巨大芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶共表達載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】一種基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的巨大芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶共表達載體及其構(gòu)建方法，首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據(jù)設(shè)計出的PCR引物擴增出含有酶切位點亞硝酸鹽還原酶大亞基(Bm-Nas?D)和小亞基(Bm-Nas?E)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-1上，通過菌落PCR技術(shù)挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5α的陽性克隆。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中由于亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴(yán)重限制使用效果，實現(xiàn)極大的提高該基因的表達量。
【專利說明】巨大芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶共表達載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的方法，具體是一種亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列、含有該基因的重組載體、重組菌以及利用該重組菌產(chǎn)生該基因的表達產(chǎn)物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]從環(huán)境角度來講，N元素的積累，可造成肥料的浪費而且影響作物生長及土壤利用，同時可通過農(nóng)田的地表徑流和農(nóng)田滲漏，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)面源污染；從食品安全角度來講，人體攝入過量的硝酸鹽后，在體內(nèi)硝酸鹽(NO3-)容易還原成亞硝酸鹽(NO2-),亞硝酸鹽能使細胞中攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成無攜氧能力的高鐵蛋白而造成組織缺氧，不僅如此，被氧化成的高鐵蛋白還會降低已攜有氧的氧合血紅蛋白向身體組織釋放氧的功能，使人體缺氧，嚴(yán)重時有使人窒息死亡的危險。更可怕的是亞硝酸鹽和二甲胺、三甲胺作用后會生成亞硝胺。亞硝胺是一種具有強烈致癌性的化合物，在已發(fā)現(xiàn)的120種亞硝胺類化合物中，75%被確認(rèn)有致癌性，亞硝胺還有引起遺傳變異和怪胎的潛在危險，一旦這種物質(zhì)進入蔬菜，對人的影響是非常可怕的。因此，如何快速消除環(huán)境中殘存的亞硝酸鹽，便成為接下工作的重中之重。
[0003]生物修復(fù)法尤其是生物酶法的出現(xiàn)，為快速降解環(huán)境中的亞硝酸鹽提供了一個新的方法。但是一般而言亞硝酸鹽還原酶在微生物體內(nèi)的表達量很低，不能滿足修復(fù)環(huán)境的要求，于是構(gòu)建一種高效的亞硝酸鹽還原酶表達載體，實現(xiàn)亞硝酸鹽還原酶的高效表達就顯得尤為關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種巨大芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶共表達載體及其構(gòu)建方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中由于亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴(yán)重限制使用效果，應(yīng)用基因工程菌表達本發(fā)明所述的亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列，實現(xiàn)極大的提聞該基因的表達量。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]本發(fā)明涉及一種巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)亞硝酸鹽還原酶共表達載體，其核苷酸序列由亞硝酸鹽還原酶大亞基Bm-Nas DjBSeq ID N0.1所示，以及亞硝酸鹽還原酶小亞基Bm-Nas EjnSeq ID N0.2所示組成。
[0007]所述的亞硝酸鹽還原酶是由亞硝酸鹽還原酶大亞基和小亞基組成，對應(yīng)基因序列分別由2415和327個堿基對組成。
[0008]所述的共表達載體為包含所述亞硝酸鹽還原酶大亞基Bm-Nas D和亞硝酸鹽還原酶小亞基Bm-Nas E的pETDuet-Ι質(zhì)粒。
[0009]所述的共表達載體通過以下方式構(gòu)建得到:首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據(jù)設(shè)計出的PCR引物擴增出含有酶切位點亞硝酸鹽還原酶大亞基(Bm-Nas D)和小亞基(Bm-Nas E)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-Ι上，通過菌落PCR技術(shù)挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5 α的陽性克隆。
[0010]所述的大腸桿菌DH5 α的陽性克隆是指:含有重組表達質(zhì)粒pETDuet-l-Bm-NasD-NasE 的大腸桿菌 BL21 (DE3)。
[0011]本發(fā)明涉及上述大腸桿菌DH5CI的陽性克隆的應(yīng)用，將其發(fā)酵后修復(fù)次生鹽潰化土壤。
[0012]所述的應(yīng)用進一步是指:將該共表達載體倒入大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)，通過加入IPTG進行誘導(dǎo)，使該重組菌表達出具有生物學(xué)活性的硝酸鹽還原酶，進而優(yōu)化發(fā)酵條件提高硝酸鹽還原酶的表達量，最終實現(xiàn)酶制劑法修復(fù)次生鹽潰化土壤。
技術(shù)效果
[0013]亞硝酸鹽還原酶基因序列在天然的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)中表達量非常低，嚴(yán)重限制了使用效果。本發(fā)明通過構(gòu)建重組共表達菌株，實現(xiàn)了亞硝酸鹽還原酶大亞基和小亞基的外源共表達，在保證亞硝酸鹽還原酶表達量的同時也維持了其良好的生物學(xué)活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為實施例中pETDuet-l-Bm-Nas D重組載體驗證電泳圖。
[0015]圖2為實施例中pETDuet-l-Bm-Nas D-Nas E重組載體驗證電泳圖。
【具體實施方式】
[0016]下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操`作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
[0017]巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)NCT-2 的培養(yǎng)
[0018]巨大芽孢桿菌NCT-2分離自上海市崇明島設(shè)施栽培12-15年的大棚，保藏編號為CGMCC N0.4698，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)微生物研究所；保存日期為2011年3月21日。將該菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)OD6tltl至1.5左右，離心收集菌體用于提取細菌的基因組DNA。
[0019]所述的LB液體培養(yǎng)基組分為:蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，去離子水1L，PH6.8-7.2。LB固體培養(yǎng)基即為在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加15_20g的瓊脂。
實施例2
[0020]pETDuet-l-Bm-Nas D 重組載體的構(gòu)建
[0021]根據(jù)測序得到的亞硝酸鹽還原酶電子轉(zhuǎn)移亞基(Bm-Nas D)基因序列，設(shè)計相應(yīng)引物擴增該基因并分別連接到pETDuet-Ι共表達載體上。
[0022]設(shè)計引物如下:
[0023]正向引物Nas D-BamH 1-F:
[0024]5’-CGGGATCCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3’[0025]反向引物Nas D-EcoR 1-R:
[0026]5’-CGGAATTCTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3’
[0027]上下游引物的5’端分別設(shè)計了 BamH I和EcoR I酶切位點用于連接共表達載體pETDuet-Ι，用含有酶切位點的引物擴增亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列并將PCR產(chǎn)物連接pMD19-T(Simple)載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)。挑取陽性克隆搖菌并回收其質(zhì)粒，然后用BamH I和EcoR I雙酶切，回收含有亞硝酸鹽還原酶大亞基的片段Bm-Nas D’。用相同的內(nèi)切酶酶切共表達載體pETDuet-Ι并回收酶切產(chǎn)物。將片段Bm-NasD’與pETDuet-Ι酶切產(chǎn)物混合，用T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)，通過菌落PCR篩選含有重組共表達質(zhì)粒pETDuet-l-Bm-Nas D的陽性克隆(見圖1)。挑取陽性克隆，搖菌(培養(yǎng)基中氨芐青霉素濃度為50 μ g/ml) 16小時并提取其質(zhì)粒。
[0028]所述的菌落PCR條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，56°C退火30s，72°C延伸90s ；30個循環(huán)后72°C終延伸IOmin。
實施例3
[0029]pETDuet-l-Bm-Nas D-Nas E 重組載體的構(gòu)建
[0030]根據(jù)測序得到的亞硝酸鹽還原酶小亞基(Bm-Nas E)基因序列，設(shè)計相應(yīng)引物擴增該基因并連接到pETDuet-l-Bm-Nas D重組載體上。
[0031]設(shè)計引物如下:
[0032]正向引物Nas E-Kpn 1-F:
[0033]5’-GGGGTACCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3，
[0034]反向引物Nas E-Xho 1-R:
[0035]5’-CCGCTCGAGTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3’
[0036]用含有Kpn I和Xho I酶切位點的引物擴增亞硝酸鹽還原酶小亞基基因序列并將PCR產(chǎn)物連接pMD19-T (Simple)載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)。挑取陽性克隆搖菌并回收其質(zhì)粒，然后用Kpn I和Xho I雙酶切，回收含有亞硝酸鹽還原酶催化亞基的片段Bm-Nas Ε’。用相同的內(nèi)切酶酶切pETDuet-l-Bm-Nas D質(zhì)粒并回收酶切產(chǎn)物。將片段 Bm-Nas Ε’ 與 pETDuet-1-Bm-Nas D 酶切產(chǎn)物混合，用 T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)，通過菌落PCR篩選含有重組共表達質(zhì)粒 pETDuet-l-Bm-Nas D-Nas E 的陽性克隆(見圖 2)。
[0037]所述的菌落PCR條件為:95°C預(yù)變性3min ;94°C變性40s，54°C退火30s，72°C延伸30s ；30個循環(huán)后72°C終延伸IOmin。
【權(quán)利要求】
1.一種巨大芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶共表達載體，其特征在于，其核苷酸序列由亞硝酸鹽還原酶大亞基Bm-Nas DjnSeq ID N0.1所示，以及亞硝酸鹽還原酶小亞基Bm-Nas E,如Seq ID N0.2所示組成。
2.—種pETDuet-Ι質(zhì)粒，其特征在于，包含權(quán)利要求1中所述的亞硝酸鹽還原酶大亞基Bm-Nas D和亞硝酸鹽還原酶小亞基Bm-Nas E。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的共表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于，首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據(jù)設(shè)計出的PCR引物擴增出含有酶切位點亞硝酸鹽還原酶大亞基(Bm-Nas D)和小亞基(Bm-Nas E)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-Ι上，通過菌落PCR技術(shù)挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5 α的陽性克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的依次連接包括: 1)將Bm-NasD基因連接到pETDuet-Ι共表達載體上； 2)將Bm-NasE基因連接到pETDuet-l-Bm-Nas D重組載體上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征是，所述的PCR引物由 用于將Bm-Nas D基因并分別連接到pETDuet-Ι共表達載體上的 正向引物 Nas D-BamH 1-F:
5’ -CGGGATCCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3’，以及 反向引物 Nas D-EcoR 1-R:
5’-CGGAATTCTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3’，和 用于將Bm-Nas E基因連接到pETDuet-l-Bm-Nas D重組載體上的 正向引物Nas E-Kpn 1-F:
5’ -GGGGTACCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3’，以及 反向引物Nas E-Xho 1-R:
5’ -CCGCTCGAGTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3’ 組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌DH5ci的陽性克隆是指:含有重組表達質(zhì)粒pETDuet-l-Bm-Nas B-Nas C的大腸桿菌BL21 (DE3)。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述大腸桿菌DH5ci的陽性克隆的應(yīng)用，其特征在于，將其發(fā)酵后修復(fù)次生鹽潰化土壤。
8.一種涉及上述任一權(quán)利要求所述的共表達載體的應(yīng)用，其特征是，將該共表達載體倒入大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)，通過加入IPTG進行誘導(dǎo)，使該重組菌表達出具有生物學(xué)活性的硝酸鹽還原酶，進而優(yōu)化發(fā)酵條件提高硝酸鹽還原酶的表達量，最終實現(xiàn)酶制劑法修復(fù)次生鹽潰化土壤。
【文檔編號】C12R1/11GK103614404SQ201310571824
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】周培, 馮海瑋, 時唯偉, 支月娥, 劉群錄, 陸偉, 初少華, 孫玉靜, 衛(wèi)星 申請人:上海交通大學(xué)