出芽短梗霉蘋果酰輔酶a連接酶及其重組表達載體和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示，含有439位氨基酸，cDNA序列如SEQ?ID?NO.9所示，基因組序列如SEQ?ID?NO.8所示，將cDNA序列經重組表達后能夠獲得分子量約為68kDa的重組蛋白，經酶學性質檢測發現，重組表達的蘋果酰輔酶A連接酶的活性為0.176U，最適反應溫度為25℃，最適pH為8.0，最適ATP底物濃度為0.2mM，并且具有較廣的底物選擇性，可以催化不同單體蘋果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、檸檬酸、丁酸或丙二酸反應，并提高聚蘋果酸的產量。
【專利說明】出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶及其重組表達載體和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，具體涉及出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶基因，還涉 及表達蘋果酰輔酶A連接酶的重組表達載體和應用。

【背景技術】
[0002] 聚蘋果酸（Polymalic acid，PMA)是一種新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物， 由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可作為藥物載體與微膠囊材料、生物 醫學材料、吸水材料、化妝品、食品包裝等材料，具有廣泛的應用前景。
[0003] 聚蘋果酸主要由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans)發酵生產，對聚蘋果 酸的生物合成途徑研究表明，聚蘋果酸是以TCA循環產生的蘋果酸為底物進行合成。然 而，迄今為止，以蘋果酸為單體聚合生產聚蘋果酸的聚合途徑及相關基因尚未闡明。基于 前期文獻調研，聚蘋果酸的聚合途徑可能涉及兩個酶即蘋果酰輔酶A連接酶（malate-CoA ligase，Mcl)和聚蘋果酸合成酶（polymalic acid synthase, Pas)參與反應，但是相關基 因及序列在A. pullulans中未見報道，蘋果酰輔酶A連接酶在ATP及輔酶A參與下，實現對 單體蘋果酸的酰基化，聚蘋果酸合成酶催化聚合反應。微生物產生的聚酯型聚合物通常需 要對單體酰基活化后，在聚合酶的催化作用下生產聚合物（Biomacromolecules, 2012, 13:2 964-2972)。因此，單體酰基活化酶的底物特異性對于聚合單體的選擇及新型共聚物材料的 創制具有重要意義。本發明首次從真核生物出芽短梗霉中克隆得到蘋果酰輔酶A連接酶基 因，對實現出芽短梗霉代謝工程改造及提高聚蘋果酸合成產率具有重要意義。


【發明內容】

[0004] 有鑒于此，本發明的目的之一在于提供出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶；本發明 的目的之二在于提供表達出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶的重組表達載體；本發明的目的 之三在于提供出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶在催化單體中的應用；本發明的目的之四在 于提供出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶在出芽短梗霉中提高聚蘋果酸產量中的應用。
[0005] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0006] 1.出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶，所述蘋果酰輔酶A連接酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. 10 所示。
[0007] 優選的，編碼所述蘋果酰輔酶A連接酶的cDNA如SEQ ID NO. 9所示。
[0008] 優選的，所述蘋果酰輔酶A連接酶的基因組序列如SEQ ID NO. 8。
[0009] 2.表達所述出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶的重組表達載體。
[0010] 優選的，所述重組表達載體由SEQ ID N0. 9所示序列連入pET32a (+)載體的BamH I和Hind III酶切位點而得。
[0011] 3.所述的出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶在催化單體與輔酶A反應中的應用，所 述單體為蘋果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、檸檬酸、丁酸、丙二酸中的應用。
[0012] 優選的，出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶在催化蘋果酸與輔酶A生成蘋果酰輔酶 A中的應用。
[0013] 4、所述的出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶在出芽短梗霉中提高聚蘋果酸產量中 的應用。
[0014] 本發明的有益效果在于：本發明首次從真核生物出芽短梗霉克隆了編碼蘋果酰 輔酶A的基因組序列和cDNA序列，經比對發現，出芽短梗霉同褐螺菌屬Phaeospirillum molischianum蘋果酰輔酶A連接酶編碼氨基酸同源性為51 %，同紅桿菌屬Rhodobacter capsulatus蘋果酰輔酶A連接酶氨基酸同源性49%，表明本發明克隆得到的蘋果酰輔酶A 連接酶為一種新酶蛋白，本發明還公開了將表達蘋果酰輔酶A連接酶的重組載體，將蘋果 酰輔酶A連接酶重組表達后最適反應溫度為25°C，但在20-40°C條件下均具有較好的催化 活性；最適酶促反應pH為8. 0,且在高濃度的ATP下對酶活性具有抑制作用，經蘋果酰輔酶 A連接酶單體選擇性實驗表明，出芽短梗霉來源的蘋果酰輔酶A連接酶具有較寬的底物選 擇性，草酸、草酰乙酸、琥珀酸、檸檬酸、丁酸、丙二酸等均可作為該酶的催化底物。因此，本 發明獲得的蘋果酰輔酶A連接酶可作為新型共聚物材料聚合的起始酶，開發新型高分子可 降解材料。本發明還發現在出芽短梗霉中過表達出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶能夠提高 聚蘋果酸的產量，為通過代謝工程提高聚蘋果酸的產量提供了有力工具。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0016] 圖1為蘋果酰輔酶A連接酶SDS-PAGE分析結果圖。
[0017] 圖2為溫度對蘋果酰輔酶A連接酶活力的影響。
[0018] 圖3為pH對蘋果酰輔酶A連接酶活力的影響。
[0019] 圖4為ATP濃度對蘋果酰輔酶A連接酶的影響。
[0020] 圖5為蘋果酰輔酶A連接酶對不同底物的選擇性。
[0021] 圖6為重組質粒pBARGPEl-Mcl酶切驗證結果圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023] 本發明通過生物信息學分析，根據蘋果酰輔酶A連接酶基因的保守序列，設計兼 并引物，從出芽短梗霉中克隆得到聚蘋果酸聚合途徑中的蘋果酰輔酶A連接酶的核心片 段，采用IPCR的方法成功克隆到了 cDNA全長基因，并純化該酶，研究其酶學特性及功能驗 證。
[0024] 實施例1、蘋果酰輔酶A連接酶基因的克隆
[0025] 利用生物信息學分析NCBI中已報道的蘋果酰輔酶A連接酶基因序 列，序列來自莫氏褐螺菌（Phaeospirillum molischianum，WP_002730336);布 魯氏菌（Brucell， WP_0〇85〇3553a);莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus， WP_013066464);深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum，WP_011388966);脫氮副球 菌（Paracoccus denitrificans，WP_01174690);將序列進行比對分析后在保守區設計 兼并引物，上游引物為：5'-argghggtatggacattgagg-3'（SEQIDN0·l)，下游引物為： 5，-ccrccraaratgttgacraag-3，(SEQ ID NO. 2)，其中 r = a/g，y = c/t，m = a/c，k = g/ t，s = c/g,w = a/t,h = a/c/t,b = c/g/t, v = a/c/g, d = a/g/t,n = a/c/g/t),然后以 出芽短梗霉（Aureobasidium pullans)CCTCC N0:M2012223基因組為模板，進行PCR擴增， 擴增條件為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸3〇8,30個循環；721： 后延伸lOmin ;25°C保溫lOmin。然后將PCR產物經瓊脂糖電泳，并回收目的片段，回收產物 連接PMD19-T Vector，經測序獲得如SEQ ID NO. 3所示序列，記為蘋果酰輔酶A連接酶基因 核心片段，該片段為666bp的核苷酸片段。
[0026] 然后根據IPCR原理，設計擴增蘋果酰輔酶A連接酶全長的引物，具體如表1所示：
[0027] 表1.IPCR引物序列

【權利要求】
1. 出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶，其特征在于：所述蘋果酰輔酶A連接酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 10所示。
2. 根據權利要求1所述的出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶，其特征在于：編碼所述蘋 果酰輔酶A連接酶的cDNA如SEQ ID NO. 9所示。
3. 根據權利要求1所述的出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶，其特征在于：所述蘋果酰 輔酶A連接酶的基因組序列如SEQ ID NO. 8。
4. 表達權利要求1-3任一項所述出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶的重組表達載體。
5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體由SEQ ID NO. 9所示序列連入pET32a(+)載體的BamH I和Hind III酶切位點而得。
6. 權利要求1-3任一項所述的出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶在催化單體與輔酶A反 應中的應用，所述單體為蘋果酸、草酸、草酰乙酸、琥珀酸、檸檬酸、丁酸或丙二酸。
7. 權利要求1-3任一項所述的出芽短梗霉蘋果酰輔酶A連接酶在出芽短梗霉中提高聚 蘋果酸產量中的應用。
【文檔編號】C12N9/00GK104099302SQ201410345101
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】鄒祥, 吳小燕, 涂光偉 申請人:西南大學