快速檢測(cè)花生抗旱性的方法及所使用的探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首先公開一種花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的探針，所述探針的5’端到3’端的脫氧核苷酸序列為如SEQ?ID?No.1所示。然后公開一種快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其中，采用如前所述的花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的探針檢測(cè)花生的組織中的9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)所述9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量的高低，判定被檢測(cè)的花生品種的抗旱性的強(qiáng)弱情況。操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，結(jié)果簡(jiǎn)單明了，使用的探針更為靈敏，穩(wěn)定性和重復(fù)性也更高，結(jié)果更為可信。
【專利說(shuō)明】快速檢測(cè)花生抗旱性的方法及所使用的探針
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗旱性檢測(cè)方法，尤其涉及一種快速檢測(cè)抗旱性的方法及所使用 的探針，特別涉及對(duì)花生品種的抗旱性檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生是一種重要的油料作物，在我國(guó)山東、湖南、廣東各地均普遍種植。干旱是影 響花生產(chǎn)量的最主要因素之一，所以如何快速準(zhǔn)確的分辨不同花生品種抗旱性的強(qiáng)弱，對(duì) 于篩選優(yōu)良品種，提高花生產(chǎn)量具有重要意義。
[0003] 傳統(tǒng)鑒定花生抗旱性的方法主要是通過(guò)多種抗旱生理指標(biāo)，如脫落酸（ΑΒΑ)含 量、游離脯氨酸含量、葉片含水量、干旱情況下葉片萎蔫指數(shù)等，運(yùn)用隸屬函數(shù)法，綜合考慮 諸多生理指標(biāo)情況，進(jìn)行綜合排名，以確定不同品種花生抗旱性的差異，但傳統(tǒng)方法鑒定花 生抗旱性所需材料較多、耗時(shí)久、操作繁瑣，重復(fù)性差、結(jié)果難以量化。
[0004] ΑΒΑ作為植物干旱脅迫下的應(yīng)答激素，干旱脅迫下，可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)抗旱基因表 達(dá)，激活植物應(yīng)對(duì)干旱系統(tǒng)，抵御干旱脅迫，其合成酶9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶 (NCED)在合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用。花生中的NCED基因命名為AhNCEDl。早期研究發(fā)現(xiàn)，不 同花生品種的抗旱性與其體內(nèi)ΑΒΑ水平呈正相關(guān)，即在水分脅迫下抗旱性強(qiáng)的花生品種累 積的水平高于不抗旱品種；AhNCEDl的基因及其蛋白在正常生長(zhǎng)條件與干旱脅迫下的表達(dá) 水平與花生體內(nèi)的ΑΒΑ含量呈現(xiàn)正相關(guān)性，直接影響不同花生抗旱性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是，根據(jù)上述花生體內(nèi)ΑΒΑ含量與AhNCEDl基因和蛋白表達(dá)的正相 關(guān)性，針對(duì)傳統(tǒng)鑒定花生抗旱性方法的缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種基于分子生物學(xué)的鑒定花生抗旱 性方法。
[0006] 為達(dá)到以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 首先，設(shè)計(jì)一種花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（AhNCEDl基因）的探針， 所述探針的5'端到3'端的脫氧核苷酸序列為：ATGTCCCCGGAATCTCCATCCTCTCTGT。
[0008] 然后，設(shè)計(jì)一種快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其中，采用如前所述的花生9-順 式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的探針檢測(cè)花生的組織中的9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加 氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)所述9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá) 量的高低，判定被檢測(cè)的花生品種的抗旱性的強(qiáng)弱情況。
[0009] 關(guān)于檢測(cè)材料：所述花生組織是花生葉片。具體地，所述花生葉片為花生四葉期幼 苗的葉片。
[0010] 檢測(cè)材料需要進(jìn)行前期處理：所述花生葉片在對(duì)花生植株進(jìn)行干旱脅迫處理后進(jìn) 行9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。所述干旱脅迫處理時(shí)間 為2小時(shí)。所述花生植株用20%的平均分子量為6000的聚乙二醇（PEG-6000)進(jìn)行干旱脅 迫處理。
[0011] 基因表達(dá)的檢測(cè)：所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá) 量的檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real Time PCR)。
[0012] 具體地，所述實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)體系包括目的基因的探針和引 物對(duì)，以及內(nèi)參基因的探針和引物對(duì)；
[0013] 所述目的基因?yàn)樗?-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因，其引物對(duì) 的5'端到3'端的脫氧核苷酸序列分別為，上游：TTACCTGTGGGATTGTTTGC，下游： ACATGAGCCTCTACTTCTGC ；
[0014] 所述內(nèi)參基因?yàn)?8S，其引物對(duì)的5'端到3'端的脫氧核苷酸序列分別為，上游： TACGTCCCTGCCCTTTGTAC，下游：CCTACGGAAACCTTGTTACGAC ;所述 18S 的探針的 5' 端到 3' 端 的脫氧核苷酸序列為：ACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAA。
[0015] 更進(jìn)一步地，所述實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件為：首先在95°C下保 溫30秒；然后在如下條件循環(huán)40次：95°C保溫5秒，降溫至60°C保溫34秒。
[0016] 關(guān)于相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)方法：所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因 的相對(duì)表達(dá)量采用2^ 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0017] 基于上述的基因表達(dá)的檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法，判定被檢測(cè)的花生品種的抗旱 性的標(biāo)準(zhǔn)為：所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量大于500的 定義為強(qiáng)抗旱花生品種；所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量 為50?500的定義為中等抗旱花生品種；所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的 基因的相對(duì)表達(dá)量小于50的定義為弱抗旱花生品種。
[0018] 進(jìn)一步地，所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量越 高，指示被檢測(cè)的花生品種的抗旱性越強(qiáng)。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0020] (1)本發(fā)明所取用的花生組織為四葉期的花生幼苗的葉片，只需要將花生種子在 光照培養(yǎng)箱的條件下培養(yǎng)10天左右即可獲得，使得本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法在花生幼苗 期即可確定被檢測(cè)品種的抗旱性強(qiáng)弱；
[0021] (2)本發(fā)明對(duì)花生植株只需要用20%的PEG-6000浸泡根部2小時(shí)，即可有效模擬 干旱脅迫，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短；
[0022] (3)本發(fā)明采用Real Time PCR對(duì)花生的抗旱性進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法相比，使用 的花生材料少，取材簡(jiǎn)單，通常僅需80-100mg花生葉片即可；
[0023] (4)本發(fā)明利用AhNCEDl基因相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果，只需對(duì)比干旱脅迫處理前后花 生葉片AhNCEDl基因相對(duì)表達(dá)量的變化倍數(shù)，即可確定其抗旱性強(qiáng)弱，相對(duì)于傳統(tǒng)的繁瑣 的計(jì)算統(tǒng)計(jì)，結(jié)果簡(jiǎn)單明了，也可量化；
[0024] (5)本發(fā)明對(duì)于AhNCEDl基因表達(dá)檢測(cè)采用TaqMan探針?lè)ǎc一般的SYBR法（染 料法）相比，探針?lè)ǜ鼮殪`敏，穩(wěn)定性和重復(fù)性也更高，結(jié)果更為可信，儲(chǔ)存穩(wěn)定，更可以用 于研發(fā)通用的試劑盒產(chǎn)品。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為本發(fā)明快速檢測(cè)花生抗旱性的技術(shù)流程圖。
[0026] 圖2干旱脅迫不同時(shí)間下各產(chǎn)地不同花生品種葉片AhNCEDl的表達(dá)變化。
[0027] 圖3干旱脅迫下不同產(chǎn)地花生品種葉片含水量的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0029] 實(shí)施例
[0030] 一、目的基因和內(nèi)參基因的引物和探針的設(shè)計(jì)
[0031] 根據(jù) AhNCEDl 的 cDNA 序列，利用 Primer Premier5. 0 軟件進(jìn)行 Real Time PCR 引 物設(shè)計(jì)（表1)。引物合成由公司完成。
[0032] 表1花生內(nèi)參基因和目的基因?qū)?yīng)引物
[0033]
【權(quán)利要求】
1. 一種花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的探針，其特征在于，所述探針的5'端 到3'端的脫氧核苷酸序列為：ATGTCCCCGGAATCTCCATCCTCTCTGT。
2. -種快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：采用如權(quán)利要求1所述的花生9-順 式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的探針檢測(cè)花生的組織中的9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加 氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)所述9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá) 量的高低，判定被檢測(cè)的花生品種的抗旱性的強(qiáng)弱情況。
3. 如權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生組織是花 生葉片。
4. 如權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生葉片為花 生四葉期幼苗的葉片。
5. 如權(quán)利要求4所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生葉片在對(duì) 花生植株進(jìn)行干旱脅迫處理后進(jìn)行9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá) 量檢測(cè)。
6. 如權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述干旱脅迫處理 時(shí)間為2小時(shí)。
7. 如權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生植株用 20 %的平均分子量為6000的聚乙二醇進(jìn)行干旱脅迫處理。
8. 如權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生9-順 式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈 式反應(yīng)。
9. 如權(quán)利要求8所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量熒光 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)體系包括目的基因的探針和引物對(duì)，以及內(nèi)參基因的探針和引物 對(duì)； 所述目的基因?yàn)樗?-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因，其引物對(duì) 的5'端到3'端的脫氧核苷酸序列分別為，上游：TTACCTGTGGGATTGTTTGC，下游： ACATGAGCCTCTACTTCTGC ； 所述內(nèi)參基因?yàn)?8S，其引物對(duì)的5'端到3'端的脫氧核苷酸序列分別為，上游： TACGTCCCTGCCCTTTGTAC，下游：CCTACGGAAACCTTGTTACGAC ;所述 18S 的探針的 5' 端到 3' 端 的脫氧核苷酸序列為：ACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAA。
10. 如權(quán)利要求9所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量熒光 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件為：首先在95°C下保溫30秒；然后在如下條件循環(huán)40次：95°C 保溫5秒，降溫至60 C保溫34秒。
11. 如權(quán)利要求8所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生9-順 式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量采用法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
12. 如權(quán)利要求11所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于，判定被檢測(cè)的花 生品種的抗旱性的標(biāo)準(zhǔn)為：所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá) 量大于500的定義為強(qiáng)抗旱花生品種；所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因 的相對(duì)表達(dá)量為50?500的定義為中等抗旱花生品種；所述花生9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜 素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量小于50的定義為弱抗旱花生品種。
13.如權(quán)利要求2或12所述的快速檢測(cè)花生抗旱性的方法，其特征在于：所述花生 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的基因的相對(duì)表達(dá)量越高，指示被檢測(cè)的花生品種的抗 旱性越強(qiáng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104087675SQ201410341788
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】劉帥, 李玲, 李麗梅, 李曉云 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)