一種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。該用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒包括一盒體，該盒體內(nèi)至少設(shè)有緩沖液放置區(qū)、明膠放置區(qū)、培養(yǎng)基放置區(qū)。采用本實(shí)用新型所提供的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，具有結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的特點(diǎn)，有助于實(shí)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的高純度和高效分離培養(yǎng)。
【專利說明】—種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞是廣泛存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中的多能干細(xì)胞，具有良好增殖能力和多向分化潛能，在特定條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞等功能性細(xì)胞分化。因?yàn)镸SCs來源方便，易于分離、體外擴(kuò)增和純化，且在傳代擴(kuò)增后仍可保持干性，因此是組織工程、基因工程和細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞來源。此外，MSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，在移植中具有低免疫原性的特點(diǎn)，在終末期肝病等終末期疾病以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前已經(jīng)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)研究證實(shí)，在終末期肝病治療中，MSCs移植能夠明顯改善患者的肝功能；而將皮膚角質(zhì)細(xì)胞與MSCs混合后進(jìn)行移植，可有效延長移植皮膚的存活時間并減少異體移植物抗免疫疾病(graft vs host disease, GVHD)。對于MSCs免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究認(rèn)為，MSCs主要通過旁分泌作用，產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)因子，作用于免疫細(xì)胞后，誘導(dǎo)免疫耐受，從而發(fā)揮調(diào)控機(jī)體的免疫的作用。
[0004]此外，通過將MSCs進(jìn)行基因修飾，把IFN β、EPO等基因?qū)肫浠蚪M中，可獲得能夠在體內(nèi)長時間穩(wěn)定表達(dá)該蛋白或細(xì)胞因子的功能性細(xì)胞。吳祖澤等人把HGF的基因?qū)隡SCs中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HGF基因轉(zhuǎn)染的人骨髓MSC仍維持原有的增殖和分化能力，而對體外細(xì)胞免疫反應(yīng)具有更強(qiáng)的抑制效果，因此在組織器官移植中存在更大的潛在應(yīng)用價值(邊莉，郭子寬，艾輝勝，王華，孟二紅，吳祖澤，王立生；HGF基因修飾增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊；2006，30(4):323-328)。正因如此，目前各國均投入大量人力物力經(jīng)費(fèi)進(jìn)行廣泛和深入的研究。但所有的研究或治療方案都必須建立在足夠量MSCs獲取的基礎(chǔ)上，因此建立穩(wěn)定有效快速的MSCs分離、擴(kuò)增、質(zhì)量控制的技術(shù)體積具有重要的意義。
[0005]在人體組織中，骨髓中存在大量的MSCs，然而隨著年齡老化，自體骨髓中的MSCs的數(shù)目會顯著降低、且增殖能力也會大幅衰退。同時，為保證自體或供體安全，對骨髓MSCs的采集技術(shù)要求嚴(yán)格，配套儀器精密、成本高，不宜應(yīng)用推廣。因此，對于骨髓以外來源的研究越來越被重視。目前，不同的研究已經(jīng)從圍產(chǎn)期的胎盤、臍帶、臍帶血，抽脂術(shù)來源的脂肪以及流產(chǎn)胎兒中分離獲得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而這些組織中，臍帶屬于醫(yī)療廢棄物，具有易于獲得、來源穩(wěn)定可控、無倫理爭議問題的特點(diǎn)，具有良好的研究價值和應(yīng)用前景。
[0006]但是，目前還沒有能夠較好地實(shí)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離和傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的方法及試劑盒，這是本領(lǐng)域亟待解決的問題之一。
實(shí)用新型內(nèi)容[0007]為解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,MSCs)的試劑盒,該試劑盒包含各種試劑和器皿，便于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型提供了一種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，該用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒包括一盒體，該盒體內(nèi)至少設(shè)有緩沖液放置區(qū)、明膠放置區(qū)、培養(yǎng)基放置區(qū)。
[0009]在上述用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，優(yōu)選地，所述緩沖液放置區(qū)設(shè)有第一緩沖液瓶。
[0010]在上述用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，優(yōu)選地，所述明膠放置區(qū)設(shè)有盛裝明膠的容器。
[0011]在上述用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基放置區(qū)設(shè)有第一廣口瓶。該第一廣口瓶用于盛裝培養(yǎng)基，例如BPS-SFM無血清培養(yǎng)基。
[0012]在上述用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，優(yōu)選地，所述盒體內(nèi)還設(shè)有酶放置區(qū)和生理鹽水放置區(qū)。
[0013]在上述用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，優(yōu)選地，所述酶放置區(qū)設(shè)有棕色塑料瓶和透明廣口瓶。棕色塑料瓶用于盛裝膠原酶A或者膠原酶A與中性蛋白酶的混合液。透明廣口瓶用于盛裝胰酶。
[0014]在上述用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，優(yōu)選地，所述生理鹽水放置區(qū)設(shè)有第二廣口瓶。該第二廣口瓶用于盛裝生理鹽水。
[0015]在上述用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒中，優(yōu)選地，所述緩沖液放置區(qū)設(shè)有第二緩沖液瓶。該第二緩沖液瓶用于盛裝PBS緩沖液，例如含青霉素-鏈霉素且無Ca2+、Mg2+的 PBS 緩沖液。
[0016]本實(shí)用新型提供的上述試劑盒可以按照以下步驟進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):
[0017]取出緩沖液放置區(qū)中盛裝PBS緩沖液的第一緩沖液瓶，用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污；
[0018]將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時去除臍動脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠均勻剪碎，得到華通氏膠組織塊；
[0019]取出盛裝明膠的容器，利用明膠對培養(yǎng)皿進(jìn)行鋪被，用培養(yǎng)基重懸剪碎的華通氏膠組織塊，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
[0020]當(dāng)本實(shí)用新型提供的上述試劑盒包括酶放置區(qū)和生理鹽水放置區(qū)時，可以按照以下步驟進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):
[0021 ] ( I)取出緩沖液放置區(qū)中盛裝PBS緩沖液的第一緩沖液瓶，用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污；
[0022](2)將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時去除臍動脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠均勻剪碎；
[0023]取出棕色塑料瓶，向剪碎的華通氏膠中加入膠原酶A或者膠原酶A與中性蛋白酶的混合液，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理；[0024](3)消化處理之后，進(jìn)行離心處理并收集細(xì)胞和殘余組織，利用PBS緩沖液洗去殘留酶，再次進(jìn)行離心分離，棄去上層清液；
[0025](4)取出透明廣口瓶和第二廣口瓶，向棄去上層清液后的剩余物中加入胰酶，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理，加入生理鹽水混勻，離心分離，棄去上層清液；
[0026](5)取出盛裝無血清培養(yǎng)基的第一廣口瓶和盛裝明膠的容器，利用明膠對培養(yǎng)皿進(jìn)行鋪被，用MSCs培養(yǎng)基重懸組織和細(xì)胞，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液。
[0027]當(dāng)本實(shí)用新型提供的上述試劑盒包括盛裝明膠的容器和第二緩沖液瓶時，可以按照以下步驟進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):
[0028]( I)取出緩沖液放置區(qū)中盛裝PBS緩沖液的第一緩沖液瓶，用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污；
[0029](2)將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時去除臍動脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠均勻剪碎；
[0030]取出棕色塑料瓶，向剪碎的華通氏膠中加入膠原酶A或者膠原酶A與中性蛋白酶的混合液，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理；
[0031](3)消化處理之后，進(jìn)行離心處理并收集細(xì)胞和殘余組織，利用PBS緩沖液洗去殘留酶，再次進(jìn)行離心分離，棄去上層清液；
[0032](4)取出透明廣口瓶和第二廣口瓶，向棄去上層清液后的剩余物中加入胰酶，置于CO2培養(yǎng)箱中消化處理，加入生理鹽水混勻，離心分離，棄去上層清液；
[0033](5)取出盛裝無血清培養(yǎng)基的第一廣口瓶和盛裝明膠的容器，利用明膠對培養(yǎng)皿進(jìn)行鋪被，用MSCs培養(yǎng)基重懸組織和細(xì)胞，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后離心分離獲得組織塊和細(xì)胞重懸液；
[0034](6)取出第二緩沖液瓶，采用明膠對一個新的培養(yǎng)皿進(jìn)行包被處理，接種細(xì)胞前棄去明膠，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液進(jìn)行洗滌；
[0035](7)將分離獲得的組織塊和細(xì)胞重懸液接種于步驟(6)處理后的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長融合至80%-90%時進(jìn)行消化傳代。
[0036]在上述步驟(6)中，可以采用0.1%-0.2%的明膠對培養(yǎng)皿進(jìn)行包被，然后在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中孵育I小時或4°C孵育8-12小時。
[0037]采用本實(shí)用新型所提供的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，具有結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的特點(diǎn)，有助于實(shí)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的高純度和高效分離培養(yǎng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為實(shí)施例1提供的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0039]圖2為實(shí)施例2提供的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0040]圖3為實(shí)施例3提供的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0041]主要附圖標(biāo)號說明:[0042]盒體I緩沖液放置區(qū)2培養(yǎng)基放置區(qū)3明膠放置區(qū)4第一緩沖液瓶5第一廣口瓶6盛裝明膠的容器7酶放置區(qū)8生理鹽水放置區(qū)9棕色塑料瓶10透明廣口瓶11第二廣口瓶12第二緩沖液瓶13
【具體實(shí)施方式】
[0043]為了對本實(shí)用新型的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對本實(shí)用新型的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，但不能理解為對本實(shí)用新型的可實(shí)施范圍的限定。
[0044]實(shí)施例1
[0045]本實(shí)施例提供了一種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。該試劑盒包括一盒體1，該盒體I內(nèi)設(shè)有緩沖液放置區(qū)2、培養(yǎng)基放置區(qū)3、明膠放置區(qū)4，其中:
[0046]緩沖液放置區(qū)2內(nèi)設(shè)有第一緩沖液瓶5,該第一緩沖液瓶5盛裝有2wt%青霉素-鏈霉素(青霉素終濃度100U/mL，鏈霉素終濃度0.01g/100mL)的PBS緩沖液；
[0047]明膠放置區(qū)4設(shè)有盛裝明膠的容器7 ；
[0048]培養(yǎng)基放置區(qū)3設(shè)有一盛裝無血清培養(yǎng)基的第一廣口瓶6，該無血清培養(yǎng)基為BPS-SFM無血清培養(yǎng)基，其具體成分如表1所示。
[0049]上述試劑盒可以按照以下步驟進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):
[0050]1、獲取15cm健康新生兒臍帶組織,用第一緩沖液瓶5中的含2wt%青霉素-鏈霉素(青霉素終濃度100U/mL，`鏈霉素終濃度0.01g/100mL)的PBS緩沖液充分洗凈，充分去除血污；
[0051]2、將洗凈的臍帶均勻剪為3_4cm長度的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時去除臍動脈和臍靜脈，利用眼科剪刀將剝離的華通氏膠剪為lmm3-3mm3的小塊，得到華通氏膠組織塊；
[0052]3、取IOcm培養(yǎng)皿以及盛裝明膠的容器7，用濃度為0.2wt%的明膠對培養(yǎng)皿進(jìn)行包被，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中孵育I小時，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，去除殘留明膠；
[0053]4、用第一廣口瓶6中的BPS-SFM無血清培養(yǎng)基重懸組織和細(xì)胞(剪碎的華通氏膠組織塊)，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱的培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至85%時進(jìn)行消化傳代。
[0054]表1
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，該用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒包括一盒體，該盒體內(nèi)至少設(shè)有緩沖液放置區(qū)、明膠放置區(qū)、培養(yǎng)基放置區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液放置區(qū)設(shè)有第一緩沖液瓶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述明膠放置區(qū)設(shè)有盛裝明膠的容器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述培養(yǎng)基放置區(qū)設(shè)有第一廣口瓶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述盒體內(nèi)還設(shè)有酶放置區(qū)和生理鹽水放置區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述酶放置區(qū)設(shè)有棕色塑料瓶和透明廣口瓶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述生理鹽水放置區(qū)設(shè)有第二廣口瓶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液放置區(qū)設(shè)有第二緩沖液瓶。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液放置區(qū)設(shè)有第二緩沖液瓶。
【文檔編號】C12N5/0775GK203625386SQ201320735171
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月16日
【發(fā)明者】劉湘連, 王春有, 趙宇, 李莉莉 申請人:北京東方華輝生物醫(yī)藥科技有限公司