包括SEQ ID No. 1的第129-210位的序列；SEQ ID No. 6的片段至少包括SEQ ID No. 6的第1889-1930位的序列，優選至少包括SEQ ID No. 6的第1879-1940位的序列， 更優選至少包括SEQ ID No. 6的第1869-1950位的序列。
[0010] 另一方面，本發明還提供了一種檢測轉基因水稻的方法，該轉基因水稻為轉基因 水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的轉基因水稻EB7001S的衍生系，該方法包括：
[0011] (1)使用針對如上所述的核酸的特異性引物，對取自待測水稻的核酸樣品進行PCR 擴增，得到PCR擴增后的產物；
[0012] (2)檢驗所述PCR擴增后的產物中是否含有所述特異性引物對擴增產生的特異性 目的片段；如果所述PCR擴增后的產物中含有所述特異性目的片段，則指示所述待測水稻 為所述轉基因水稻EB7001S或者由EB7001S雜交產生的含有如上所述的核酸片段的衍生 系。
[0013] 另一方面，本發明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包括右側特異性引物對和/或 左側特異性引物對，其中，所述右側特異性引物對包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述左側特異性引物對包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12 所示的核酸。
[0014] 另一方面，本發明還提供了如上所述的試劑盒在檢測轉基因水稻EB7001S或者含 有如上所述的核酸的轉基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。
[0015] 通過上述技術方案，本發明成功地實現了轉基因水稻EB7001S或者由EB7001S雜 交產生的含有該核酸片段的衍生系的檢測。
[0016] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0018] 圖1為轉基因水稻EB7001S所用載體的T-DNA區域結構及引物位置示意圖。
[0019] 圖2為轉基因水稻EB7001S通過hiTail-PCR擴增得到的T-DNA右邊界側的旁側 序列片段電泳圖。M :1Kb plus DNA marker ;1:EB7001S的TAIL-PCR第2級擴增產物（弓丨 物對ACl/RB-lb) ;2 :EB7001S的TAIL-PCR第3級擴增產物（引物對ACl/RB-2b) ;3 :非轉基 因對照7001S的TAIL-PCR第2級擴增產物（引物對ACl/RB-lb);4 :非轉基因對照7001S的 TAIL-PCR第3級擴增產物（引物對ACl/RB-2b)。
[0020] 圖3為通過LD-PCR方法獲得的轉基因水稻EB7001S中T-DNA左邊界旁側序列片 段回收后的電泳圖。M :1Kb plus DNA marker ;1 :EB7001S基因組DNA的LD-PCR產物（引物 對 LB1-F/LB1-R)。
[0021] 圖4為外源基因在水稻染色體上的插入位點及其上下游基因分布圖。
[0022] 圖5為轉基因水稻EB7001S中T-DNA右邊界側的旁側序列特異性引物對RB-F/ RB-R檢測電泳圖。M :1Kb plus DNA marker ;B :空白對照；1、3、5、7、9 :轉基因水稻EB7001S、 CD083、B2A4008S、B2A68、B88S ;2、4、6、8 :非轉基因對照 7001S、吉梗 88、4008S、D68。
[0023] 圖6為轉基因水稻EB7001S中T-DNA左邊界側的旁側序列特異性引物對LB2-F/ LB2-R檢測電泳圖。M:150bp DNA Ladder ;1、3、5、7、9 :轉基因水稻 EB7001S、CD083、 B2A4008S、B2A68、B88S ;2、4、6、8、10 :非轉基因對照 7001S、吉梗 88、4008S、D68。P88S。
[0024] 圖7為右邊界特異性引物對退火溫度優化結果。M :1Kb plus DNA marker ;1 : 51. 0 °C ；2 ：51. 3 °C ；3 ：52. I 〇C ；4 ：53. 2 °C ；5 ：54. 5 °C ；6 ：55. 8 °C ；7 ：57. 2 °C ；8 ：58. 5 °C ；9 ： 59. 8。。；10 :60· 9。。；11 :61· 7。。；12 :62. (TC。
[0025] 圖8為左邊界特異性引物對退火溫度優化結果。M :1Kb plus DNA marker ;1 : 51. 0 °C ；2 ：51. 3 °C ；3 ：52. I 〇C ；4 ：53. 2 °C ；5 ：54. 5 °C ；6 ：55. 8 °C ；7 ：57. 2 °C ；8 ：58. 5 °C ；9 ： 59. 8。。；10 :60· 9。。；11 :61· 7。。；12 :62. (TC。
[0026] 圖9為右邊界特異性引物對靈敏度檢測結果。M :150bp DNA Ladder ;CK:非轉基 因對照700IS基因組DNA ; I, 2, 3 :100%轉基因水稻EB700IS基因組DNA ;4, 5, 6 :20%轉基因 水稻EB7001S基因組DNA ;7,8,9 :5%轉基因水稻EB7001S基因組DNA ;10, 11, 12 :1%轉基因 水稻 EB7001S 基因組 DNA ;13, 14, 15 :0. 5% 轉基因水稻 EB7001S 基因組 DNA ;16, 17, 18 :0. 1% 轉基因水稻EB7001S基因組DNA。
[0027] 圖10為左邊界特異性引物對靈敏度檢測結果。M :150bp DNA Ladder ;CK :非轉基 因對照700IS基因組DNA ;1，2, 3 :100%轉基因水稻EB700IS基因組DNA ;4, 5, 6 :20%轉基因 水稻EB7001S基因組DNA ;7,8,9 :5%轉基因水稻EB7001S基因組DNA ;10, 11，12 :1%轉基因 水稻 EB7001S 基因組 DNA，13, 14, 15 :0. 5% 轉基因水稻 EB7001S 基因組 DNA ;16, 17, 18 :0. 1% 轉基因水稻EB7001S基因組DNA。

【具體實施方式】
[0028] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0029] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種核酸，該核酸為轉基因水稻 EB7001S的旁側序列的核酸，所述轉基因水稻EB7001S的旁側序列為SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段，SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段；其中，SEQ ID No. 1的片段至少包括 SEQ ID No. 1的第149-190位的序列，優選至少包括SEQ ID No. 1的第139-200位的序列， 更優選至少包括SEQ ID No. 1的第129-210位的序列；SEQ ID No. 6的片段至少包括SEQ ID No. 6的第1889-1930位的序列，優選至少包括SEQ ID No. 6的第1879-1940位的序列， 更優選至少包括SEQ ID No. 6的第1869-1950位的序列。
[0030] 另一方面，本發明還提供了一種檢測轉基因水稻的方法，該轉基因水稻為轉基因 水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的轉基因水稻EB7001S的衍生系，該方法包括：
[0031] (1)使用針對如上所述的核酸的特異性引物對，對取自待測水稻的核酸樣品進行 PCR擴增，得到PCR擴增后的產物；
[0032] (2)檢驗所述PCR擴增后的產物中是否含有所述特異性引物對擴增產生的特異性 目的片段；如果所述PCR擴增后的產物中含有所述特異性目的片段，則指示所述待測水稻 為所述轉基因水稻EB7001S或者由EB7001S雜交產生的含有如上所述的核酸片段的衍生 系。
[0033] 根據本發明的方法，其中，所述特異性引物對包括針對SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特異性引物對。所述針對SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特異性引 物對是指一條引物在SEQ ID No. 1的l-169bp區域設計，另一條引物在170-2071bp區域設 計，能夠能擴增SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段所示的核酸、并產生特定大小目標條帶 的引物對，所述針對SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特異性引物對不能夠擴增SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段所示的核酸以外的核酸或者擴增不能產生特定大小的目標 條帶。優選地，所述針對SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特異性引物對包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述特異性引物對擴增產生的目的片段的 長度為485bp。
[0034] 根據本發明的方法，其中，當所述特異性引物對包括SEQ ID No. 9所示的核酸和 SEQ ID No. 10所示的核酸時，優選情況下，PCR擴增的條件可以包括退火溫度為56-61°C(圖 7)。
[0035] 根據本發明的方法，其中，所述特異性引物對包括針對SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段的特異性引物對。所述針對SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段的特異性引 物對是指一條引物在SEQ ID No. 6的l-1909bp區域設計、另一條引物在1910-2671bp區域 設計，能夠擴增SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段所示的核酸、并產生特定大小目標條帶 的引物對。所述針對SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段的特異性引物對不能夠擴增SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段所示的核酸以外的核酸或者擴增不能產生特定大小的目標 條帶。優選地，所述特異性引物對包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12所示的 核酸；所述特異性引物對擴增的目的片段的長度為629bp。
[0036] 根據本發明的方法，其中，當所述特異性引物對包括SEQ ID No. 11所示的核酸和 SEQ ID No. 12所示的核酸時，優選情況下，PCR擴增的條件包括退火溫度為52-62°C(圖8)。 [0037] 當使用本發明提供的如上所述的特異性引物對對轉基因水稻EB7001S及其衍生 系進行檢測時，所述特異性引物對對轉基因 EB7001S成分的最低檢測限度可達到0. 5%。因 此，本發明提供的特異性引物對特別適用于對轉基因水稻EB7001S及其衍生系的檢測、監 測及標識制度管理。
[0038] 本發明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包括右側特異性引物對和/或左側特異性 引物對，其中，所述右側特異性引物對包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示 的核酸；所述左側特異性引物對包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12所示的核 酸。
[0039] 根據本發明的試劑盒，其中，優選地，所述試劑盒還包括陽性對照核酸，所述陽性 對照核酸包括SEQ ID NO. 1所示的核酸和/或SEQ ID NO. 6所示的核酸。
[0040] 根據本發明的試劑盒，其中，優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、PCR緩沖液和耐高 溫DNA聚合酶。
[0041] 本發明還提供了如上所述的試劑盒在檢測轉基因水稻EB7001S或者含有如上所 述的核酸的轉基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。
[0042] 轉基因水稻EB7001S所用載體的T-DNA區域結構及引物位置見圖1，該載體由 Epspss基因表達框和Bar基因表達框組成。本發明采用常規方法提取植物基因組DNA。利 用hiTail-PCR和LD-PCR的方法，擴增、分離并延伸得到外源基因插入位點的右旁側序列， 如SEQ ID No. 1所示，長度2071bp。利用LD-PCR方法分離得到的外源基因插入位點的左旁 側序列，如SEQ ID No. 6所示，長度267 Ibp。
[0043] 通過分析SEQ ID No. 1發現，其中第1至第169位序列與所用載體右邊界上游序 列完全一致，說明是外源基因序列，第170至第2071位序列與已發表的水稻基因組第7號 染色體上序列（NCBI【http://www. ncbi. nlm. nih. gov】登錄號 AP006451. 3)的第 88469 至 第90370位匹配，說明是受體水稻7001S自身的基因組序列。通過分析SEQ ID No. 6發現， 其第1至第1909位序列與水稻第7號染色體上的序列（AP006451. 3)完全一致，說明該段 序列來源于受體7001S的基因組序列，第1910至第2671位與載體左邊界及CaMV35S終止 子、Bar基因序列及35S啟動子部分序列完全相同，說明該段序列來自外源基因。
[0044] 根據T-DNA右旁側序列（SEQ ID No. 1)設計特異性引物對，其中一條引物根據SEQ ID No. 1中第1至第169位序列設計，即是按照T-DNA右邊界上游區域序列設計，另一條引 物根據第170至第2071位序列設計，即按照插入位點處的水稻基因組序列設計。即該引物 對能夠特異性的擴增出具有部分外源基因序列和水稻基因組第7號染色體上序列的特異 序列。優選的，本發明采用的正向引物為RB-F，序列如SEQ ID No. 9所示，反向引物為RB-R， 序列如SEQ ID No. 10所示，利用該引物對進行PCR檢測，只有轉基因水稻EB7001S能獲得 長度為485bp的特異條帶（圖5)。引物對RB-F/RB-R對樣品中轉基因水稻EB7001S的成分 的檢測限度達到0.5% (圖9)。
[0045] 根據T-DNA左旁側序列（SEQ ID No. 6)設計特異性引物對，其中一條引物根據SEQ ID No. 6中第1至第1909位序列設計，即參照插入位點旁邊的水稻基因組序列設計，另一條 引物根據第1910至第2671位序列設計，即按照T-DNA左邊界上游序列設計。優選的，本發 明采用的正向引物為LB2-F，序列如SEQ ID No. 11所示，反向引物為LB2-R，序列如SEQ ID No. 12所示，利用該引物對進行PCR檢測，只有轉基因水稻EB7001S能獲得長度為629bp的 特異條帶（圖6)。引物對LB2-F/LB2-R對樣品中轉基因水稻EB7001S的成分的檢測限度達 到 0· 5% (圖 10)。
[0046] 本發明首次獲得了轉基因水稻品系EB7001S的插入外源基因的左、右旁側序列 (外源基因在水稻染色體上的插入位點及其上下游基因分布如圖4所示)，并且利用這兩個 旁側序列建立了靈敏高、特異性強的轉基因水稻EB7001S的品系特異性定性PCR檢測方法。 本發明所建立的轉基因水稻EB7001S特異性PCR檢測方法可以進一步應用于特異性檢測試 齊?盒的開發，以對轉基因活體Ot株、種子)、產品、提取物進行轉基因成分的定性檢測，通過 標準含量樣品的設置，還可實現定量檢測和定量檢測試劑盒的開發。
[0047] 本發明可以采用如下技術方案：
[0048] 1)獲得右旁側序列
[0049] 轉基因水稻EB7001S的外源基因在水稻染色體插入位置的右旁側序列，所述 T-DNA右邊界側的右旁側序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0050] 首先，通過hiTail-PCR擴增得到轉基因水稻EB7001S右旁側部分序列，如SEQ ID 此.2所示，全長15156?。11^&11-?0?所用特異性嵌套引物依據植物表達載體？033004?鄧 8 的T-DNA序列右邊界（RB)上游IacZ基因序列設計。植物表達載體pC3300-EpSps的資料 參考專利（201110270905. 7)。hiTail-PCR方法參考文獻（Liu et al·，2007, BioTechnique s，43 (5) : 649-456)，其中：所述引物包括長隨機引物LADl-LAD4,通用引物ACl，特異性嵌套 引物Rb-〇b、Rb-Ib和Rb-2b (引物序列見表1)。hiTail-PCR擴增獲得1515bp長的片斷。
[0051] 通過BLAST分析發現其中第1至第169位核苷酸序列與所用載體右邊界序列完 全一致；第170至第1515位序列與水稻基因組第7號染色體上（AP006451. 3)的序列的第 88469至第89820位高度匹配。
[0052] 其次，根據獲得的水稻基因組序列信息（AP006451. 3)設計引物對RBG-F/RBG-R， 序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，利用RBG-F和RBG-R引物對進行PCR擴增得到 647bp的轉基因水稻EB7001S的基因組序列，如SEQ ID No. 5所示，該段序列多次測序結果 均與NCBI數據庫所公布的水稻基因組序列（AP006451. 3)完全一致。
[0053] 分析SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 5序列發現二者有9 Ibp的序列重疊，將兩次擴增 獲得的兩個序列SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 5拼接得到右旁側序列SEQ ID No. 1，該序列全 長2071bp，包含第1至第169位的外源基因序列（載體序列）與第170至第2071位的水稻 基因組序列。
[0054] 2)獲得左旁側序列
[0055] 在本發明中，還提供了轉基因水稻EB7001S的外源基因在水稻染色體插入位置的 左旁側序列，所述T-DNA左邊界側的左旁側序列如SEQ ID No. 6所示。
[0056] 所述左旁側序列，如SEQ ID No. 6所示，它通過LD-PCR擴增得到，全長2671bp。具 體方法為：根據測序所得的右邊界序列以及已公布的水稻第7號染色體上的序列設計正向 引物LB1-F，序列如SEQ ID No. 7所示，根據載體pC3300-Epsps序列設計反向引物LB1-R， 序列如SEQ ID No. 8所示，用該引物對擴增獲得轉基因水稻EB7001S的左旁側序列，如SEQ ID No. 6所示，長度為2671bp。通過分析SEQ ID No. 6發現，獲得的序列第1至第1909位 與水稻基因組第7號染色體上部分序列（NCBI登錄號AP006451. 3上88465-90374位)完全 匹配，第1910位至第2671位與載體pC3300_Epsps的CaMV35S終止子部分序列完全相同。 接合處水稻基因組序列缺失3bp。
[0057] 3)基于右旁側序列的EB7001S轉化事件特異性檢測方法
[0058] 轉基因水稻品系EB7001S的外源插入片段的右旁側序列的定性PCR檢測方法，其 中，所述PCR反應中的兩條引物組合為T-DNA右邊界的旁側序列的特異性引物對：一條引物 依據SEQ ID No. 1中第1至第169位序列設計，另一條引物依據SEQ ID No. 1中第170至 第2071位序列設計。
[0059] 優選地，所述特異性引物對如下：
[0060] 正向引物RB-F，序列如SEQ ID No. 9所示，依據SEQ ID No. 1中第1至第169位序 列設計；
[0061] 反向引物RB-R，序列如SEQ ID No. 10所示，依據SEQ ID No. 1中第170至第2071 位序列設計；
[0062] 利用上述引物對進行PCR擴增，轉基因水稻品系EB7001S能獲得長度為485bp的 目的片段，非轉基因水稻及非該轉化事件的轉基因水稻不能獲得目的片斷或不能獲得大小 相同的目的片斷。
[0063] 4)基于左旁側序列的EB7001S轉化事件特異性檢測方法
[0064] 轉基因水稻品系EB7001S的外源插入片段的左旁側序列的定性PCR檢測方法，其 中，所述PCR反應中的兩條引物組合為外源基因插入位點處左旁側序列的特異性引物對： 一條引物依據SEQ ID No. 6中第1至第1909位序列設計，即插入位點處水稻基因組序列； 另一條引物依據SEQ ID No. 6中第1910至第2671位序列設計，S卩外源基因序列。
[0065] 優選地，所述特異性引物對如下：
[0066] 正向引物LB2-F，序列如SEQ ID No. 11所示，依據SEQ ID No. 6中第1至第1909 位序列設計；
[0067] 反向引物LB2-R，序列如SEQ ID No. 12所示，依據SEQ ID No. 6第1910至第2671 位序列設計；
[0068] 利用上述引物對進行擴增，轉基因水稻品系EB7001S能獲得長度為629bp的目的 片段，非轉基因水稻及非該轉化事件的轉基因水稻不能獲得目的片斷或不能獲得大小相同 的目的片斷。
[0069] 5)基于左、右旁側序列的多重PCR檢測方法
[0070] 依據SEQ ID No. 1中第1至第169位序列設計一條特異性引物，依據SEQ ID No. 1 中第170至第2071位序列設計一條特異性引物，獲得右旁側序列的特異性引物對；依據SEQ ID No. 6中第1至第1909位序列設計一條特異性引物，依據SEQ ID No. 6中第1910至第 2671位序列設計一條特異性引物，獲得左旁側序列的特異性引物對；以這兩個特異性引物 對同時擴增轉基因水稻基因組DNA，同時獲得左、右邊界的兩條目標特異帶。
[0071] 優選的，以特異性引物LB2-F、LB2-R、RB-F和RB-R對待測樣品DNA進行PCR擴增， 轉基因水稻EB7001S擴增獲得629bp和485bp的2條目的片段，其它所有水稻不會獲得條 帶或者上述相同大小的目標條帶。
[0072] 以下，通過實施例進一步詳細說明本發明，下列實施例中未注明具體條件的試驗 方法，按照常規條件進行，例如《分子克隆：實驗室手冊》中所述的條件，或按照相應生物學 試劑的制造廠商所建議的條件。
[0073] 實施例1 :轉基因水稻品系EB7001S右邊界旁側序列的擴增
[0074] I) DNA 的提取
[0075] CTAB法(王關林等，植物基因工程，北京：科學出版社，2009)。取2. OyL的DNA，用 1. 〇%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用微量紫外分光光度計測定DNA濃度。
[0076] 2) hiTaiI-PCR 分離 T-DNA 右旁側序列
[0077] 參照 Liu 等（Liu et al.，2007, BioTechniques, 43 (5) :649-456)的方法進行。 hiTail-PCR第1級反應使用4條長隨機引物（LAD1-LAD4)與特異性嵌套引物Rb-Ob組合， 以基因組DNA為模板進行PCR擴增，非轉基因水稻7001S作為對照。第1級PCR擴增反應 產物稀釋40倍用作第2級Tail-PCR反應的模板，第2級反應的引物組合為ACl/RB-lb。將 第2級反應產物稀釋10倍用作第3級反應的模板，引物組合為ACl/RB-2b。第二級和第三 級反應的擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離。所用引物序列見表1，擴增程序見表2。
[0078] 表 I :hiTail_PCR 所用引物
[0079]

【權利要求】
1. 一種核酸，該核酸為轉基因水稻EB7001S的旁側序列的核酸，所述轉基因水稻 EB7001S 的旁側序列為 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 1 的片段，SEQ ID No. 6 或 SEQ ID No. 6 的片段；其中，SEQ ID No. 1的片段至少包括SEQ ID No. 1的第149-190位的序列，優選至 少包括SEQ ID No. 1的第139-200位的序列，更優選至少包括SEQ ID No. 1的第129-210 位的序列；SEQ ID No. 6的片段至少包括SEQ ID No. 6的第1889-1930位的序列，優選至少 包括SEQ ID No. 6的第1879-1940位的序列，更優選至少包括SEQ ID No. 6的第1869-1950 位的序列。
2. -種檢測轉基因水稻的方法，該轉基因水稻為轉基因水稻EB7001S或者含有權利要 求1所述的核酸的轉基因水稻EB7001S的衍生水稻，該方法包括： (1) 使用針對權利要求1所述的核酸的特異性引物對，對取自待測水稻的核酸樣品進 行PCR擴增，得到PCR擴增后的產物； (2) 檢驗所述PCR擴增后的產物中是否含有所述特異性引物對擴增產生的特異性目的 片段；如果所述PCR擴增后的產物中含有所述特異性目的片段，則指示所述待測水稻為所 述轉基因水稻EB7001S或者含有權利要求1所述的核酸的衍生系。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中，所述特異性引物對包括針對SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特異性引物對，該引物對中的一條引物在SEQ ID No. 1的l-169bp區域 設計、另一條引物在SEQ ID No. 1的170-2071bp區域設計；所述特異性引物對包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述特異性引物對擴增產生的目的片段的 長度為485bp。
4. 根據權利要求3所述的方法，其中，PCR擴增的條件包括，退火溫度為56-61 °C。
5. 根據權利要求2所述的方法，其中，所述特異性引物對包括針對SEQ ID No. 6或 SEQ ID No. 6的片段的特異性引物對，該引物對中的一條引物在SEQ ID No. 6的l-1909bp 區域設計、另一條引物在1910_2671bp區域設計；所述特異性引物對包括SEQ ID No. 11所 示的核酸和SEQ ID No. 12所示的核酸；所述特異性引物對擴增產生的目的片段的長度為 629bp〇
6. 根據權利要求5所述的方法，其中，PCR擴增的條件包括，退火溫度為52-62°C。
7. -種試劑盒，該試劑盒包括右側特異性引物對和/或左側特異性引物對，其中，所述 右側特異性引物對包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述左側特 異性引物對包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12所示的核酸。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括陽性對照核酸，所述陽性對 照核酸包括SEQ ID No. 1所示的核酸和/或SEQ ID No. 6所示的核酸。
9. 根據權利要求7或8所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括dNTPs、PCR緩沖液和 耐高溫DNA聚合酶。
10. 權利要求7-9中任意一項所述的試劑盒在檢測轉基因水稻EB7001S或者含有權利 要求1所述的核酸的轉基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419708SQ201310362525
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】肖國櫻, 魏歲軍, 鄧力華 申請人:中國科學院亞熱帶農業生態研究所