一種用于解析牦牛瘤胃微生物結構多樣性的dna提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于解析牦牛瘤胃微生物結構多樣性的DNA提取方法，利用物理、化學和酶等多種方法配合對細胞壁進行裂解，使之能夠最大限度釋放微生物DNA，特別是對革蘭氏陽性菌有很好的裂解效果；另外，本發明所用的化學試劑都是實驗室常備的，容易獲得且價格低廉。使用本發明得到的高通量測序結果能夠比較準確地反映瘤胃中微生物的豐度及多樣性。
【專利說明】一種用于解析牦牛瘤胃微生物結構多樣性的DNA提取方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物實驗技術，尤其是一種用于評價反芻動物瘤胃微生物群落多樣性 的DNA提取方法。

【背景技術】
[0002] 反芻動物瘤胃內存在著豐富的微生物菌群，這些微生物菌群能夠通過發酵，將難 以消化的纖維素轉化為可以被小腸吸收的蛋白質、氨基酸、糖類、酸類和脂類等，為反芻動 物提供營養物質。另外，這些微生物對機體的免疫、生長發育等方面也有著巨大的影響。因 此，它們的分離和鑒定對于研究瘤胃菌群功能具有重要作用。此外，瘤胃微生物作為一個巨 大的基因庫，探索其中具有應用價值的基因，可以應用于農牧業，醫療保健，生物化工等方 面，從而更好地為人類服務。
[0003] 傳統分離瘤胃微生物的方法主要是通過選擇性培養基分離法。由于培養條件 的限制，迄今為止，瘤胃中微生物只有小部分能夠被培養，絕大多數還不為人所知。近 年來，隨著分子生物學技術的發展，產生了一些新的微生物研究方法，如：變性梯度凝膠 電泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)，末端限制性片段長度多態性 (Terminal restriction fragment length polymorphisms, T-RFLP)以及高通量測序方法 (high throughput sequencing technology)這些方法突破了微生物分離培養的限制，能 夠用于全面分析自然界的微生物類群及充分挖掘基因資源。然而，對于這些基于核酸技術 來分析樣本微生物結構的方法，DNA提取的質量好壞，會直接影響到微生物群落結構分析結 果。因此，探索簡便、高效、低成本的DNA提取方法將是研究瘤胃微生物菌落結構研究所面 臨的重要難題。
[0004] 牦牛大多生活在高海拔，低氧，低溫，采食惡劣的環境中，由于所處的惡劣讓牦牛 消化系統更加高效和穩定，保障其生存和繁衍。再加上如今經濟全球化，環境污染和生物 入侵日漸加重，青藏高原作為地球上不多的未受大規模污染的地方，不論生態環境還是飼 養方法都是出于比較原始的狀態。牧區由于畜牧醫療技術的相對落后及抗生素等藥物的慎 用，保證了牦牛瘤胃中的大量微生物是處在原始狀態，未受到人為因素影響的。因此，牦牛 也是研究瘤胃微生物群落結構的最好的模式動物。另外，與規模舍飼養殖的牛群相比，由于 特殊的采食環境，牦牛瘤胃內往往含有大量的腐殖質和泥沙，這些物質會對DNA提取產生 影響并增加基因組提取的難度，因此探索一套適合于牦牛瘤胃微生物DNA提取方法具有重 要意義。


【發明內容】

[0005] 鑒于現有技術的以上不足，本發明的目的提供一種更適合的牦牛瘤胃微生物結構 多樣性的DNA提取方法，使之更為準確地反映瘤胃中微生物的豐度及多樣性。
[0006] 為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案來實現：
[0007] -種用于分析牦牛瘤胃微生物群落多樣性提取方法，包括以下步驟：
[0008] (1)向0. 5-2g牦牛瘤胃樣品中加入10ml4°C樣品洗滌液A，渦旋振蕩lmin4°C離 心機，1000r/min，離心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃內容物的離心管中加入4°C 5ml 洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃內容物的離心管中 加入4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液。所有上清液于4°C， 12000r/min離心lOmin，小心倒掉離心管上層清液，保留離心管底部的微生物和腐殖質，泥 土混合物的沉淀層。
[0009] (2)微生物沉淀層里邊加入60ul裂解緩沖液B，加入3ul蛋白酶K，顛倒混勻，放置 于58°C恒溫搖床孵育lh。
[0010] 加入 lOOul NaCl 溶液，加入 80ul CTAB 裂解液 65°C水浴 lOmin。
[0011] 加入〇. lg直徑為〇. 2mm beads,放置于渦旋振蕩儀上進行順時針和逆時針渦旋交 替震蕩3min。
[0012] 加入溶菌酶3mg，顛倒混勻，放置于37°C恒溫搖床，孵育lh。
[0013] 加入等體積（氯仿：異戊醇=24:1)，混勻后放于冰上靜置，3min，12000r/min抽提 蛋白質。
[0014] 吸取上清液置新滅菌離心管中，加入等體積（苯酚：氯仿：異戊醇= 25:24:1)混 勻于冰上靜置3min。
[0015] 12000r/min抽提蛋白質吸取上清液，置于新的滅菌離心管中，再次加入等體積 (氯仿：異戊醇=24:1),混勻后放于冰上靜置5min。
[0016] 12000r/min離心5min,吸取上清液放置于新的離心管中，加入0. 6倍體積異丙醇， 重懸，室溫放置5min。
[0017] 12000r/min 離心 lOmin，加入 1Π 11701%冰乙醇洗漆。
[0018] 12000r/min離心5min，加入50ul無菌水溶解。
[0019] 加入3ul RNA酶，37°C，靜置lh，獲得純度較高的DNA溶液。
[0020] 用分光光度計對DNA溶液濃度和純度進行測定，結果表0D260/0D230 = 1. 93， 0D260/0D280 = 1. 85,均接近標準值（DNA 溶液 0D260/0D230 標準值為 2. 0,0D260/0D280 = 1. 8)，DNA量達到0. 5ug-2ug (達到了后續相關高通量測序對DNA量要求）；以0. 8 %瓊脂糖 凝膠電泳，λ DNA作為對照，檢測所提取DNA片段完整性，電泳結果發現所提取的DNA具有 較好的完整性。
[0021] 上述步驟中的洗滌液Α為PBS緩沖液，可以避免滲透壓不同而造成的細胞裂解。
[0022] 上述步驟中的裂解緩沖液B為TE緩沖液（pH = 7)，可以維持后續反應的最佳理化 條件。
[0023] 上述步驟中的CTAB裂解液濃度為10 %。
[0024] 上述步驟中的蛋白酶K溶液濃度為20mg/ml。
[0025] 上述步驟中的NaCl溶液為5mol/L。
[0026] 本發明是利用物理、化學和酶等多種方法對細胞壁進行裂解，從而能夠最大限度 釋放微生物DNA，特別是對革蘭氏陽性菌有很好的裂解效果；另外，本發明所用的化學試劑 都是實驗室常備的，容易獲得且價格低廉。使用本發明得到的高通量測序結果能夠比較準 確地反映瘤胃中微生物的豐度及多樣性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為本發明提取的牦牛瘤胃微生物基因組DNA電泳圖譜。
[0028] 圖2為不同DNA提取方法得到的牦牛瘤胃微生物群體結構分布圖（在門分類水平 上）。圖中可以看出不同DNA基因組提取方法所得到的微生物結構存在差異。
[0029] 圖3為不同DNA提取方法得到牦牛瘤胃微生物群體結構Heat-map比對圖，為基于 樣品豐度前50的瘤胃細菌群體的熱圖。Heat-map中，其用顏色深淺來表示所代表數值大 小，通過顏色直觀變化，可以反映不同DNA提取方法之間微生物群體結構數據差異.圖中可 以看出本發明（方法6)提取的瘤胃微生物的基因組能夠較真實全面反映瘤胃內部微生物 結構。

【具體實施方式】
[0030] 以下結合具體實例進一步詳細描述本發明的技術方案。
[0031] Nac 1、Kc 1、Na2HP04、KH2P04、CTAB、堿性飽和酚、氯仿、異戊醇等試劑均為國產分析純 試劑，蛋白酶K，溶菌酶均為進口生物純試劑。
[0032] 實施例1 :瘤胃內容物采集
[0033] 用滅菌手術刀，在剛從宰殺牦牛體內取出的瘤胃背部打開約10CM的平整外翻切 口。帶一次性滅菌手套，支撐切口，采樣者手戴一次性滅菌手套，持已經滅菌50ml離心管， 在未打開的情況下，探入瘤胃中開蓋，充分攪動樣品使瘤胃內容物能夠充分混勻，裝入離心 管。離心管裝滿后，應當在瘤胃中立即蓋嚴，然后取出，迅速投入干冰當中凍存，迅速帶回實 驗室于-80°C冰箱中保存。
[0034] 實施例2 :微生物菌體獲得
[0035] 為了保證微生物DNA中沒有過多的動植物細胞DNA污染，微生物菌體沉淀的獲得 后續獲得高質量微生物DNA的前提。向0. 5-2g牦牛瘤胃樣品中加入10ml4°C樣品洗滌液A， 潤旋振蕩lmin4°C離心機，1000r/min，離心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃內容物的離 心管中加入4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃 內容物的離心管中加入4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液。所 有上清液于4°C，12000r/min離心lOmin，小心倒掉離心管上層清液，保留離心管底部的微 生物和腐殖質，泥土混合物的沉淀層。
[0036] 實施例3 :微生物基因組提取
[0037] 微生物菌體團里邊加入60ul裂解緩沖液B，加入3ul蛋白酶K，顛倒混勻，放置于 58°C恒溫搖床孵育lh。
[0038] 加入 lOOul NaCl 溶液，加入 80ul CTAB 裂解液 65°C水浴 lOmin ;
[0039] 加入0. lg直徑為0. 2mm beads,放置于渦旋振蕩儀上進行順時針和逆時針渦旋交 替震蕩3min。
[0040] 加入溶菌酶3mg，顛倒混勻，放置于37°C恒溫搖床，孵育lh。
[0041] 加入等體積（氯仿：異戊醇=24:1)，混勻后放于冰上靜置，3min，12000r/min抽提 蛋白質。
[0042] 吸取上清液置新滅菌離心管中，加入等體積（苯酚：氯仿：異戊醇= 25:24:1)混 勻于冰上靜置3min。
[0043] 12000r/min抽提蛋白質吸取上清液，置于新的滅菌離心管中，再次加入等體積 (氯仿：異戊醇=24:1),混勻后放于冰上靜置5min.
[0044] 12000r/min離心5min，吸取上清液放置于新的離心管中，加入0. 6倍體積異丙醇， 重懸，室溫放置5min.
[0045] 12000r/min 離心 lOmin，加入 lml70%冰乙醇洗滌
[0046] 12000r/min離心5min，加入50ul無菌水溶解，
[0047] 加入3ul RNA酶，37°C，靜置lh，獲得純度較高的DNA溶液。
[0048] 實施例3DNA濃度、純度及完整性檢測
[0049] 采用分度光度計對提取的DNA溶液純度、濃度進行檢查。結果表明：0D260/0D230 =1. 93, 0D260/0D280 = 1. 85,均接近標準值（DNA 溶 0D260/0D230 標準值為 2. 0, 0D260/ 0D280 = 1.8)，DNA量達到0. 5ug-2ug (達到了后續相關高通量測序對DNA量要求）。以 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，入〇嫩作為1&^1?^，電壓為15(^，電泳時間為451^11，對提取的0嫩 片段完整性進行檢查，如圖1所示，電泳結果發現所提取的DNA具有較好的完整性。
[0050] 實施例416rDNA PCR擴增及高通量測序分析
[0051] 對實施例2中提取的DNA進行16S rDNA的PCR擴增并對擴增產物進行瓊脂糖凝 膠電泳檢測。16S rDNA 通用引物（338F:5, -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' ；806R:5' -GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3'），PCR產物送至深圳華大基因研究院進行高通量測序及數據分析。基于 Illumina MiSeq PE300(Illumina，USA)測序平臺，對瘤胃基因組進行16S rR NA高通量測 序。Miseq測序得到的raw reads首先根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質 控和過濾。序列過濾后，將那些具有高度相似性（97%)的序列歸為一個OTU(Operational Taxonomic Unit)，同時，RDP(Ribosomal Database Project)數據庫被用于物種分類學分 析。基于以上分類學信息，ACE豐度指數及Shannon多樣性指數被估算出來，具體測序信息 見表1，從表1中可以看出本發明提取的DNA具有較高的微生物群體多樣性及豐度指數。
[0052] 表1本發明提取牦牛瘤胃微生物DNA相關16S rDNA測序信息
[0053]

【權利要求】
1. 一種用于解析牦牛瘤胃微生物結構多樣性的DNA提取方法，包括以下步驟： (1) 向0. 5-2g牦牛瘤胃樣品中加入10ml4°C樣品洗滌液A，渦旋振蕩lmin，4°C離心機， 1000r/min，離心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃內容物的離心管中加入4°C 5ml洗滌 液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；再次向含有瘤胃內容物的離心管中加入 4°C 5ml洗滌液A，放置于渦旋震蕩儀，振蕩lmin，吸取上清液；所有上清液于4°C，12000r/ min離心lOmin，倒掉離心管上層清液，保留離心管底部的微生物和腐殖質，泥土混合物的 沉淀層； (2) 微生物沉淀層里邊加入60ul裂解緩沖液B，加入3ul蛋白酶K，顛倒混勻，放置于 58°C恒溫搖床孵育lh ; 加入lOOul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65°C水浴lOmin; 加入0. lg直徑為0. 2mm beads,放置于渦旋振蕩儀上進行順時針和逆時針渦旋交替震 蕩 3min ; 加入溶菌酶3mg，顛倒混勻，放置于37°C恒溫搖床，孵育lh ; 加入等體積（氯仿：異戊醇=24:1)，混勻后放于冰上靜置，3min, 12000r/min抽提蛋白 質； 吸取上清液置新滅菌離心管中，加入等體積（苯酚：氯仿：異戊醇=25:24:1)混勻于 冰上靜置3min ; 12000r/min抽提蛋白質吸取上清液，置于新的滅菌離心管中，再次加入等體積（氯仿： 異戊醇=24:1),混勻后放于冰上靜置5min ; 12000r/min離心5min,吸取上清液放置于新的離心管中，加入0. 6倍體積異丙醇，重 懸，室溫放置5min ; 12000r/min離心lOmin，加入lml70%冰乙醇洗滌； 12000r/min離心5min，加入50ul無菌水溶解； 加入3ul RNA酶，37°C，靜置lh，獲得目標純度DNA溶液。
2. 根據權利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物結構多樣性的DNA提取方法，其特 征在于，所述洗滌液A為PBS緩沖液。
3. 根據權利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物結構多樣性的DNA提取方法，其特 征在于，所述裂解緩沖液B為TE緩沖液（pH = 7)。
【文檔編號】C12Q1/04GK104099323SQ201410341823
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】蘭道亮, 李鍵, 陳亞冰, 湯承, 熊顯榮, 劉洛川 申請人:西南民族大學