專利名稱：一種鑒定胡椒種質(zhì)資源的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物信息技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種鑒定胡椒種質(zhì)資源的方法。
背景技術(shù)：
胡椒(Piper nigrum L.)為胡椒科胡椒屬多年生常綠攀援藤本植物，是世界重要的香辛料作物，用途廣，經(jīng)濟價值高。胡椒的種子含有揮發(fā)油、胡椒堿、粗脂肪、粗蛋白等成分，是人們喜愛的調(diào)味品。除此之外，胡椒在醫(yī)藥工業(yè)上可用作健胃劑、解熱劑及支氣管粘膜刺激劑等，治療消化不良、寒痰、咳嗽、腸炎、支氣管炎、感冒和風(fēng)濕病等；在食品工業(yè)上用作防腐劑及天然食品添加劑等。胡椒種苗的真實性是衡量種苗質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接影響胡椒的產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟效益。當(dāng)前我國胡椒種子和種苗常存在純度低、品種混雜、以次充好現(xiàn)象，各級農(nóng)作物品種審定機構(gòu)和種子種苗生產(chǎn)部門對胡椒品種偽劣鑒定日益重視。但是，胡椒種質(zhì)資源形態(tài)特征較為相似，加上長期引種和生產(chǎn)管理疏漏，導(dǎo)致了同物異名、同名異物、品種混淆等問題。傳統(tǒng)形態(tài)鑒定法依賴于表型差異，而形態(tài)性狀受到氣候、環(huán)境、營養(yǎng)狀態(tài)和生物期等多種因素影響，且形態(tài)鑒定法工作量大、鑒定周期長、成本高，對于種苗鑒定、推廣品種以及育種等工作造成不利影響。DNA分子標(biāo)記能反映生物個體或種群基因組中某種差異特征的DNA片段，可以從根本上揭示植物內(nèi)在的基因差異，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用到作物品種鑒定和種質(zhì)資源分類等研究領(lǐng)域。目前，應(yīng)用較多的是SSR、ISSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子標(biāo)記。其中，ISSR(Inter-simple sequence repeat),即簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增，是由加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種分子標(biāo)記技術(shù),其原理是在SSR的3'或5 ^端錨定1-4個堿基作為引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段序列進行擴增，而不是擴增SSR本身。錨定堿基避免了 SSR在基因組上的滑動，因而大大提高了 PCR擴增的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)兼具SSR、RAPD, RFLP, AFLP等分子標(biāo)記的優(yōu)點，與SSR相比，ISSR不需要預(yù)先獲知序列信息而大大降低成本，且多態(tài)性更加豐富；與RAro相比，ISSR退火溫度在50°C左右，保證了 PCR擴增的穩(wěn)定性和重復(fù)性；與RFLP, AFLP相比，ISSR利用在植物基因組中常出現(xiàn)的簡單重復(fù)序列設(shè)計引物，無需預(yù)先克隆和測序，技術(shù)要求不高、速度較快、成本低廉。目前，ISSR標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定、遺傳多樣性、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助選擇等研究中得到了廣泛應(yīng)用。但在胡椒中，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進行胡椒種質(zhì)資源鑒定的方法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定胡椒種質(zhì)資源的方法，使該方法能夠利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確、簡便的鑒定胡椒種質(zhì)資源。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種鑒定胡椒品種的方法，包括以下步驟
步驟I、選取標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種中的一種或兩種以上，分別進行DNA提取，然后采用SEQID NO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，所得擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，根據(jù)凝膠電泳圖結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種編號和擴增條帶數(shù)最多的標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標(biāo)，在每一個橫、縱坐標(biāo)交結(jié)處記錄標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種條帶的檢測結(jié)果，將有擴增條帶的標(biāo)記為有條帶，無擴增條帶的標(biāo)記為無條帶，得到標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的ISSR指紋圖譜；步驟2、提取待測胡椒品種的DNA，采用SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，將所得到的擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，根據(jù)凝膠電泳圖結(jié)果以待測胡椒品種編號和步驟I所述擴增條帶數(shù)最多的標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標(biāo)，在每一個橫、縱坐標(biāo)交結(jié)處記錄待測胡椒品種條帶的檢測結(jié)果，將有擴增條帶的標(biāo)記為有條帶，無擴增條帶的標(biāo)記為無條帶，得到待測胡椒品種的ISSR指紋圖譜，然后與所述標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的ISSR指紋圖譜進行比對判斷。其中，作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述PCR擴增體系為反應(yīng)總體積為25iiL，其中Mg2+ 濃度為2mmol/L、dNTPs濃度為200 y mo/L、引物濃度為2 y mol/L、胡椒品種的DNA用量為IOOng, Taq DNA聚合酶用量為IU ；所述PCR擴增程序為94°C預(yù)變性3min ;94°C變性2min、50°C復(fù)性lmin、72°C延伸3min，循環(huán)35次；72°C延伸7min，4°C保存。本發(fā)明所述凝膠優(yōu)選為瓊脂糖凝膠電泳，所述瓊脂糖凝膠電泳進一步優(yōu)選采用膠濃度為I. 2%并包含GoodView核酸凝膠染色劑的瓊脂糖凝膠。本發(fā)明選取21種標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種為胡椒種質(zhì)資源材料(見表1)，采用100條UBC引物(由加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)命名的系列簡單重復(fù)序列，即University of BritishColumbia,簡稱UBC)分別擴增上述標(biāo)準(zhǔn)胡椒種質(zhì)資源的DNA，根據(jù)上述UBC引物在21個胡椒種質(zhì)中PCR擴增譜帶的特異性、多態(tài)性以及帶型的易區(qū)分程度進行篩選，篩選出在不同胡椒種質(zhì)間能夠擴增出多態(tài)性豐富、帶型清晰而且能夠穩(wěn)定重復(fù)的特征譜帶的UBC引物；然后，在篩選出的這些UBC引物中選擇能夠擴增出上述胡椒種質(zhì)間多態(tài)性信息含量最高，能夠準(zhǔn)確區(qū)分所有胡椒種質(zhì)的引物，并經(jīng)過優(yōu)化得到如SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物，經(jīng)RAPDistance軟件檢驗無重合。SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物為簡并引物，其中Y表示為C/T。表I標(biāo)準(zhǔn)胡椒種質(zhì)資源表
權(quán)利要求
1.一種鑒定胡椒種質(zhì)資源的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I、選取標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種中的一種或兩種以上，分別進行DNA提取，然后采用SEQ IDNO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，所得擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，根據(jù)凝膠電泳圖結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種編號和擴增條帶數(shù)最多的標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標(biāo)，在每一個橫、縱坐標(biāo)交結(jié)處記錄標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種條帶的檢測結(jié)果，將有擴增條帶的標(biāo)記為有條帶，無擴增條帶的標(biāo)記為無條帶，得到標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的ISSR指紋圖譜； 步驟2、提取待測胡椒品種的DNA，采用SEQ ID NO: I所示序列的ISSR引物進行PCR擴增，將所得到的擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，根據(jù)凝膠電泳圖結(jié)果以待測胡椒品種編號和步驟I所述擴增條帶數(shù)最多的標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標(biāo)，在每一個橫、縱坐標(biāo)交結(jié)處記錄待測胡椒品種條帶的檢測結(jié)果，將有擴增條帶的標(biāo)記為有條帶，無擴增條帶的標(biāo)記為無條帶，得到待測胡椒品種的ISSR指紋圖譜，然后與所述標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的ISSR指紋圖譜進行比對判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種為華山筠、萎葉、粗穗胡椒、海南筠、蓽菝、假筠、大葉筠、短筠、斜葉筠、毛筠、山筠、頂花胡椒、柬印93、柬埔寨小葉種、印尼大葉種胡椒、古晉胡椒、73F5胡椒、興熱I號胡椒、大山胡椒、云選I號胡椒和班尼約爾I號胡椒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述PCR擴增體系為 反應(yīng)總體積為25 u L，其中Mg2+濃度為2mmol/L、dNTPs濃度為200 u mo/L、引物濃度為2iimol/L、胡椒品種的DNA用量為lOOng、Taq DNA聚合酶用量為1U。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為 94°C預(yù)變性3min ； 94°C變性 2min、50°C復(fù)性 lmin、72°C延伸 3min，循環(huán) 35 次； 72°C 延伸 7min，4°C 保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述標(biāo)記為有條帶為標(biāo)記為I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述標(biāo)記為無條帶為標(biāo)記為O。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述凝膠電泳為瓊脂糖凝膠電泳。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳采用膠濃度為I.2%并包含GoodView核酸凝膠染色劑的瓊脂糖凝膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物信息技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種鑒定胡椒種質(zhì)資源的方法。該方法將標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種DNA用SEQ ID NO:1所示序列引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果以胡椒品種編號和條帶存在位點編號為橫、縱坐標(biāo)，在每一橫、縱坐標(biāo)交結(jié)處記錄標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種條帶的檢測結(jié)果，得到標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的ISSR指紋圖譜；將待測胡椒品種DNA用SEQ ID NO:1所示序列引物PCR擴增，擴增產(chǎn)物按上述方法構(gòu)建待測胡椒品種的ISSR指紋圖譜，并與標(biāo)準(zhǔn)胡椒品種的ISSR指紋圖譜比對判斷。本發(fā)明應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)從遺傳本質(zhì)上對胡椒種質(zhì)資源進行了準(zhǔn)確鑒定，解決了胡椒種質(zhì)鑒定困難的問題，且簡單、易操作，檢測迅速。
文檔編號C12Q1/68GK102703598SQ20121023051
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者楊建峰, 祖超, 范睿, 譚樂和, 邢谷楊, 鄔華松, 鄭維全, 郝朝運 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所