環(huán)糊精在原核可溶性表達系統(tǒng)中降低細胞毒性的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開一種環(huán)糊精在原核可溶性表達系統(tǒng)降低細胞毒性的用途，解決由于可溶性表達核糖核酸酶所產(chǎn)生的細胞毒性，通過添加環(huán)糊精，不僅降低IPTG對使大腸桿菌BL21-onconase的細胞毒性和生長抑制，而且減少由于可溶性表達蛋白造成對細胞生長的影響，增加可溶性蛋白的表達，為下一步通過分離純化藥用蛋白奠定基礎。
【專利說明】環(huán)糊精在原核可溶性表達系統(tǒng)中降低細胞毒性的用途
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】： 本發(fā)明公開一種環(huán)糊精在原核可溶性表達系統(tǒng)中降低細胞毒性的用途，解決由于可溶 性表達外源蛋白（如蛙卵核糖核酸酶）所產(chǎn)生的細胞毒性，增加具有生物活性蛋白的產(chǎn)量， 屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 原核細胞表達系統(tǒng)，具有方法簡單、產(chǎn)物便于純化和易鑒定等優(yōu)點，是構(gòu)建基因工 程菌首選的表達系統(tǒng)。在基因重組技術(shù)中，以大腸桿菌為宿主細胞的外源基因表達產(chǎn)物往 往因為環(huán)境不利而產(chǎn)生細胞毒性，一方面抑制細胞的生長，另一方面會使外源基因在體內(nèi) 形成無活性的蛋白質(zhì)聚集體(包涵體)。使無活性的蛋白質(zhì)變成有活性的過程為蛋白質(zhì)復 性。文獻中曾報道過多種蛋白質(zhì)復性技術(shù)，但結(jié)果不是十分理想。
[0003] 對于解決細胞毒性表達產(chǎn)物的方法，一般可以采用三種方法，一是用真核生物表 達系統(tǒng)，但由于真核表達系統(tǒng)的復雜性和發(fā)酵時間相對較長，限制其進一步應用；二是采用 基因融合的表達方法，即將細胞毒性產(chǎn)物的編碼基因和另外的基因序列連接在一起進行表 達，然后再把產(chǎn)物剪切，得到具有細胞毒性的產(chǎn)物，但因純化過程繁瑣導致其產(chǎn)量不高；三 是仍然利用原核系統(tǒng)，通過包涵體形式經(jīng)復性得到重組蛋白，而包涵體復性一直是蛋白純 化領(lǐng)域的難題。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明提供一種環(huán)糊精在原核可溶性表達系統(tǒng)降低細胞毒性的用途，將環(huán)糊精作為小 分子伴侶，添加到可溶性表達核糖核酸酶（onconase)的基因工程菌BL21-〇nconase培養(yǎng)基 中，考察其對大腸桿菌BL21_onconase可溶性表達Onconase時細胞毒性的影響，提供一種 通過降低細胞毒性從而提高原核中可溶性表達外源蛋白的方法。
[0005] 本發(fā)明通過對大腸桿菌BL21-〇nc〇naSe的發(fā)酵實驗表明環(huán)糊精在原核可溶性表 達系統(tǒng)中降低細胞毒性的用途，具體操作過程如下： 1) 挑取單克隆 BL21-〇nconase 接種于 5ml LB 培養(yǎng)基（100g/ml Ampicillin)，37°C培 養(yǎng)過夜，按1.2%(v/v)接種于100ml LB培養(yǎng)基（100 g/ml Ampicillin)中，37°C培養(yǎng)，當 菌液的〇D6(?為0. 6時，加入0. 1 mM IPTG和1.0%β-環(huán)糊精，30 °C誘導表達4h; 2) 誘導表達結(jié)束后，離心（6000 rpmX 10 min),收集菌體； 3) 菌體于20 mM，pH 6. 5 PBS中反復洗漆兩次，離心，重懸于等體積的20 mM，pH 6. 5 PBS中，加入PMSF (100 μ g/ml異丙醇)，采用反復凍融裂解和冰浴下超聲破碎法破碎菌體， 離心（15000 rpmX30 min)，收集上清液，進行12% SDS-PAGE分析，結(jié)果用凝膠成像定量分 析軟件分析，以沉淀重量表示細胞的生長情況，目的蛋白表達量占全菌可溶性蛋白量的比 例為指標，進行比較分析，結(jié)果見圖1和圖2。
[0006] 圖1結(jié)果表明，在未添加環(huán)糊精，當IPTG濃度從0. 1-lmM逐漸增加時，菌體的重量 從4. 5 g/L降低到3. 5 g/L，說明IPTG誘導的可溶性表達產(chǎn)生細胞毒性；加入β -環(huán)糊精 后在IPTG濃度不變，如0. 1 mM，當環(huán)糊精的含量從0. 2%增加到1. 0%的時候，菌體的重量從 5. 1 g/L增加到7.2 g/L，表明加入環(huán)糊精增加了菌體的重量，減少了 IPTG造成的細胞毒性 和生長抑制，促進了細胞生長。
[0007] 圖2結(jié)果表明，在1.0% β-環(huán)糊精，0· ImM IPTG下，BL21_onconase細胞中的 onconase可溶性表達量最高，是對照組的4. 7倍。小分子化學伴侶不僅可以降低細胞毒性 促進重組蛋白表達，而且可以顯著提高表達的onconase在可溶性蛋白中的組分。總之，環(huán) 糊精可降低IPTG誘導產(chǎn)生的細胞毒性作用。
[0008] 本發(fā)明的積極效果在于：通過添加環(huán)糊精，不僅降低IPTG對使大腸桿菌 BL21-〇nc〇naSe的細胞毒性和生長抑制，而且減少由于可溶性表達蛋白造成對細胞生長的 影響，增加可溶性蛋白的表達，為下一步通過分離純化藥用蛋白奠定了基礎。
[0009]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1環(huán)糊精對菌體重量的影響； 圖2環(huán)糊精對蛋白含量的影響。

【具體實施方式】
[0010] 實施例1 娃核糖核酸酶（onconase)的來源有兩種，一是從林娃卵中提取，但由于來源有限，并 在提取過程中常采用有機溶劑會影響其生物活性，限制了其應用；二是采用基因工程方法 構(gòu)建工程菌，原核表達中通常采用pFlag-CTS表達系統(tǒng)，載體有甲硫氨酸（M)引導的0ΜΡΑ 信號肽，在原始表達產(chǎn)物的N末端，它可以引導表達產(chǎn)物到達細胞的周質(zhì)腔，并在細胞內(nèi) 被酶水解0ΜΡΑ，產(chǎn)生有活性蛋白。也是基于這個原因，在細胞內(nèi)會產(chǎn)生細胞毒性，影響細胞 生長并進一步影響外源基因的表達，常規(guī)實驗室表達條件下較難難得到表達產(chǎn)物，Western blot檢測常常顯示陰性。本發(fā)明將提供一種環(huán)糊精在原核可溶性表達系統(tǒng)降低細胞毒性 的用途，不但降低細胞毒性，而且提高目標蛋白的表達。
[0011] 將表達核糖核酸酶的基因工程菌BL21-0nconase在37°C培養(yǎng)至菌液的0D600達 到0.6時，加入0.1 mM IPTG和1.0% β-環(huán)糊精，30 °C誘導表達4h;收集菌體；菌體破碎， 收集上清液，進行12% SDS-PAGE分析，結(jié)果用凝膠成像定量分析軟件分析，以沉淀重量表示 細胞的生長情況，目的蛋白表達量占全菌可溶性蛋白量的比例為指標。由圖1結(jié)果顯示， 在未添加環(huán)糊精，當IPTG濃度從0. 1-lmM逐漸增加時，菌體的重量從4. 5 g/L降低到3. 5 g/L，說明IPTG誘導的可溶性表達產(chǎn)生細胞毒性；加入β -環(huán)糊精后在IPTG濃度不變，如 0. ImM，當環(huán)糊精的含量從0. 2%增加到1. 0%的時候，菌體的重量從5. 1 g/L增加到7. 2 g/ L，表明加入環(huán)糊精增加了菌體的重量，減少了 IPTG造成的細胞毒性和生長抑制，促進了細 胞生長。
[0012] 圖2結(jié)果表明，在1.0% β-環(huán)糊精，0· ImM IPTG下，BL21_onconase細胞中的 onconase可溶性表達量最高，是對照組的4. 7倍。小分子化學伴侶不僅可以降低細胞毒性 促進重組蛋白表達，而且可以顯著提高表達的onconase在可溶性蛋白中的組分。
[0013] 結(jié)論：環(huán)糊精可降低IPTG誘導產(chǎn)生的細胞毒性作用。
[0014] 實施例2 以具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的單鏈抗體（ScFv)為例，構(gòu)建了大腸桿菌Rosetta 含有重組質(zhì)粒pPelB-ScFv的原核可溶性表達系統(tǒng)，表達蛋白時菌體濃度0D_ = 0. 6,誘導 劑IPTG濃度1.0 mM，誘導時間為5 h，結(jié)果在1 L培養(yǎng)液中菌體的濕重為1.7 g，菌體裂解 液上清中總蛋白量為57 mg，單鏈抗體在裂解液上清液中所占的比例是10%;在上述條件完 全相同的情況下，加入1.0%β-環(huán)糊精，結(jié)果是1 L培養(yǎng)液中菌體的濕重為3.3 g，菌體裂解 液上清中總蛋白量為120 mg，單鏈抗體在裂解液上清液中所占的比例是22%。
[0015] 結(jié)論：通過加入環(huán)糊精，降低了 IPTG誘導引起的細胞毒性，維持了細胞的生產(chǎn)，并 促進了蛋白的表達。
[0016] 實施例3 乙醇脫氫酶Il(adhll)原核可溶性表達時，選擇pET-32a(+)表達載體，構(gòu)建了重組質(zhì) 粒pET-adhll，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到BL21-adhII基因工程菌，培養(yǎng)細菌至菌體濃 度0D_ = 0.6,誘導劑IPTG濃度0.5 mM，誘導時間為5 h，結(jié)果在1 L培養(yǎng)液中菌體的濕重 為2.0 g，菌體裂解液上清中總蛋白量為69 mg，單鏈抗體在裂解液上清液中所占的比例是 12%，；在上述條件完全相同的情況下，加入0.5%β-環(huán)糊精，結(jié)果是1 L培養(yǎng)液中菌體的 濕重為3. 9g，菌體裂解液上清中總蛋白量為150 mg，單鏈抗體在裂解液上清液中所占的比 例是31%。
[0017] 結(jié)論：通過加入環(huán)糊精，降低了 IPTG誘導引起的細胞毒性，維持了細胞的生產(chǎn)，并 促進了蛋白的表達。
【權(quán)利要求】
1.環(huán)糊精在原核可溶性表達系統(tǒng)中降低細胞毒性的用途。
【文檔編號】C12N9/22GK104140960SQ201410363908
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】林鳳, 李博超, 邱芳萍 申請人:吉林大學