一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統及方法
【專利摘要】一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統及方法，所述系統包括上容器、電極盤、下容器和細胞融合儀；電極盤上盤繞有絕緣管道，絕緣管道內部均勻植入偶數根金屬絲，一半金屬絲連接細胞融合儀的正極，另外一半連接細胞融合儀的負極；上容器通過上管道連接絕緣管道的入口端，絕緣管道的出口端通過下管道連接下容器。本發明系統及方法，將自體細胞從受體體內采集后與供體細胞通過體外細胞融合系統融合，通過調節場強達到促進細胞融合，及殺死自體細胞內的腫瘤細胞達到凈化的目的；本發明系統可不間斷的進行體外細胞融合，能夠滿足臨床治療中細胞量大的需求；本發明系統結構簡單，造價低廉，消毒方便，可以制成一次性制品，方便臨床治療使用。
【專利說明】一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學【技術領域】，特別涉及一種體外細胞融合系統及方法。
【背景技術】
[0002]骨髓移植是器官移植的一種:將正常骨髓細胞由靜脈輸入患者體內，以取代病變骨髓的治療方法。用以治療造血功能異常、免疫功能缺陷、血液系統惡性腫瘤及其他一些惡性腫瘤，特別是在白血病治療中療效明顯，有很多病人達到了長期緩解，由于在人群中很難找到HLA完全一致的供受者，因此，除同卵雙生的器官移植外，其他同種異體組織或器官移植都會發生排斥反應。為提高移植成功率，減輕或延緩移植排斥反應，除了防止感染外，主要措施是移植前組織配型和移植前、后免疫抑制療法及各項免疫學與組織學指標的監測。自體骨髓細胞移植是一種治療手段，但采集的自體細胞中含有大量腫瘤細胞，因此復發率高。有報道顯示細胞融合可以減少排斥反應，這一現象已經在試驗中得到證實。有文獻顯示適當的電流可以殺死腫瘤細胞而對正常組織細胞無損害。我們設想利用體外細胞融合的方法減少骨髓移植后的排斥反應，同時利用細胞融合時電流的作用殺死自身的腫瘤細胞，然而，目前世界上沒有大容量的細胞融合電極杯，使體外細胞融合在臨床治療方面受到極大的限制，因此，實有必要設計一種大容量的體外細胞融合系統以滿足臨床治療的需求。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于提供一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統及方法，以克服上述現有技術的不足。
[0004]為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
[0005]一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，包括上容器、電極盤、下容器和細胞融合儀；電極盤上盤繞有絕緣管道，絕緣管道內部均勻植入偶數根金屬絲，一半金屬絲連接細胞融合儀的正極，另外一半連接細胞融合儀的負極；上容器通過上管道連接絕緣管道的入口端，絕緣管道的出口端通過下管道連接下容器。
[0006]本發明進一步的改進在于:電極盤水平設置于位于其上方的上容器和位于其下方的下容器之間。
[0007]本發明進一步的改進在于:所述絕緣管道為內徑為0.4-0.6cm的塑料管。
[0008]本發明進一步的改進在于:金屬絲部分嵌入絕緣管道內壁，部分暴露于絕緣管道管腔內。
[0009]本發明進一步的改進在于:電極盤為絕緣圓盤或方盤。
[0010]本發明進一步的改進在于:上管道和下管道上均設有閥門。
[0011]本發明進一步的改進在于:金屬絲的直徑為0.1cm0
[0012]本發明進一步的改進在于:所述偶數根金屬絲為2根、4根或6根。
[0013]本發明進一步的改進在于:供體骨髓細胞和受體骨髓細胞融合在絕緣管道內融合時，細胞融合儀設置脈 沖幅度為40-200V電壓，脈沖寬度為10-60US ;控制細胞融合儀的脈沖間隔，使絕緣管道內細胞經過2-5個脈沖后流出。
[0014]采用提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統進行細胞融合的方法，包括以下步驟:將上、下管道上的閥門同時打開，讓上容器中的供體骨髓細胞和受體骨髓細胞沿上管道流入電極盤的絕緣管道內；控制細胞融合儀的脈沖間隔，使絕緣管道內細胞經過2-5個脈沖后流出；其中，細胞融合儀輸出的脈沖幅度為40-200V電壓，脈沖寬度為10-60US。
[0015]本發明進一步的改進在于:絕緣管道內細胞經過3個脈沖后流出，絕緣管道的長度為 15_50cm。
[0016]相對于現有技術，本發明具有以下有益效果:
[0017]本發明提供一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統及方法，將自體細胞從受體體內采集后與供體細胞通過體外細胞融合系統融合，通過調節場強促達到進細胞融合，及殺死自體細胞內的腫瘤細胞達到凈化的目的；本發明系統可不間斷的進行體外細胞融合，能夠滿足臨床治療的大量需求；本發明系統結構簡單，造價低廉，消毒方便，可以制成一次性制品，方便臨床治療使用。
[0018]目前骨髓移植后免疫排斥和移植后復發是影響骨髓移植成功的關鍵，通過體外細胞融合系統可以減少骨髓移植后免疫排斥和移植后復發。另外影響骨髓移植成功的另一關鍵是骨髓配型，本發明嘗試骨髓移植通過細胞融合的方法，減少免疫排斥，達到不需要配型目的，最低限度可以降低半相合骨髓移植免疫排斥反應。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明系統的結構示意圖；
[0020]圖2為體內腫瘤細胞增殖試`驗中三組對比試驗的結果示意圖；
[0021]圖3為體內小鼠生存試驗結果對比圖；
[0022]圖4 (a)為電擊殺傷腫瘤細胞結果示意圖，圖4 (b)為經過融合系統融合后正常骨髓細胞的示意圖；
[0023]圖5為塑料管的截面示意圖。
【具體實施方式】
[0024]請參閱圖1所示，本發明一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，包括上容器1、電極盤2、下容器3和細胞融合儀。
[0025]電極盤2為絕緣圓盤或方盤，電極盤2水平設置，其上盤繞內徑為0.4-0.6cm的塑料管，塑料管內部植入兩根直徑0.1cm的金屬絲21，兩金屬絲21上端連接細胞融合儀兩極。塑料管內的兩根金屬絲21不接觸。金屬絲21部分嵌入塑料管內壁，部分暴露于塑料管管腔內。
[0026]上容器I通過上管道連接電極盤2塑料管的入口端，塑料管的出口端通過下管道連接下容器3 ;上管道和下管道上均設有閥門。電極盤2水平設置于位于其上方的上容器I和位于其下方的下容器3之間。
[0027]如供體骨髓細胞和受體骨髓細胞融合時，細胞融合儀設置脈沖幅度為40-200V電壓，脈沖寬度為10-60US ;將上、下管道上的閥門同時打開，讓上容器I中的供體骨髓細胞和受體骨髓細胞沿上管道緩緩流入電極盤2的塑料管內(控制細胞融合儀的脈沖間隔，讓電極盤2上塑料管內細胞經過2-5個脈沖(優選3個脈沖)后流出)，這樣細胞融合儀可以調節每個脈沖的間距，如連續99個脈沖可以電融33xl5-50cm內的細胞(優選電極盤2中塑料管的長度為15-50cm)，然后從新再次操作細胞融合儀繼續進行融合。本發明系統可以不間斷的進行工作，解決了大容量細胞融合的難題。
[0028]請參閱圖5所示，優選的，本發明一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統中，塑料管內部植入六根直徑0.1cm的金屬絲21，六根金屬絲21間隔60度的嵌入塑料管的內壁上，相鄰的三根金屬絲21連接細胞融合儀的正極，另外相鄰的三根連接細胞融合儀的負極。設置六根金屬絲21能夠更進一步的增加細胞融合效果。
[0029]本發明是一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合方法，包括以下步驟:
[0030]I)連接好上容器1、電極盤2、下容器3和電融合儀；
[0031]2)將提取的受體和供體細胞混勻后放入上容器I中；
[0032]3)將上、下管道上的閥門同時打開，并開啟細胞融合儀，調節細胞融合儀輸出脈沖參數:脈沖幅度為40-200V電壓，脈沖寬度為10-60us ；
[0033]4)上容器中的受體和供體細胞流下在電極盤2上的塑料管內進行融合，塑料管內受體和供體干細胞在3個或更多脈沖后流出。
[0034]體內腫瘤細胞增殖試驗:將黑色素瘤細胞B16和供體骨髓細胞經過本發明方法進行細胞融合后注入小鼠體內(B16+骨髓細胞+融合)，并同時做了兩組對照試驗，一組注入黑色素瘤細胞(B16F1) 5x10s植入C57BL/6小鼠(6-8周齡)皮下(B16)，另一組注入黑色素瘤細胞(B16) 5x10s和供體骨髓細胞5xl05植入C57BL/6小鼠(6_8周齡)皮下(B16+骨髓細胞)。請參閱圖2所示，經動物實驗顯示細胞融合后骨髓細胞抑制腫瘤生長的能力大大增強；黑色素瘤細胞B16和供體骨髓細胞融合后體內不成瘤或成瘤能力降低。
[0035]體內小鼠生存試 驗:請參閱圖3所示，第一組(圖中B16+BM cell (fusion)):將融合細胞(黑色素瘤細胞(B16) 5x10s和和狗骨髓細胞5x10s)植入C57BL/6小鼠皮下；并同時做兩組對照試驗，一組(圖中B16)將腫瘤細胞以5xl05植入小鼠(3-4周齡)皮下；另一組(圖中B16+BM cell)注入未融合細胞(黑色素瘤細胞(B16)5x10s和狗骨髓細胞5x10s)植入C57BL/6小鼠皮下。從圖3可以發現細胞融合后的小鼠生存率明顯高于其它兩組，未融合組生存率最低。狗和小鼠是異種動物，但在兩種細胞融合后，免疫排斥減少，生存率提高，黑色素瘤細胞B16和狗骨髓細胞未融合組，體內發生強烈的免疫排斥，加上腫瘤細胞本身的影響導致生存率降低。
[0036]腫瘤細胞電擊實驗:請參閱圖4 (a)和圖4 (b)所示，將黑色素瘤細胞和正常骨髓細胞分別放入電融合系統，給予脈沖幅度200V，脈沖寬度為50ms，2個脈沖，放入6孔板，DMEM3ml，10%牛血清，C02培養箱內培養一天后顯微鏡下觀察，腫瘤細胞大部死亡，而骨髓細胞形態、數目基本正常。
【權利要求】
1.一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，包括上容器(I)、電極盤(2 )、下容器(3 )和細胞融合儀；電極盤(2 )上盤繞有絕緣管道，絕緣管道內部均勻植入偶數根金屬絲(21)，一半金屬絲(21)連接細胞融合儀的正極，另外一半連接細胞融合儀的負極；上容器(I)通過上管道連接絕緣管道的入口端，絕緣管道的出口端通過下管道連接下容器(3)。
2.根據權利要求1所述的一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，電極盤(2)水平設置于位于其上方的上容器(I)和位于其下方的下容器(3)之間。
3.根據權利要求1所述的一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，所述絕緣管道為內徑為0.4-0.6cm的塑料管。
4.根據權利要求1所述的一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，金屬絲(21)部分嵌入絕緣管道內壁，且部分暴露于絕緣管道管腔內。
5.根據權利要求1所述的一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，電極盤(2)為絕緣圓盤或方盤。
6.根據權利要求1所述的一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，上管道和下管道上均設有閥門，金屬絲(21)的直徑為0.1cm0
7.根據權利要求1所述的一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，所述偶數根金屬絲(21)為2根、4根或6根。
8.根據權利要求1所述的一種提 高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統，其特征在于，供體骨髓細胞和受體骨髓細胞融合在絕緣管道內融合時，細胞融合儀設置脈沖幅度為40-200V電壓，脈沖寬度為10-60US ;控制細胞融合儀的脈沖間隔，使絕緣管道內細胞經過2-5個脈沖后流出。
9.采用權利要求1至8中任一項所述的一種提高骨髓移植成功率的體外細胞融合系統進行細胞融合的方法，其特征在于，包括以下步驟:將上、下管道上的閥門同時打開，讓上容器(I)中的供體骨髓細胞和受體骨髓細胞沿上管道流入電極盤(2)的絕緣管道內；控制細胞融合儀的脈沖間隔，使絕緣管道內細胞經過2-5個脈沖后流出；其中，細胞融合儀輸出的脈沖幅度為40-200V電壓，脈沖寬度為10-60us。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，絕緣管道內細胞經過3個脈沖后流出，絕緣管道的長度為15-50cm。
【文檔編號】C12M1/42GK103451097SQ201310362301
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】劉鐵 申請人:西安交通大學