一種taz敲低或過表達的pc9細胞株及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種TAZ因子敲低PC9細胞株的shRNA分子。還公開了shRNA分子的重組載體。本發明還公開了一種TAZ因子過表達PC9細胞株的重組載體。本發明還公開了TAZ敲低和過表達的PC9細胞株的建立方法。具體是通過應用shRNA技術，利用TAZ-shRNA轉染PC9細胞，建立TAZ敲低PC9細胞株；利用TAZ過表達載體轉染PC9細胞，建立TAZ過表達的PC9細胞株。應用免疫細胞熒光、RT-PCR和Western?blot技術檢測細胞株中TAZ，證明細胞株建立成功。并測定細胞生長曲線和倍增時間。TAZ敲低和過表達PC9細胞株的建立為研究TAZ在肺癌靶向治療敏感性中的作用提供了有力的實驗材料。
【專利說明】一種TAZ敲低或過表達的PC9細胞株及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種TAZ敲低PC9或過表達細胞株及其構建方法和應用。
【背景技術】
[0002]肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。非小細胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)占肺癌的75%_85%，確診時多屬中晚期(III b和IV期)，失去手術時機，經過綜合治療，5年生存率僅為5%-10%。目前，針對表皮生長因子受體(印idermal growthfactor receptor, EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)不僅口服方便、毒性低、耐受性良好，而且提高患者的生活質量、延長選擇性患者的生存時間，在晚期肺癌的治療中發揮了重要作用。然而，臨床研究發現，EGFR-TKIs治療的原發性耐藥以及所有接受治療患者最終發生的獲得性耐藥，成為限制藥物療效的瓶頸。
[0003]肺癌EGFR-TKIs耐藥的分子機制多重復雜。EGFR基因自身的突變或擴增、其他受體酪氨酸激酶活化、EGFR信號下游信號分子改變等，這些效應的多樣性使得逆轉耐藥治療異常復雜且難以實現。近年來，隨著具有特異表面標志腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)的發現，CSCs在肺癌發生發展、侵襲衍進、治療療效和腫瘤耐藥方面的根源作用被不斷證實。研究提示腫瘤細胞“干性(sternness)”的獲得,如腫瘤球(tumorsphere)的形成以及上皮細胞間質改變(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等，是 EGFR-TKIs 耐藥和腫瘤復發的始作俑者。進一步研究提示:調節腫瘤干細胞自我更新相關的信號通路一
如Notch, Wnt, Sonic h edgehog和Hippo-異常激活和/或轉錄因子異常表達在腫瘤耐
藥的調控中發揮重要的作用。
[0004]新近的研究提示:在細胞增殖凋亡、組織穩態維持及干細胞的自我更新等過程發揮重要作用的抑癌通路一Hippo，調控多種CSCs形成，并與EGFR信號通路在腫瘤發生過程中存在緊密聯系的交互作用。Hippo通路是首先在果蠅中發現的一個新的信號轉導通路，是細胞增殖和凋亡的控制開關；其核心部分由一個級聯的激酶系統構成，通過轉錄共活化因子Yorkie的磷酸化調芐基因表達，從而在果蠅發育過程中發揮控制細胞數量和器官大小的關鍵作用；該機制的失效將誘發組織過度生長和腫瘤形成。在哺乳動物細胞中存在和果蠅高度保守的Hippo通路，構成該信號通路的各編碼基因在多種人類腫瘤組織中存在異常表達或突變。小鼠模型中，干擾Hippo或EGFR信號產生類似的組織過度增長效應，兩種效應的重疊表明Hippo和EGFR通路的緊密聯系。有研究發現，EGFR下游兩個效應旁路MAPK和PI3K間接控制Hippo信號級聯上游激酶Mstl/2的活性。同時，Hippo下游關鍵轉錄因子，即具有F1DZ-結合模序的轉錄共激活因子(transcriptional co-activator withPDZ-binding motif,TAZ 又稱 WWTR1)和 Yes 相關蛋白(Yes-associated protein,YAP),誘導EGFR配體表達，激活EGFR信號，影響EGFR-TKIs藥物敏感性。
[0005]TAZ是Hippo信號通路下游重要的轉錄共激活因子，是果蠅Hippo通路轉錄共活化因子Yorkie在哺乳動物中的同源蛋白之一，也是Wnt信號重要的調節因子。TEAD是細胞核內與TAZ結合的最主要轉錄因子，TAZ與TEAD結合后，依賴TAED中TAE功能結構域，啟動下游基因轉錄。臨床研究發現TAZ蛋白水平增高與乳腺癌、膠質瘤、直腸癌、乳頭狀甲狀腺癌及肺癌的發病和低分化程度相關。Cordenonsi等對乳腺癌的研究提示，TAZ通過調節細胞極性“開關(gatekeeper)” Scribble蛋白，誘導腫瘤球的形成和EMT,增加腫瘤起始細胞(tumor-1nitiating)和具有干細胞表型的腫瘤細胞數,誘發多耐藥蛋白(multidrugresistance, MDR)表達，引起化療耐藥。Lai等進一步的研究揭示:TAZ-TEAD_Cyr61/CTGF信號調節乳腺癌對紫杉醇的敏感性(Lai D, Ho KC, Hao Y, et al.Taxol resistance inbreast cancer cells is mediated by the hippo pathway component TAZ and itsdownstream transcriptional targets Cyr61and CTGF.Cancer Res2011, 71:2728-38.)。還有研究發現，TAZ旁系同源物YAP通過TAZ和YAP共有的Wff結構域結合PTPN14蛋白PPXY基序，具有調節順鉬、厄洛替尼以及survivin抑制劑治療乳腺癌和卵巢癌抗腫瘤敏感性的作用(Hong W，Guan KL.The YAP and TAZ transcription co-activators: key downstreameffectors of the mammalian Hippo pathway.Semin Cell Dev Biol2012，23:785-93.)。新近的研究提示，具有多重致癌活性、能誘發EGFR信號自分泌環形成和誘導EGFR-TKIs耐藥的EGFR激活型配體——AREG也是TAZ的重要轉錄靶點。乳腺上皮細胞中，TAZ同源物YAP誘導AREG表達,AREG以非細胞自主方式(non-cell-autonomus)促進細胞增殖及遷移,發揮生理調節作用。有關肺腺癌H460及食道腺癌細胞的研究發現，腺癌相關基因AGR2通過YAP激活誘導AREG表達，AREG進一步特異激活EGFR信號，促進腫瘤形成。Yang等研究提示，在乳腺上皮細胞，TAZ通過TEAD轉錄因子激活誘導AREG分泌，AREG以非細胞自主方式激活獨立于EGF的細胞生長和惡性轉化，且乳腺癌患者樣本的免疫組化結果也提示TAZ和AREG蛋白表達有顯著相關性(Huang JM, Nagatomo I, Suzuki E, et al.YAP modifies cancer cellsensitivity to EGFR and survivin inhibitors and is negatively regulated by thenon-receptor type protein tyrosine phosphatasel4.0ncogene2013, 32 (17):2220-9.)。我們研究提示:TAZ在人支氣管上皮細胞HBE154中不表達，吉非替尼敏感NSCLC細胞PC-9及其耐藥細胞PC-9/GR中TAZ表達水平呈升高趨勢并有顯著性差異，且AREG的表達和TAZ有相關性。因此，通過干預TAZ基因表達水平，研究其在肺癌靶向治療耐藥中的分子機制，為尋求減少靶向治療耐藥的方法提供了新思路。
[0006]腫瘤基因治療領域的新技術-RNA干擾(RNA interference, RNAi),是由雙鏈
RNA引發的轉錄或轉錄后基因沉默現象(post-transcriptional gene silencing, PTGS),因其抑制效果確切、高特異性、高效性等特點而被廣泛應用。以病毒載體形式表達的短發夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)，通常是利用RNA聚合酶III啟動子(人或鼠U6或人Hl啟動子)轉錄下游反向重復DNA序列，形成小發夾結構，被Dicer等酶識別而切割成小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA),進而穩定而特異地沉默基因，是發揮RNAi的有效方式。目前，以慢病毒或逆轉錄病毒為載體的RNAi技術顯示，TAZ基因的沉默抑制乳腺癌和直腸癌的形成、侵襲和轉移；同時可增加乳腺癌對紫杉醇的藥物敏感性。作為新發現的癌基因，Hippo通路關鍵因子TAZ可能通過CSCs形成以及TAED-AREG途徑參與肺癌細胞EGFR-TKIs治療的耐藥，而對于其在EGFR敏感或耐藥的肺腺癌中的表達及功能的研究目前還未見報道。
【發明內容】

[0007]本發明所要解決的技術問題是提供一種TAZ因子敲低PC9細胞株的shRNA分子。
[0008]本發明還要解決的技術問題是提供上述shRNA分子的重組載體。
[0009]本發明還要解決的技術問題是提供一種TAZ因子過表達PC9細胞株的重組載體。
[0010]本發明還要解決的技術問題是提供一種TAZ因子敲低或過表達PC9細胞株的構建方法。
[0011]本發明最后要解決的技術問題是提供上述重組表達載體在TAZ因子敲低或過表達肺癌細胞的應用。
[0012]針對上述問題，發明人通過TAZ敲低和過表達的PC9細胞系的建立，通過應用基因工程技術，利用TAZ-shRNA和TAZ或過表達質粒轉染PC9細胞，建立TAZ敲低的或過表達的PC9細胞株，再利用免疫細胞熒光、RT-PCR和Western blot技術對細胞株進行檢測，證明細胞株建立成功；利用TAZ-shRNA和TAZ過表達載體分別下調和上調TAZ基因在肺癌吉非替尼敏感細胞株的表達，建立TAZ敲低的和過表達的PC9細胞模型，為探討TAZ在肺癌細胞靶向治療耐藥中的作用提供可行的細胞材料。
[0013]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
[0014]一種TAZ因子敲低PC9細胞株的shRNA分子，所述shRNA分子的DNA片段的堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]一種重組載體，其含有上述的TAZ因子敲低PC9細胞株的shRNA分子。
·[0016]其中，上述重組載體是將上述的DNA片段插入pGPU6/GFP/Neo載體的多克隆位點構建成的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA。
[0017]一種TAZ因子過表達PC9細胞株的重組載體，是將TAZ因子的基因片段插入到pEX-2載體的多克隆位點構建成重組表達載體pEX-2-TAZ-over。
[0018]一種重組細胞，含有上述的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或pEX-2-TAZ-over。
[0019]其中，上述重組細胞為人肺癌細胞PC9/TAZ_shRNA或人肺癌細胞PC9/TAZ_0ver。一種TAZ因子敲低PC9細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏編號為CCTCC N0:C2013194，分類命名:人肺癌細胞PC9/TAZ_shRNA，Homo sapiens,human carcinoma of lung。保藏地址:湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心(武漢大學
第一附屬小學對面)。
[0020]一種TAZ因子過表達PC9細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏編號為CCTCC NO:C2013178，分類命名:人肺癌細胞PC9/TAZ_0ver，Homo sapiens, human carcinoma of lung。保藏地址:湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心(武漢大學第一附屬小學對面)。
[0021]一種TAZ因子敲低或過表達PC9細胞株的構建方法，包括以下步驟:
[0022]a)將上述的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或上述的重組表達載體pEX-2-TAZ-over分別轉染PC9細胞得到重組細胞株；
[0023]b)將步驟a)得到的重組細胞株分別經過G418篩選培養基培養，2~3天換一次液，篩選培養21天，獲得陽性細胞株；其中，所述的G418篩選培養基10%胎牛血清的DMEM中，加入G418使其終濃度為600 μ g/ml ；[0024]c)將步驟(d)篩選得到的陽性細胞株，消化成單個細胞后計數，分別取1000個種入IOcm的培養板上，G418繼續篩選2周后，可在顯微鏡下觀察到轉染含目的基因重組載體的細胞長成單克隆細胞團，低倍鏡下在培養板底部用記號筆標出單細胞克隆，將其轉入預先加入含600 μ g/ml G418的DMEM完全培養基的24孔板中，每個轉染體系挑取9個單克隆細胞團；
[0025]d)步驟(C)篩選所得的單克隆細胞團，24孔板中細胞生長至80%~90%匯合率時，傳代至細胞培養瓶中培養，收集細胞，提取RNA和蛋白質，利用免疫細胞熒光、PCR和Western blot方法檢測TAZ的表達陽性細胞株。
[0026]上述的重組載體在TAZ因子敲低或過表達肺癌細胞的應用。
[0027]有益效果:與現有技術相比，本發明的優點如下:TAZ敲低和過表達的PC9細胞系的建立，為研究TAZ在肺癌靶向治療敏感性中作用提供了有力的實驗材料。構建的TAZ敲低的即已經保藏的人肺癌細胞PC9/TAZ-shRNA和TAZ過表達即已經保藏的人肺癌細胞PC9/TAZ-0VER,分別有98%以上的細胞表達綠色熒光蛋白，經基因工程技術分別敲低了內源性的TAZ表達量72%，而過表達TAZ為原有水平1.63倍。與母細胞PC9相比，人肺癌細胞PC9/TAZ-shRNA細胞生長緩慢，倍增時間延長，而人肺癌細胞PC9/TAZ-0VER細胞生長加速，倍增時間縮短。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:PGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA表達載體的構建示意圖；
[0029]圖2:TAZ過表達載體的構建不意圖； [0030]圖3:為建立TAZ敲低的和過表達的PC9細胞株熒光顯微圖；
[0031 ]圖4 =RT-PCR法對細胞株中的TAZ進行檢測圖；
[0032]圖5 =Western blot法對細胞株中的TAZ進行檢測圖；
[0033]圖6:人肺癌細胞PC9/TAZ-shRNA、人肺癌細胞PC9/TAZ-0VER和母細胞PC9的生長曲線圖。
【具體實施方式】
[0034]下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0035]pGPU6-GFP-Neo及pEX_2:購自上海吉瑪公司；
[0036]感受:態E.coli DH5 a:TaKaRa Code:D9057 ；
[0037]SOC培養基:lml2M葡萄糖，過濾滅菌將Bacto胰蛋白胨、Bacto酵母抽提物、NaCl及KCl加到97ml的去離子水中，攪拌溶解，高壓滅菌并冷卻到室溫，加入2M Mg2+母液和2M葡萄糖至終濃度20mM，補加消毒蒸餾水至100ml，完全培養基用0.2μπι的濾膜過濾滅菌，最終PH值為7.0 ;
[0038]LB液體培養基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L根據經驗值用NaOH調節該培養基的pH，使其達到7.4 ；
[0039]LB固體培養基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂15g/L ；
[0040]普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒:天跟生化科技有限公司，DP209-02 ；[0041]PC9細胞株:擁有EGFR基因活性突變伴突變P53蛋白表達的人肺腺癌PC9細胞由本實驗室保存；
[0042]6孔及12孔培養板:美國Corning公司；
[0043]RPMI DMEM培養基:美國Gibco公司；
[0044]Opt1-MEM:美國 Invitrogen 公司；
[0045]Lipofectamine2000 轉染試劑盒:美國 Invitrogen 公司；
[0046]胎牛血清:美國Gibco公司；
[0047]G418:美國 Amresco 公司；
[0048]膜酶:美國Amresco公司；
[0049]濃縮型DAB試劑盒:北京中杉金橋生物技術有限公司；
[0050]TAZ 抗體:美國 Cell Signaling 公司；
[0051]β-actin 抗體:美國 Cell Signaling 公司；
[0052]HRP標記的山羊抗兔二抗:美國Cell Signaling公司；
[0053]質粒提取試劑盒:德國QIAGEN公司；
[0054]實施例1 質粒 pGPU6-GFP-Neo-TAZ_shRNA 的獲得
[0055]1、用 Designer3.0 (Genepharma)軟件進行 shRNA 設計及合成
[0056]1.1根據上述軟件設計并合成針對GENE-BANK上的人類TAZ序列的shRNA DNA片段，shRNA模板中的loop結構選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的5’端添加了 CACC，與BbsI酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5’端添加了 GATC，與BamHI酶切后形成的粘端互補；如果siRNA的第一個堿基不是G，則在CACC后補加一個G。以下是I對TAZ序列的shRNA特異性位點、寡核苷酸鏈序列，以及陰性對照和陽性對照的寡核苷酸鏈序列。
[0057](I)來自genebank的人類TAZ序列的DNA片段:
[0058]5’-AGGTACTTCCTCAATCACA-3’
[0059]TAZ 序列 shRNA DNA 正義鏈:見 SEQ ID N0.1
[0060]5’-CACCGAGGTACTTCCTCAATCACATTCAAGAGATGTGATTGAGGAAGTACCTTTTTTTG-3’
[0061]shRNA DNA 反義鏈:見 SEQ ID N0.2
[0062]5’-GATCCAAAAAAAGGTACTTCCTCAATCACATCTCTTGAATGTGATTGAGGAAGTACCTC-3’
[0063]
【權利要求】
1.一種TAZ因子敲低PC9細胞株的ShRNA分子，其特征在于，所述shRNA分子的DNA片段的堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—種重組載體，其含有權利要求1所述的TAZ因子敲低PC9細胞株的shRNA分子。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將權利要求I所述的DNA片段插入pGPU6/GFP/Neo載體的多克隆位點構建成的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA。
4.一種TAZ因子過表達PC9細胞株的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將TAZ因子的基因片段插入到pEX-2載體的多克隆位點構建成重組表達載體pEX-2-TAZ-over。
5.一種重組細胞，含有權利要求3或4所述的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或 pEX-2-TAZ-over。
6.根據權利要求5所述的重組細胞，其特征在于，所述重組細胞為人肺癌細胞PC9/TAZ-shRNA 或人肺癌細胞 PC9/TAZ-0VER。
7.—種TAZ因子敲低PC9細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏編號為CCTCC N0:C2013194，分類命名:人肺癌細胞PC9/TAZ_shRNA。
8.—種TAZ因子過表達PC9細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏編號為CCTCC NO: C2013178，分類命名:人肺癌細胞PC9/TAZ-OVER。
9.一種TAZ因子敲低或過表達PC9細胞株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟: a)將權利要求3所述的重組表達載體pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或權利要求4所述的重組表達載體pEX-2-TAZ-over·分別轉染PC9細胞得到重組細胞株； b)將步驟a)得到的重組細胞株分別經過G418篩選培養基培養，2~3天換一次液，篩選培養21天，獲得陽性細胞株；其中，所述的G418篩選培養基10%胎牛血清的DMEM中，加入G418使其終濃度為600 μ g/ml ； c)將步驟(d)篩選得到的陽性細胞株，消化成單個細胞后計數，分別取1000個種入IOcm的培養板上，G418繼續篩選2周后，可在顯微鏡下觀察到轉染含目的基因重組載體的細胞長成單克隆細胞團，低倍鏡下在培養板底部用記號筆標出單細胞克隆，將其轉入預先加入含600 μ g/ml G418的DMEM完全培養基的24孔板中，每個轉染體系挑取9個單克隆細胞團； d)步驟(c)篩選所得的單克隆細胞團，24孔板中細胞生長至80%~90%匯合率時，傳代至細胞培養瓶中培養，收集細胞，提取RNA和蛋白質，利用免疫細胞熒光、PCR和Westernblot方法檢測TAZ的表達陽性細胞株。
10.權利要求2或3或4所述的重組載體在TAZ因子敲低或過表達肺癌細胞的應用。
【文檔編號】C12N15/113GK103849620SQ201410030314
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】許偉, 吳劍卿, 程雁 申請人:南京醫科大學第一附屬醫院