泡盛曲霉及其微生物菌劑和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于防治黃瓜枯萎病的泡盛曲霉（Aspergillusawamori)2-17，該菌株已于2013年1月11日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCCNo.7127；本發(fā)明還公開了利用該菌株生產(chǎn)的微生物菌劑及其制備方法。本發(fā)明提供的泡盛曲霉（Aspergillusawamori)2-17及其微生物菌劑對黃瓜枯萎病防治效果顯著，發(fā)病率控制在5%以內(nèi)，同時不易產(chǎn)生抗藥性，對人畜安全，不會污染水和土壤，對農(nóng)作物無危害，為防治黃瓜枯萎病提供了一種高效的微生物防治新途徑。
【專利說明】泡盛曲霉及其微生物菌劑和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種用于防治黃瓜枯萎病的泡盛曲霉和含有該泡盛曲霉的微生物菌劑，及其在防治黃瓜枯萎病上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜枯萎病是一種世界性的土傳真菌病害，由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxy sporum f.sp.Cucumerinum Owen)侵染引起，可導(dǎo)致維管束和導(dǎo)管受損，最終造成黃瓜枯萎、萎蔫直至甚至死亡。在許多蔬菜基地，黃瓜枯萎病常年發(fā)病率10%-30%，重病年份可達(dá)80%-90%，一般減產(chǎn)30%-50%，重者絕收，嚴(yán)重影響了黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0003]目前世界各國對黃瓜枯萎病的防治主要還是采用化學(xué)方法，雖然化學(xué)方法在一定程度上抑制了枯萎病害發(fā)生，但化學(xué)藥劑負(fù)面影響嚴(yán)重，對耕地土壤生態(tài)環(huán)境破壞極大，長期使用容易導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)發(fā)生較大變化，土壤中有益微生物數(shù)量顯著減少，土壤自身修復(fù)能力降低，而且化學(xué)藥劑殘留嚴(yán)重，容易污染周邊水源，對農(nóng)產(chǎn)品及周邊的居民身心健康有著很大的威脅，因此世界各國已經(jīng)禁用或逐漸禁用部分劇毒農(nóng)藥如甲基溴等。開發(fā)出高效、無毒、綠色的防治方法受到了越來越多的關(guān)注。其中，通過采用安全、高效、環(huán)境友好型的生物技術(shù)手段，利用拮抗微生物來減少黃瓜枯萎病害發(fā)生，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的黃瓜枯萎病防治生物技術(shù)。該技術(shù)通過分離篩選黃瓜枯萎病菌拮抗微生物，制備拮抗微生物菌劑后，施入黃瓜種植土壤中，從而達(dá)到抑制黃瓜枯萎病菌生長，防控黃瓜枯萎病發(fā)生的目的。但目前可供利用的拮抗微生物種類和數(shù)量還相對較少，主要包括木霉屬真菌、非致病尖孢鐮刀菌、淡紫擬青霉、芽孢桿菌等，因此進(jìn)一步分離篩選黃瓜枯萎病菌拮抗微生物對于黃瓜枯萎病的防治有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明第一目的在于提供一種用于防治黃瓜枯萎病的泡盛曲霉及其微生物菌劑。
[0005]本發(fā)明第二目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。
[0006]本發(fā)明第三目的在于提供上述泡盛曲霉菌株及其微生物菌劑在防治黃瓜枯萎病上的應(yīng)用。
[0007]上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌株,于2013年I月11日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCC N0.7127。
[0008]菌株生理特征:上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17在PDA培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)4天長滿整個9cm培養(yǎng)皿，平坦，質(zhì)地粉粒狀，表面暗褐色，菌落反面呈橙黃色。分生孢子頭幼時多呈輻射形；老時疏松或裂成疏松的圓粒狀結(jié)構(gòu)；頂囊球形或近球形，淡褐色；分生孢子球形或近球形。
[0009]菌株的鑒定:通過提取上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌株的基因組，并用18S通用引物對該菌株進(jìn)行測定，測定的序列表如SEQ ID N0.1所示，從18S rDNA基因序列測定結(jié)果來看上述菌株可以歸為泡盛曲霉。
[0010]利用上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17所制備的微生物菌劑為固體菌劑，由泡盛曲霉株和固體培養(yǎng)基組成；其活性成分為泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。
[0011]上述微生物菌劑,其內(nèi)含有的泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17的活菌數(shù)大于 1.0X IO8 cfu/g。
[0012]上述微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟:
(1)菌株活化培養(yǎng):將分離的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2_17菌株斜面保藏物接種到PDA斜面，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后作為接種物接種PDA平板，接種后將PDA平板置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-7天，直至菌絲體上形成孢子；
(2)制備固體培養(yǎng)基:以麩皮為原料，調(diào)節(jié)含水率為40%-50%，121°C高壓滅菌20min，
將冷卻后的麩皮作為泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17的固體培養(yǎng)基；
(3)制備固體微生物菌劑:將PDA平板上的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17
孢子及菌絲體用無菌水洗滌 后作為接種液接種到固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)7天進(jìn)行充分的發(fā)酵產(chǎn)孢，即得微生物菌劑。
[0013]制備上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17及其微生物菌劑所使用PDA平板和PDA斜面均為常規(guī)操作方法制備。
[0014]上述泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17及其微生物菌劑應(yīng)用于防治黃瓜枯萎病。
[0015]本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果:
(I)本發(fā)明所提供的泡盛曲霉為防治黃瓜枯萎病提供了一種高效的微生物，開辟了一個有效防治途徑。
[0016](2)本發(fā)明所提供的泡盛曲霉對黃瓜枯萎病的防治效果顯著，發(fā)病率控制在5%以內(nèi)。
[0017](3)本發(fā)明所提供的微生物菌劑對人、畜安全，不會污染水和土壤，對其他農(nóng)作物也沒有危害。
[0018](4)利用本發(fā)明方法防治黃瓜枯萎病不易產(chǎn)生抗藥性。
【具體實施方式】
[0019]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說明。
[0020]對所涉材料的說明:
土豆:市場購買普通食用土豆；葡萄糖:生化制劑，國產(chǎn)；NaCl:分析純，國產(chǎn)；麩皮。
[0021]本發(fā)明所述泡盛曲霉菌株的獲得途徑:2008年從浙江嘉善、麗水、杭州等黃瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重種植基地采集健康植株根系土壤樣品15個，利用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行真菌分離，共分離到真菌50多株；然后進(jìn)行平板拮抗試驗，得到對黃瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌有較好拮抗效果初篩真菌3株,該泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17為其中一株。菌種的分離和篩選的具體過程如實施例1所示，黃瓜枯萎病菌拮抗真菌的篩選如實施例2所示。
[0022]實施例1菌種的分離篩選:(1-1)配制PDA培養(yǎng)基、
所述PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g, H2O 1000ml, pH自然。先將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20-30分鐘)，用八層紗布過濾，加熱，再據(jù)實際實驗需要加瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000毫升，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121°C滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面或者到平板，冷卻凝固后貯存?zhèn)溆谩?br> [0023]實驗過程中所使用PDA平板和PDA斜面均為常規(guī)操作方法制備。
[0024]( 1-2) 土壤稀釋液的制備
Ca)稱取IOg 土壤，加入100mL帶有玻璃珠的無菌水500ml三角瓶中，振蕩15分鐘，即
10-1 ；
(b)吸取土懸液10ml，加入90ml無菌水500ml三角瓶中，即10_2；
(c)從(2)中吸取10ml，加入90ml無菌水500ml三角瓶中，即10_3；
(d)從(3)中吸取5ml，加入45ml無菌水250ml三角瓶中，即10_4；
(e)從(4)中吸取5ml，加入45ml無菌水250ml三角瓶中，即10_5。
[0025](1-3)真菌分離
(f)從(c)(d) (e)中分別吸取0.1ml，加入到PDA培養(yǎng)基平板中進(jìn)行涂布培養(yǎng)(28-30°C培養(yǎng)2-3天)；
(g)選擇20-200菌落數(shù)的培養(yǎng)皿進(jìn)行挑取單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)(28-30°C培養(yǎng)2_3天)； (1-4)多個土樣
(9)共15個土樣，每個土樣重復(fù)上述(1-1)~(1-2)步驟。
[0026](1-5)結(jié)果 分離到真菌50多株。
[0027]實施例2黃瓜枯萎病菌拮抗真菌的篩選:
(2-1)固體培養(yǎng)基:配制PDA培養(yǎng)基:同實施例1中(1-1).(2-2)黃瓜枯萎病致病菌種活化
將低溫保藏的黃瓜枯萎病致病菌——尖孢鐮刀菌接入PDA斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天，備用。
[0028]( 2-3 )平板拮抗試驗
將培養(yǎng)活化好的黃瓜枯萎病致病菌接種到PDA平板中心，同時將分離的真菌接種到平板的四周，每個平板接種4個分離的真菌，接種后置于28°C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后每隔24h觀察實驗結(jié)果，主要考察抑菌圈有無及大小。根據(jù)抑菌圈的大小篩選高效黃瓜枯萎病致病菌拮抗微生物，泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17就是其中一株高效拮抗真菌。
[0029]實施例3微生物菌劑的制備:
(3-1)菌株2-17活化培養(yǎng):將分離的泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌株斜面保藏物接種到PDA斜面，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后作為接種物接種PDA平板，接種后將PDA平板置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-7天，直至菌絲體上形成孢子。
[0030](3-2)制備固體培養(yǎng)基:以麩皮為原料，調(diào)節(jié)含水率為40%-50%，121°C高壓滅菌20min，
將冷卻后的麩皮作為泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17的固體培養(yǎng)基。[0031](3-3)制備固體微生物菌劑:將PDA平板上的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17的孢子及菌絲體用無菌水洗滌后作為接種液接種到固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)7天進(jìn)行充分的發(fā)酵產(chǎn)孢，即得微生物菌劑。
[0032]實施例4微生物菌劑的防治效果對比試驗:
(4-1)黃瓜品種:園豐園。
[0033](4-2)試驗地點:試驗地點選擇嘉興黃瓜連作枯萎病高發(fā)地區(qū)，試驗小區(qū)黃瓜枯萎病平均發(fā)病率在25%以上。
[0034](4-3)試驗處理及小區(qū)面積:試驗設(shè)I個不接拮抗菌對照處理和I個拮抗菌2-17處理，小區(qū)面積12 Hf，處理重復(fù)4次。每小區(qū)種黃瓜25株。試驗地土壤不使用任何土壤處理劑，黃瓜生長期間不使用任何殺菌劑，其他農(nóng)事操作照常規(guī)。小區(qū)排列見表1:
表1田間試驗小區(qū)排列表
【權(quán)利要求】
1.一種泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17,其特征在于,于2013年I月11日保 藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.7127。
2.利用權(quán)利要求1所述泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17制備的微生物菌劑,其 特征在于，所述微生物菌劑為固體菌劑，由泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17和固體培養(yǎng)基組成；其活性成分為泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于，其內(nèi)含有的泡盛曲霉 awamori) 2-17 的活菌數(shù)大于 1.0XlO8 cfu/g。
4.一種權(quán)利要求2或3所述微生物菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)菌株活化培養(yǎng)，將分離的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17菌株斜面保藏物接種到PDA斜面，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后作為接種物接種PDA平板，接種后將PDA平板置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-7天，直至菌絲體上形成孢子； (2)制備固體培養(yǎng)基，以麩皮為原料，調(diào)節(jié)含水率為40%-50%，121°C高壓滅菌20min，將冷卻后的麩皮作為泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17的固體培養(yǎng)基； (3)制備固體微生物菌劑,將PDA平板上的泡盛曲霉(Aspergillusawamori) 2-17的孢子及菌絲體用無菌水洗滌后，作為接種液接種到固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)7天進(jìn)行充分的發(fā)酵產(chǎn)孢，即得微生物菌劑。
5.一種權(quán)利要求1所述的泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 2-17在防治黃瓜枯萎病上的應(yīng)用。
6.一種權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑在防治黃瓜枯萎病上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/14GK104017733SQ201410147310
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】姚燕來, 朱鳳香, 薛智勇, 陳曉旸, 洪春來, 王衛(wèi)平 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院