一種快速鑒定扇貝品種的多重pcr引物及方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速鑒定扇貝品種的多重PCR引物及方法。屬于應用生物【技術領域】。快速鑒定扇貝品種的多重PCR引物，由櫛孔扇貝引物、華貴櫛孔扇貝引物、海灣扇貝引物和蝦夷扇貝引物組成。鑒定方法包括以下步驟：提取扇貝基因組總DNA，進行多重PCR擴增，根據瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小判定待檢測扇貝種類。櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝和華貴櫛孔扇貝的PCR產物條帶大小分別為514bp、367bp、205bp和149bp。本發明的鑒定引物及多重PCR方法可以靈敏、快速地確定待檢測扇貝樣品的種類，較傳統檢測方法具有操作簡單、可重復性強、成本低等優點。
【專利說明】—種快速鑒定扇貝品種的多重PCR引物及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及扇貝的鑒別方法，尤其是涉及一種快速鑒定四種扇貝品種的多重PCR引物及方法。
【背景技術】
[0002]扇貝屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Lamellibranchia)、翼形亞綱(Pterimorphia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae),是我國沿海主要的經濟養殖貝類之一。我國沿海主要養殖扇貝種類包括:柿孔扇貝/krreri)、華貴柿孔扇貝(Mimachlamys /7oAi7i5.)、海灣扇貝(Argopecten irrat/iafls)和蟲下夷扇貝{Mizuhopectenyessoensis)0柿孔扇貝主要養殖地為我國北部沿海,華貴柿孔扇貝主要養殖地為我國的東部和南部沿海，海灣扇貝為從美國引進品種，蝦夷扇貝為從日本和朝鮮引進品種。近年來，隨著現代科技對扇貝養殖技術的不斷成熟，扇貝養殖規模在山東、遼寧沿海地區不斷擴大，扇貝養殖已成為水產養殖的支柱產業。在扇貝遺傳育種以及加工貿易過程中，都需準確、快速地鑒定扇貝的種類。
[0003]傳統鑒定扇貝種類的方法主要依靠形態學標準進行，例如:殼色、大小、足絲孔、放射肋、棘等。但是，通常加工后的扇貝只留下閉殼肌，失去了形態學特征，不能利用傳統形態學對其進行鑒定。扇貝幼蟲還未形成可辨別的形態特征，也不能利用傳統形態學對其進行鑒定。因此，在一些情況下傳統的方法很難準確鑒定扇貝的種類。所以，亟需一種基于分子生物學技術的能夠快速、準確鑒定四種扇貝品種的方法。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種快速鑒定櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝和蝦夷扇貝等四種扇貝品種的多重PCR引物及方法，本發明的方法可以靈敏、快速地確定待檢測養殖扇貝樣品的種類，較傳統檢測方法具有操作簡單、可重復性強、成本低等優點。
[0005]本發明的目的是通過如下技術方案實現的:一種快速鑒定扇貝品種的多重PCR引物由櫛孔扇貝引物、海灣扇貝引物、蝦夷扇貝引物和華貴櫛孔扇貝引物組成。
[0006]所述的櫛孔扇貝引物的DNA序列為:
上游引物 Pl:5’ - ATACCCTCCGCTGTCGTCTA -3’ ；
下游引物 P2:5’ - CGCGTCTAATCCCACCGTAA -3’。
[0007]所述的海灣扇貝引物的DNA序列為:
上游引物 P3:5’ - TGTTCTGATCTTGCCTGGGT -3’ ；
下游引物 P4:5’ - AGCCACATCAAGACACGCAT -3’。
[0008]所述的蝦夷扇貝引物的DNA序列為:
上游引物 P5:5’ - TGTTGATCTTGGACCGGCAT -3’ ；
下游引物 P6:5’ - GCATACATCATTGCCACCGC -3’。
[0009] 所述的華貴櫛孔扇貝引物的DNA序列為:上游引物 P7:5’ - CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT -3’ ；
下游引物 P8:5’ - TCAGCCTTATACGCCTTGCC -3’。
[0010]上述的多重PCR引物用于鑒定櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝和蝦夷扇貝。
[0011]一種利用上述的多重PCR引物快速鑒定扇貝品種的方法，方法如下:
1)提取待檢測扇貝樣品的基因組總DNA，無菌超純水溶解DNA，調節DNA濃度為5-12ng/yL，制備樣品 DNA;
2)利用上述的多重PCR引物對樣品DNA進行多重PCR擴增；
3)PCR反應結束后，取產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測；根據瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小判定待檢測扇貝的種類:如果出現大小為514bp的條帶說明樣品為櫛孔扇貝；如果出現大小為367bp的條帶說明樣品為海灣扇貝；如果出現大小為205bp的條帶說明樣品為蝦夷扇貝；如果出現大小為149bp的條帶說明樣品為華貴櫛孔扇貝。
[0012]上述步驟2)中多重PCR擴增的反應體系為:5yL 10XPCR buffer,4y L濃度為
2.5mM的dNTP，0.4 μ L濃度為5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8種濃度分別為0.2mM的Pl- P8弓丨物各2 μ L，I μ L樣品DNA，無菌超純水補齊到50 μ L0
[0013]上述步驟2)中多重PCR擴增的反應條件為:95°C預變性5min ;94°C變性45sec，59°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 30 個循環；72°C延伸 7min。
[0014]本發明的有益效果是:本發明利用來自扇貝的線粒體基因組COI基因序列設計合成了四對針對四種不同扇貝品種的特異性PCR引物，并利用此引物建立了一個多重PCR反應，實現了利用分子生物學方法快速鑒定四種扇貝品種的新方法。本方法具有操作簡單、重復性好、準確、快速、靈敏等優點。本發明主要應用于扇貝種質資源保護、遺傳育種以及產品鑒定等領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為實施例1鑒定的四種已知扇貝的PCR電泳檢測結果，泳道M為DL1000 DNAMarker,泳道I為柿孔扇貝，泳道2為海灣扇貝，泳道3為奸夷扇貝，泳道4為華貴柿孔扇貝。
[0016]圖2為實施例2快速鑒定市購扇貝的PCR電泳檢測結果，泳道M為DL1000 DNAMarker,泳道I為樣本扇貝，結果顯示待鑒定扇貝品種為柿孔扇貝。
[0017]圖3為實施例3快速鑒定市購扇貝的PCR電泳檢測結果，泳道M為DL1000 DNAMarker，泳道I為樣本扇貝，結果顯示待鑒定扇貝品種為華貴櫛孔扇貝。
[0018]圖4為實施例4快速鑒定市購扇貝的PCR電泳檢測結果，泳道M為DL1000 DNAMarker，泳道I為樣本扇貝，結果顯示待鑒定扇貝品種為海灣扇貝。
[0019]圖5為實施例5快速鑒定市購扇貝的PCR電泳檢測結果，泳道M為DL1000 DNAMarker,泳道I為樣本扇貝，結果顯示待鑒定扇貝品種為奸夷扇貝。
【具體實施方式】
[0020]下面的實施例是對本發明進一步的說明，但并不因此而限制本發明。
[0021]實施例1 一種快速鑒定扇貝品種的方法
I)分別取已知品種為櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝和蝦夷扇貝的四種扇貝，分別取扇貝的閉殼肌組織，剪碎，按照常規酚氯仿法提取樣品的DNA，用無菌超純水溶解DNA樣品，調節DNA濃度為8ng/ μ L，分別制備樣品DNA，即分別得到櫛孔扇貝樣品DNA、華貴櫛孔扇貝樣品DNA、海灣扇貝樣品DNA和蝦夷扇貝樣品DNA ；
2)分別對不同品種的樣品DNA進行多重PCR擴增:具體步驟如下:PCR反應體系為:5μ L IOXPCR buffer,4y L 濃度為 2.5mM 的 dNTP，0.4 μ L 濃度為 5υ/μ1 的 DNA 聚合酶，8種濃度分別為0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，1 μ L樣品DNA，加無菌超純水補齊到50 μ L;PCR反應條件為:95°C預變性5min ;94°C變性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸7min ;擴增完成后PCR產物于4°C保存；
3)PCR反應結束后，取5 μ L PCR產物與1 μ L上樣緩沖液混勻，上樣于3%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker采用DL1000 (寶生物工程(大連)有限公司)，然后進行100V恒壓電泳，電泳約30min，EB染色，在紫外燈下觀察結果；
4)PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示:櫛孔扇貝樣品DNA出現大小為514bp的條帶；海灣扇貝樣品DNA出現大小為367bp的條帶；蝦夷扇貝樣品DNA出現大小為205bp的條帶；華貴柿孔扇貝樣品DNA出現大小為149bp的條帶。
[0022]實施例2 —種快速鑒定扇貝品種的方法
1)取市購扇貝的閉殼肌組織，剪碎，按照常規酚氯仿法提取樣品的DNA，用無菌超純水溶解DNA樣品，調節DNA濃度為8ng/ μ L，制備樣品DNA ；
2)對樣品DNA進行多重PCR擴增:具體步驟如下:PCR反應體系為:5yL10XPCRbuffer, 4 μ L濃度為2.5mM的dNTP，0.4 μ L濃度為5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8種濃度分別為0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，1μ L樣品DNA，加無菌超純水補齊到50 μ L ；PCR反應條件為:95°C預變性5min ;94°C變性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸7min ;擴增完成后PCR產物于4°C保存；
3)PCR反應結束后，取5 μ L PCR產物與1 μ L上樣緩沖液混勻，上樣于3%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker采用DL1000 (寶生物工程(大連)有限公司)，然后進行100V恒壓電泳，電泳約30min，EB染色，在紫外燈下觀察結果，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示:出現大小為514bp的條帶,說明此扇貝為柿孔扇貝品種。
[0023]實施例3 —種快速鑒定扇貝品種的方法
1)取市購扇貝的閉殼肌組織，剪碎，按照常規酚氯仿法提取樣品的DNA，用無菌超純水溶解DNA樣品，調節DNA濃度為8ng/ μ L，制備樣品DNA ；
2)對樣品DNA進行多重PCR擴增:具體步驟如下:PCR反應體系為:5yL10XPCRbuffer, 4 μ L濃度為2.5mM的dNTP，0.4 μ L濃度為5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8種濃度分別為0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，1 μ L樣品DNA，加無菌超純水補齊到50 μ L ；PCR反應條件為:95°C預變性5min ;94°C變性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸7min ;擴增完成后PCR產物于4°C保存；
3)PCR反應結束后，取5 μ L PCR產物與1 μ L上樣緩沖液混勻，上樣于3%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker采用DL1000 (寶生物工程(大連)有限公司)，然后進行100V恒壓電泳，電泳約30min，EB染色，在紫外燈下觀察結果，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3所示:出現大小為149bp的條帶，說明此扇貝為華貴櫛孔扇貝品種。
[0024]實施例4 一種快速鑒定扇貝品種的方法
1)取市購扇貝的閉殼肌組織，剪碎，按照常規酚氯仿法提取樣品的DNA，用無菌超純水溶解DNA樣品，調節DNA濃度為8ng/ μ L，制備樣品DNA ；
2)對樣品DNA進行多重PCR擴增:具體步驟如下:PCR反應體系為:5yLIOXPCRbuffer, 4 μ L濃度為2.5mM的dNTP，0.4 μ L濃度為5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8種濃度分別為0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，I μ L樣品DNA，加無菌超純水補齊到50 μ L ；PCR反應條件為:95°C預變性5min ;94°C變性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸7min ;擴增完成后PCR產物于4°C保存；
3)PCR反應結束后，取5 μ L PCR產物與I μ L上樣緩沖液混勻，上樣于3%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker采用DL1000 (寶生物工程(大連)有限公司)，然后進行100V恒壓電泳，電泳約30min，EB染色，在紫外燈下觀察結果，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖4所示:出現大小為367bp的條帶，說明此扇貝為海灣扇貝品種。
[0025] 實施例5 —種快速鑒定扇貝品種的方法
1)取市購扇貝的閉殼肌組織，剪碎，按照常規酚氯仿法提取樣品的DNA，用無菌超純水溶解DNA樣品，調節DNA濃度為8ng/ μ L，制備樣品DNA ；
2)對樣品DNA進行多重PCR擴增:具體步驟如下:PCR反應體系為:5yL10XPCRbuffer, 4 μ L濃度為2.5mM的dNTP，0.4 μ L濃度為5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8種濃度分別為0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，I μ L樣品DNA，加無菌超純水補齊到50 μ L ；PCR反應條件為:95°C預變性5min ;94°C變性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸7min ;擴增完成后PCR產物于4°C保存；
3)PCR反應結束后，取5 μ L PCR產物與I μ L上樣緩沖液混勻，上樣于3%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker采用DL1 000 (寶生物工程(大連)有限公司)，然后進行100V恒壓電泳，電泳約30min，EB染色，在紫外燈下觀察結果，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖5所示:出現大小為205bp的條帶,說明此扇貝為奸夷扇貝品種。
【權利要求】
1.一種快速鑒定扇貝品種的多重PCR引物，其特征在于多重PCR弓丨物由櫛孔扇貝引物、海灣扇貝引物、蝦夷扇貝引物和華貴櫛孔扇貝引物組成； 所述的櫛孔扇貝引物的DNA序列為: 上游引物 Pl:5’ - ATACCCTCCGCTGTCGTCTA -3’ ； 下游引物 P2:5’ - CGCGTCTAATCCCACCGTAA -3’ ； 所述的海灣扇貝引物的DNA序列為: 上游引物 P3:5’ - TGTTCTGATCTTGCCTGGGT -3’ ； 下游引物 P4:5’ - AGCCACATCAAGACACGCAT -3，； 所述的蝦夷扇貝引物的DNA序列為: 上游引物 P5:5’ - TGTTGATCTTGGACCGGCAT -3’ ； 下游引物 P6:5’ - GCATACATCATTGCCACCGC -3’ ； 所述的華貴櫛孔扇貝引物的DNA序列為: 上游引物 P7:5’ - CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT -3’ ； 下游引物 P8:5’ - TCAGCCTTATACGCCTTGCC -3’。
2.權利要求1所述的多重PCR引物在鑒定櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝和蝦夷扇貝中的應用。
3.一種利用權利要求1所述的多重PCR引物快速鑒定扇貝品種的方法，其特征在于方法如下: 1)提取待檢測扇貝樣品的基因組總DNA，無菌超純水溶解DNA，調節DNA濃度為5_12ng/U L，制備樣品DNA ； 2)利用權利要求1所述的多重PCR引物對樣品DNA進行多重PCR擴增； 3)PCR反應結束后，取產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測；根據瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小判定待檢測扇貝的種類:如果出現大小為514bp的條帶說明樣品為櫛孔扇貝；如果出現大小為367bp的條帶說明樣品為海灣扇貝；如果出現大小為205bp的條帶說明樣品為蝦夷扇貝；如果出現大小為149bp的條帶說明樣品為華貴櫛孔扇貝。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述多重PCR擴增的反應體系為:5yL IOXPCR buffer, 4 μ L 濃度為 2.5mM 的 dNTP，0.4 μ L 濃度為 5U/yL 的 DNA聚合酶，8種濃度分別為0.2mM的P1-P8引物各2 μ L，I μ L樣品DNA，無菌超純水補齊到50 μ L0
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述多重PCR擴增的反應條件為:95°C預變性 5min ;94°C變性 45sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 30 個循環；72°C延伸7min。
【文檔編號】C12N15/11GK103602738SQ201310566790
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月12日 優先權日:2013年11月12日
【發明者】劉宏生, 艾海新, 張力, 趙健 申請人:遼寧大學