紫紅曲霉yh-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種紫紅曲霉YH-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲，用該菌株制備的酯化紅曲能促進(jìn)曲酒中以己酸乙酯為主的四種酯的合成，縮短曲酒的發(fā)酵周期，提高曲酒的優(yōu)質(zhì)品率。本發(fā)明的紫紅曲霉（Monascuspurpureus）YH-6菌株是從洋河酒廠股份有限公司自制的大曲中分離得到的，該菌株于2013年7月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)：CGMCC?No.7959。
【專利說(shuō)明】紫紅曲霉YH-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及釀酒領(lǐng)域中的紫紅曲霉菌YH-6菌株及其用途和由該囷株制備的酷化紅曲。
[0002]【背景技術(shù)】: 紅曲霉在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生多種酶類，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、酯化酶等。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，釀酒界對(duì)紅曲霉進(jìn)行了廣泛的探索和應(yīng)用研究，取得了突破性的進(jìn)展和良好的經(jīng)濟(jì)效益。紅曲霉種類較多，其中酯化紅曲主要由煙灰色紅曲霉和紫紅曲霉制成，紅曲霉胞外脂酶具有較強(qiáng)的催化己酸乙酯合成的能力，被稱為紅曲酶胞外己酸乙酯合成酶。酯化紅曲(紅曲霉的生物制劑)作為一種生物催化劑，在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中具有重要的作用。
[0003]酯化紅曲作為強(qiáng)化大曲菌種在產(chǎn)酯生香方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，為提高白酒中己酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質(zhì)的形成起到了不可替代的作用。因此，酯化紅曲的使用對(duì)提高己酸乙酯的含量，提高基酒優(yōu)質(zhì)品率效果明顯，經(jīng)濟(jì)效益顯著。此外，酯化紅曲應(yīng)用于黃水處理，可降低污水處理成本，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)釀酒副產(chǎn)物資源的再利用，使黃水中的COD、BOD含量在原有基礎(chǔ)上下降80%，并獲得一定經(jīng)濟(jì)效益。再者，酯化紅曲對(duì)提升二級(jí)酒的檔次提供重要的技術(shù)支持。二級(jí)酒中含有大量的有機(jī)酸和醇類，酯化紅曲可以催化二級(jí)酒中的有機(jī)酸與醇類的酯化合成反應(yīng)，促進(jìn)酒中酯類化合物的形成，從而改善二級(jí)酒的口味和品質(zhì)，增加優(yōu)級(jí)酒的產(chǎn)量。
[0004]雖然距酯化紅曲的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，不同的研究機(jī)構(gòu)和釀酒企業(yè)都開(kāi)展了酯化紅曲的研究，但實(shí)際大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用在國(guó)內(nèi)還很少，同時(shí)，現(xiàn)有的酯化紅曲存在著酯化率低的問(wèn)題也沒(méi)有到很好解決，本發(fā)明將促進(jìn)酯化紅曲的大規(guī)模推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種紫紅曲霉YH-6菌株及其用途和由該菌株制備的酯化紅曲，用該菌株制備的酯化紅曲能促進(jìn)曲酒中以己酸乙酯為主的四種酯的合成，縮短曲酒的發(fā)酵周期，提高曲酒的優(yōu)質(zhì)品率。
[0006]本發(fā)明的紫紅曲霉(ifoftascmYH-6菌株是從洋河酒廠股份有限公司自制的大曲中分離得到的，該菌株于2013年7月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號(hào)=CGMCC N0.7959。
[0007]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6,保藏號(hào)為:CGMCC N0.7959。
[0008]用上述的紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6制備的酯化紅曲。
[0009]上述的紫紅曲霉菌或酯化紅曲在曲酒發(fā)酵中的用途。
[0010]所述酯化紅曲制備包括以下步驟:
(I)將I g大曲粉加入裝有50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在32 °C下，100r/ m富集培養(yǎng)96 h，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)2次富集。富集3次后，稀釋涂布選擇性篩選平板，選取菌落顏色為紅色，同時(shí)，透明圈透明清晰，透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落劃線分離，純化得到純菌株；將純化后的菌株儲(chǔ)存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 °C冰箱保存；
(2)將步驟(1)低溫保存的菌種，用接種針挑取少許接種于100mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中100 r/m培養(yǎng)96 h，使菌絲球個(gè)數(shù)達(dá)到飽和；
(3)將步驟(2)的菌液以5%的接種量接入固態(tài)培養(yǎng)基，32 1:靜置培養(yǎng)20天，制成酯化紅曲。
[0011]所述富集培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為:麥芽汁培養(yǎng)基，自然pH，115 °C滅菌20min,然后再加乙醇5 %和滅過(guò)菌的乳酸4 %。。
[0012]選擇性平板培養(yǎng)基:在100 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯 1.5%，瓊脂 2 %，自然 pH，115 °C滅菌 20 min。
[0013]所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮培養(yǎng)基:麩皮100 8，乳酸0.4 mL，葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.5g, KH2PO4 0.1 g, MgSO4.7H20 0.1 g，水 70 mL, 115 °C滅菌 20 min 后加乙醇 5 mL。
[0014]菌種篩選步驟:
通過(guò)上述步驟(1)得到純菌株10株。將純化后的菌株儲(chǔ)存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 °C冰箱保存。
[0015]對(duì)得到的10株純菌株分別按上述步驟(2)和步驟(3)制備酯化紅曲，篩選的酯化力最高的紫紅曲霉菌株， 由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行26s RNA分子測(cè)序鑒定。分類命名為紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6。
[0016]菌落形態(tài)為:菌絲較緊密，菌絲蔓延性不強(qiáng)，形成圓形的菌落。菌落表面呈絨毛狀，中間有一突起，有向外呈放射狀的皺褶，邊緣較整齊。菌落干燥，無(wú)光澤，菌落顏色最初是白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落最后變?yōu)榧t褐色。打開(kāi)平板，菌落具有淡雅的香氣。
[0017]以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株，生產(chǎn)得到酯化紅曲粗酶制劑催化己酸合成己酸乙酯具有很強(qiáng)的專一性和選擇性，其最適催化溫度為35 °C，最適催化pH為3.5，最適催化酒精濃度為28 %，最適己酸濃度為I %，其適合應(yīng)用于濃香型白酒和黃水酯化液的生產(chǎn)中。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為篩選出的10株紫紅曲霉菌YH-6菌株酯化能力比較示意圖。
[0019]圖2為紫紅曲霉菌YH-6菌落形態(tài)示意圖(左為菌落正面，右為菌落反面)。
[0020]圖3為紫紅曲霉菌YH-6的26S rRNA系統(tǒng)發(fā)育示意圖。
[0021]圖4為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與時(shí)間曲線示意圖。
[0022]圖5為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與溫度曲線示意圖。
[0023]圖6為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與pH值曲線示意圖。
[0024]圖7為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與酒精濃度曲線示意圖。[0025]圖8為以紫紅曲霉菌YH-6為出發(fā)菌株制備的酯化紅曲，酯化力與己酸濃度曲線示意圖。
[0026]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1
三丁酸甘油酯、己酸、乙酸、乳酸、丁酸、乙醇等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。麩皮由農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上購(gòu)買。大曲粉為洋河酒廠股份有限公司自制。
[0027]準(zhǔn)備以下培養(yǎng)基備用
富集培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為:麥芽汁培養(yǎng)基，自然pH，115 °C滅菌20 min，然后再加乙醇5 %和滅過(guò)菌的乳酸4 %。。均為體積百分比。
[0028]選擇性平板培養(yǎng)基:在100 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯1.5%，瓊脂2 %，自然pH，115 °C滅菌20 min。均為體積百分比。
[0029]麩皮培養(yǎng)基:麩皮100 g，乳酸0.4 mL,葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.5 g，KH2PO4 0.1g, MgSO4.7H20 0.1 g，水 70 mL, 115 °C滅菌 20 min 后加乙醇 2.5 mL。
[0030]菌種篩選步驟:
(1)將Ig大曲粉加入裝有50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在32 °C下，100r/ m富集培養(yǎng)96 h，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有 富集培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)2次富集。富集3次后，稀釋涂布選擇性篩選平板，選取菌落顏色為紅色，同時(shí)，透明圈透明清晰，透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落劃線分離，純化直至得到純菌株(共得到10株)。將純化后的菌株儲(chǔ)存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 V冰箱保存。
[0031]對(duì)得到的10株純菌株分別制備酯化紅曲，制備步驟如下:
(2)將低溫保存菌種用接種針挑取少許接種于100mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中100 r/m培養(yǎng)96 h，使菌絲球個(gè)數(shù)達(dá)到飽和。
[0032](3)將步驟(2)的菌液以5 %的接種量接入麩皮培養(yǎng)基，32 1:靜置培養(yǎng)20天，制成酯化紅曲麩曲。
[0033]得到10種酯化紅曲麩曲，對(duì)其酯化力進(jìn)行篩選，步驟如下:
(4)稱取相當(dāng)于5 g干曲量的步驟(3)酯化紅曲麩曲，加入100 mL含I %己酸，20 %乙醇的酯化體系中(其余為水)，32 °C酯化100 h，加水50 mL蒸餾，接餾出液100 mL，最后用氣相色譜檢測(cè)反應(yīng)體系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定義為每100 mL餾出液中含己酸乙酯多少毫克。篩選酯化力最高的紫紅曲霉菌株。其中6號(hào)菌株制成的酯化紅曲麩曲，酯化力最高(180啤/ 100 mL)，如圖1所示。該菌株經(jīng)生工生物工程(上海)有限公司鑒定，將其命名為紫紅曲霉菌YH-6。該菌株于2013年7月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號(hào)=CGMCC N0.7959。
[0034]紫紅曲霉菌YH-6菌落形態(tài):菌絲較緊密，菌絲蔓延性不強(qiáng)，形成圓形的菌落。菌落表面呈絨毛狀，中間有一突起，有向外呈放射狀的皺褶，邊緣較整齊如圖2所示(左為菌落正面，右為菌落反面)。菌落干燥，無(wú)光澤，菌落顏色最初是白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落最后變?yōu)榧t褐色。打開(kāi)平板，菌落具有淡雅的香氣。
[0035]紫紅曲霉菌YH-6，由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行26s RNA分子測(cè)序鑒定。
[0036]利用PCR測(cè)序技術(shù)，得到待鑒定紫紅曲霉菌YH-6菌株的587 bp 26S rRNA基因D1/D2保守序列，結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.一種紫紅曲霉菌(Monascus purpureus) YH-6,保藏號(hào)為:CGMCC N0.7959。
2.用權(quán)利要求1所述的紫紅曲霉菌YH-6制備的酯化紅曲。
3.權(quán)利要求1所述的紫紅曲霉菌或權(quán)利要求2所述的酯化紅曲在曲酒發(fā)酵中的用途。
4.如權(quán)利要求2所述的酯化紅曲，其特征在于所述酯化紅曲制備包括以下步驟: (1)將Ig大曲粉加入裝有50 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在32 °C下，100r/ m富集培養(yǎng)96 h，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)2次富集，富集3次后，稀釋涂布選擇性篩選平板，選取菌落顏色為紅色，同時(shí)，透明圈透明清晰，透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落劃線分離，純化得到純菌株；將純化后的菌株儲(chǔ)存于麥芽汁固體培養(yǎng)基斜面上，4 °C冰箱保存； (2)將步驟(1)低溫保存的菌種，用接種針挑取少許接種于100mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中100 r/m培養(yǎng)96 h，使菌絲球個(gè)數(shù)達(dá)到飽和； (3)將步驟(2)的菌液以5%的接種量接入固態(tài)培養(yǎng)基，32 1:靜置培養(yǎng)20天，制成酯化紅曲。
5.如權(quán)利要求4所述的酯化紅曲，其特征在于:所述富集培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別為麥芽汁培養(yǎng)基，115 °C滅菌20 min，然后再加乙醇5 %和滅過(guò)菌的乳酸4 %。。
6.如權(quán)利要求4所述的酯化紅曲，其特征在于:選擇性平板培養(yǎng)基為在100mL麥芽汁培養(yǎng)基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯1.5%，瓊脂2 %，115 °C滅菌20 min。
7.如權(quán)利要求4所述的酯化紅曲，其特征在于:所述固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮培養(yǎng)基，由以下組分組成，麩皮 100 g，乳酸 0.4 mL，葡萄糖 0.5 g，蛋白胨 1.5 g, KH2PO4 0.1 g, MgSO4.7H20·0.1 g,水 70 mL, 115 °C滅菌 20 min 后加乙醇 2.5 mL。
【文檔編號(hào)】C12G3/02GK103589647SQ201310402204
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】胡沂淮 申請(qǐng)人:胡沂淮