集成微流控芯片及其用于三維腫瘤定位、構建、回收方法
【專利摘要】本發明公開了一種集成微流控芯片及其用于三維腫瘤定位、構建、回收方法。所公開的芯片由樣品流動層和氣動控制層組成，樣品流動層設有入口、微腔、出口和微管道網絡，氣動控制層設有進氣入口、氣動控制結構和末端封閉的微管道網絡。氣動控制結構由末端封閉的微管道網絡與進氣口相連接。氣動控制結構的高度大于末端封閉的微管道網絡的高度。本發明可以在單個微流控芯片內連續完成腫瘤細胞的精確定位捕獲、三維腫瘤形成與在線分析及其回收操作。該操作具有極強的時間與空間控制性及靈活性，便于多學科研究學者掌握；同時具有操作簡單快捷、樣品低消耗、細胞定位精確與高效高通量等特點，適用于多種三維腫瘤構建與分析操作。
【專利說明】集成微流控芯片及其用于三維腫瘤定位、構建、回收方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及微流控芯片【技術領域】，尤其涉及一種集成微流控芯片及其用于實時控制性的高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤組織構建與回收。

【背景技術】
[0002]癌癥是由于細胞的分裂失控和異常生長而引起的疾病，常伴隨著惡性腫瘤的形成，進而導致人類和動物疾病并最終造成死亡。廣泛開展腫瘤研究是探索癌癥作用機理與推動臨床治療進展的源動力。目前，常規的動物體內實驗研究方法能夠高度還原特定腫瘤的發生發展過程，但在動態檢測，微環境控制以及腫瘤組織實時操作分析方面缺乏足夠的優勢。相比較，常規體外腫瘤細胞培養法在很多方面能夠彌補這些欠缺，如腫瘤細胞直接操作、細胞監測分析等。體外細胞培養主要包括二維培養和三維培養。其中三維腫瘤培養因具有更好的體內腫瘤生物學特性仿生能力，近年來受到國內外研究人員的認可和關注。迄今為止，體外制備三維腫瘤組織的方法眾多，包括懸滴法，瓊脂糖表面培養法和旋轉培養法等。這些方法對于體外腫瘤仿生研究具有較強的推動作用，但由于這些細胞操作方法仍處于宏觀界面操作水平，很難完成微觀尺度下的一些操作。同時，其制備方法操作較為繁瑣、且需要較多的人力，所制備的三維腫瘤均一度較低。這在很大程度上限制了基于三維腫瘤的后期試驗的研究進度及其研究結果的精準性。因此，大力開發、開展微觀界面條件下的腫瘤細胞操作與三維腫瘤仿生構建，對于更有效地進行腫瘤研究、早日突破腫瘤治療難題是具有重大科學意義和社會意義的。
[0003]微流控芯片，作為本世紀極具代表性的一種微型操作與分析平臺，在細胞研究微型化的發展道路上扮演著非常重要的角色。微流控芯片的顯著特征在于它的微型化，即微米級的芯片單元、微米級尺度下的細胞操作分析、生物樣本的微納升甚至皮升級操作處理與檢測分析水平。目前，基于微流控芯片的腫瘤細胞操作多為被動式操作，在很大程度上缺乏細胞操作靈活性與時空控制能力。已開發的芯片微功能單元，如微篩、微孔，盡管能夠完成腫瘤細胞的原位捕獲，但由于其結構固定，無法實現實時空間控制的腫瘤細胞定位、三維腫瘤構建與分析及其回收操作與后分析研究。此外，如果采用極端條件處理進行樣品回收，如使用極高流速液流，勢必會造成三維腫瘤結構的破壞以及腫瘤細胞在這些固定微功能單元位置的殘留，不利于三維腫瘤操作。因此，開發一種可控式高通量腫瘤細胞定位與三維腫瘤仿生構建芯片是十分有必要的。


【發明內容】

[0004]本發明目的在于，提供一種含有氣動控制結構的集成微流控芯片，并提供一種用于平行高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤仿生構建及其腫瘤回收的芯片操作方法。該芯片操作簡單、快捷，便于多學科研究學者掌握。
[0005]為實現上述目的，本發明采取以下的技術方案:
[0006]一種集成微流控芯片，該微流控芯片由樣品流動層和氣動控制層構成，所述樣品流動層設有入口、微腔、出口和微管道網絡，所述氣動控制層設有進氣入口、氣動控制結構和末端封閉的微管道網絡，所述氣動控制結構由末端封閉的微管道網絡與進氣口相連接，所述氣動控制結構的高度大于末端封閉的微管道網絡的高度。
[0007]優選的，氣動控制層高度與微管道網絡高度的比值大于等于2，且小于等于5。
[0008]所述微流控芯片樣品流動層設有I個入口、4_16個微腔、4-16個出口和一個對稱微管道網絡，每個微腔對應連接一個出口，并且微腔與出口之間通過對稱微管道網絡連接；所述氣動控制層設有I個進氣入口、144-1152個氣動控制結構和一個末端封閉的微管道網絡，所述氣動控制結構由末端封閉的微管道網絡與進氣口相連接；優選的，每36-72個氣動控制結構與樣品流動層的一個微腔自下而上重疊對應。
[0009]本發明提供的集成微流控芯片，所述芯片制備材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，與涂有PDMS聚合物的玻璃或透明塑料材料進行不可逆封接，從而確保所使用微流控芯片質量以及芯片內各個微功能單元的完整性。
[0010]優選的，本發明提供的集成微流控芯片，所述微流控芯片樣品流動層高度為100-500 μ m ;所述氣動控制結構高度為20-150 μ m，末端封閉的微管道網絡高度為10-30 μm。
[0011]相對于現有技術，本發明提供的集成微流控芯片，所述氣動控制層中的氣動控制結構高度大于微管道網絡高度。氣動控制結構與樣品流動層之間的PDMS膜厚度明顯小于氣動控制層微管道網絡與樣品流動層之間的PDMS膜厚度。當在外源氣壓為12_30psi作用下，氣動控制結構對應的PDMS膜形變明顯大于氣動控制層微管道網絡對應的PDMS膜形變，并能夠形成更高的三維結構。
[0012]氣動控制結構和微管道網絡的不同高度在于實現腫瘤細胞在氣動控制結構對應微腔位置的精確定位，并減少腫瘤細胞被微管道網絡攔截和在微腔其他位置的殘留。本發明的微流控芯片適用于所有動物正常細胞、胚胎、腫瘤細胞，及各種微米級顆粒材料的富集操作。
[0013]本發明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤仿生構建及其腫瘤回收，所述細胞樣品為哺乳動物腫瘤細胞及腫瘤細胞系。
[0014]本發明提供了一種基于集成微流控芯片的高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤仿生構建及其腫瘤回收的操作方法，具體步驟如下:
[0015]在流速范圍為5-20 μ L/min條件下，將含抗細胞黏附物的溶液由樣品流動層入口，通過對稱微管道網絡，灌注進入微腔內，對微腔進行抗細胞黏附修飾；
[0016]然后灌注新鮮細胞培養液，清洗微腔；
[0017]灌注細胞密度為I X 15-1 X 17個/mL的腫瘤細胞懸液，細胞進入微腔內；
[0018]然后通過氣動控制層的進氣入口對氣動控制結構進行一定外源氣壓作用12-30psi，使其由二維結構轉變為三維結構，所形成的三維結構可完成對腫瘤細胞的攔截定位捕獲；
[0019]當細胞定位操作完成后，灌注新鮮細胞培養液，進行3-20天的細胞培養，腫瘤細胞自聚集形成三維腫瘤組織，進而開展微流控芯片內的三維腫瘤在線分析；
[0020]當需要回收三維腫瘤組織時，可以隨時撤銷施加于氣動控制結構的外源氣壓，使其還原為二維結構，腫瘤組織隨液流離開氣動控制結構對應的微腔內捕獲位點，并到達樣品流動層出口。
[0021]本發明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤仿生構建及其腫瘤回收過程中，使用含抗細胞黏附物的溶液對樣品流動層微腔進行抗細胞黏附修飾，所述抗細胞黏附物為牛血清白蛋白、聚乙二醇及其它已知的抗細胞黏附蛋白或抗細胞黏附聚合物。
[0022]相對于現有技術，本發明的集成微流控芯片的有益效果在于:可以在單個微流控芯片內連續完成腫瘤細胞的定位捕獲、三維腫瘤仿生構建與分析及其回收操作。相對于以往微流控芯片內腫瘤細胞操作及三維腫瘤構建方法，其具有更好的時間與空間控制性及靈活性，同時具有操作簡單快捷、樣品低消耗、細胞定位精確與高效高通量等特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1本發明微流控芯片的樣品流動層和氣動控制層平面結構參考示意圖，其中I為流動層進樣入口，2和3為流動層管道出口，4為氣動控制層中進氣入口。
[0024]圖2為樣品流動層單個微腔和氣動控制層單組氣動控制結構陣列單元參考示意圖，其中21為腫瘤細胞和液流入口，22為腫瘤細胞和液流出口，23為氣動控制層中氣動控制結構的進氣入口，24為氣動控制層的氣動控制結構，25為氣動控制層中微管道網絡，26為樣品流動層微腔內的微柱子。
[0025]圖3為施加一定外源氣壓條件下的氣動控制結構參考示意圖，其中31為氣動控制結構的二維狀態，32為氣動控制層的微管道網絡。
[0026]圖4為施加一定外源氣壓情況下的氣動控制結構參考不意圖,其中41為氣動控制結構的三維狀態，42為氣動控制層的微管道網絡，43為施加外源氣壓的進氣入口。
[0027]圖5為本發明微流控芯片內腫瘤細胞進樣參考示意圖，其中51為細胞進樣入口，52為細胞進樣出口，53為單個腫瘤細胞，54為二維狀態的氣動控制結構，55為氣動控制層的微管道網絡。
[0028]圖6為本發明微流控芯片內細胞定位捕獲參考示意圖，其中61為三維狀態的氣動控制結構，62為已捕獲的腫瘤細胞群，63為施加外源氣壓的進氣入口。
[0029]圖7為本發明微流控芯片微腔內新鮮細胞培養基灌注參考示意圖，其中71為細胞懸液中的腫瘤細胞。
[0030]圖8為本發明微流控芯片內三維腫瘤自聚集形成參考示意圖，其中81為單個三維腫瘤。
[0031]圖9為實施例2微流控芯片內氣動控制結構捕獲細胞形成的三維腫瘤熒光標記圖。
[0032]圖10為微流控芯片內三維腫瘤回收示意圖，其中101為即將離開微腔的單個三維腫瘤。

【具體實施方式】
[0033]本發明的氣動控制結構具有兩種空間結構狀態:包括二維靜息狀態和三維激發狀態。當在大氣壓下，氣動控制結構為二維結構；當在一定外源氣壓作用下，氣動控制結構與樣品流動層之間的PDMS膜發生形變，氣動控制結構受激發而形成三維結構。其中，三維氣動控制結構在于對腫瘤細胞的定位、三維腫瘤組織構建控制性操作。二維氣動控制結構在于對所仿生構建的腫瘤組織的回收操作。
[0034]本發明的集成微流控芯片的制備材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，與涂有PDMS聚合物的玻璃或透明塑料材料進行不可逆封接，從而確保所使用微流控芯片質量以及芯片內各個微功能單元的完整性。
[0035]本發明所述的高度均指工作腔內的高度。
[0036]本發明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤仿生構建及其腫瘤回收，所述細胞樣品為哺乳動物腫瘤細胞及腫瘤細胞系。
[0037]本發明提供了一種基于集成微流控芯片的高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤仿生構建及其腫瘤回收的操作方法，具體步驟如下:在流速范圍為5-20 μ L/min條件下，將含抗細胞黏附物的溶液由樣品流動層入口，通過對稱微管道網絡，灌注進入微腔內，對微腔進行抗細胞黏附修飾；然后灌注新鮮細胞培養液，清洗微腔；灌注細胞密度為I X 15-1 X 17個/mL的腫瘤細胞懸液，細胞進入微腔內；然后通過氣動控制層的進氣入口對氣動控制結構進行一定外源氣壓作用12_30psi，使其由二維結構轉變為三維結構，所形成的三維結構可完成對腫瘤細胞的攔截定位捕獲；
[0038]當細胞定位操作完成后，灌注新鮮細胞培養液，進行3-20天的細胞培養，腫瘤細胞自聚集形成三維腫瘤組織，進而開展微流控芯片內的三維腫瘤在線分析；
[0039]當需要回收三維腫瘤組織時，可以隨時撤銷施加于氣動控制結構的外源氣壓，使其還原為二維結構，腫瘤組織隨液流離開氣動控制結構對應的微腔內捕獲位點，并到達樣品流動層出口。
[0040]本發明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤仿生構建及其腫瘤回收過程中，使用含抗細胞黏附物的溶液對樣品流動層微腔進行抗細胞黏附修飾，抗細胞黏附物為牛血清白蛋白、聚乙二醇及其它已知的抗細胞黏附蛋白或抗細胞黏附聚合物。
[0041]以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細描述。應當理解，優選實施例僅為了說明本發明，而不是為了限制本發明的保護范圍。
[0042]實施例1:
[0043]本實施例所使用的集成微流控芯片為 申請人:的實驗室設計并制備。制備集成微流控芯片所使用的材料為PDMS聚合物，不可逆封接于涂有PDMS薄膜的玻璃表面。
[0044]本實施例所使用的集成微流控芯片由樣品流動層和氣動控制層構成。
[0045]如圖1所示，樣品流動層包含I個入口⑴、8個微腔、8個出口(2和3)和I個對稱微管道網絡。每個微腔對應連接I個出口(2和3)，8個微腔呈對稱分布，并由對稱微管道網絡與入口(I)連接。
[0046]氣動控制層包含I個進氣入口(4)、360個氣動控制結構和I個末端封閉的微管道網絡。樣品流動層高度為100 μ m，氣動控制結構高度為30 μ m，微管道網絡高度為15 μ m，其高度比值為2。氣動控制結構由微管道網絡與進氣口相連接。
[0047]本實施例所使用集成微流控芯片的氣動控制層單組氣動控制結構陣列與樣品流動層單個微腔自下而上重疊對應，每組陣列由45個氣動控制結構組成(如圖2所示)。該微流控芯片樣品流動層共包含了 8個微腔(圖1所示)，分別對應于氣動控制層的8組氣動控制結構陣列。
[0048]本實施例所使用集成微流控芯片可同時實現360個平行的腫瘤細胞精確定位操作。
[0049]當未施加壓力(Opsi，即大氣壓下)時，氣動控制結構呈二維形態(如圖3所示)；當施加一定外源氣壓(12-30psi)時，氣動控制結構呈三維空間形態(如圖4所示)，可以完成對腫瘤細胞的主動機械式攔截定位捕獲操作。
[0050]在外源氣壓作用下，氣動控制層的氣動控制結構高度為100 μ m，微管道網絡高度為25 μ m，其高度比值增大為4。
[0051]氣動控制結構和微管道網絡的不同高度不僅實現腫瘤細胞在氣動控制結構對應微腔位置的精確定位，同時也減少腫瘤細胞被微管道網絡攔截和在微腔其他位置的殘留。
[0052]實施例2:
[0053]該實施例為實施例1提供的微流控芯片的高通量H印G2肝癌細胞定位捕獲與三維腫瘤構建:
[0054]首先對實施例1所述微流控芯片進行抗細胞黏附修飾，即通過微量注射泵將濃度為2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液以5 μ L/min的流量由芯片流動層入口⑴導入，BSA經對稱微管道進入微腔內；室溫孵育2小時；然后用新鮮DMEM細胞培養液灌注清洗；
[0055]對實施例1所述微流控芯片進行細胞灌注，即將細胞密度為I X 15個/mL的肝癌細胞懸液以5 μ L/min的流量由芯片流動層入口(I)導入，細胞經對稱微管道進入細胞微腔內(圖5所示);
[0056]給予氣動控制結構一定氣壓(12psi)，使其呈現為三維空間形態(如圖4所示)，從而捕獲肝癌細胞(如圖6所示)，一定數量的細胞群被定位于氣動控制結構對應的流動層微腔位置(62)；
[0057]進一步灌注不含腫瘤細胞的新鮮DMEM細胞培養液，清洗掉微腔內的殘留細胞懸液(如圖7所示)；
[0058]將該芯片放置于37°C、5% CO2飽和濕度條件下連續培養7天，使肝癌細胞自聚集形成三維腫瘤組織(如圖8所示)；然后進行選擇性熒光標記檢測分析(如圖9所示)。
[0059]實施例3:
[0060]該實施例為實施例1提供的微流控芯片的高通量MCF-7乳腺癌細胞定位捕獲與三維腫瘤構建。
[0061]首先對實施例1所述微流控芯片進行抗細胞黏附修飾，即通過微量注射泵將濃度為lmg/mL的脫脂奶粉溶液以5 μ L/min的流量由芯片流動層入口⑴導入，脫脂奶粉溶液經對稱微管道進入微腔內；室溫孵育2小時；然后用新鮮DMEM細胞培養液灌注清洗；
[0062]首先對實施例1的微流控芯片進行細胞灌注，即通過微量注射泵將細胞密度為I X 17個/mL的乳腺癌細胞懸液以15 μ L/min的流量由芯片流動層入口⑴導入，細胞經對稱微管道進入細胞微腔內(參考圖5所示)；
[0063]給予氣動控制結構一定氣壓(30psi)，使其呈現為三維空間形態，從而捕獲乳腺癌細胞(參考圖6所示)，一定數量的細胞群被定位于氣動控制結構對應的流動層微腔位置
(62)；
[0064] 進一步灌注不含腫瘤細胞的新鮮DMEM細胞培養液，清洗掉微腔內的殘留細胞懸液(參考圖7所示)；
[0065]將該芯片放置于37°C、5% CO2飽和濕度條件下連續培養15天，使乳腺癌細胞自聚集形成三維腫瘤組織；然后進行乳腺癌相關藥物篩選分析。
[0066]實施例4:
[0067]該實施例為提供實施例2所述微流控芯片內的三維腫瘤組織回收。根據特定需求，準備對微流控芯片內三維腫瘤進行回收時，可任意選擇特定的時間點撤銷作用于氣動控制結構的外源氣壓，使其降至Opsi，氣動控制結構還原為二維形態。芯片樣品流動層微腔內三維腫瘤被釋放，并隨液流排出，進入芯片流動層出口(如圖10所示)，從而實現三維腫瘤組織的回收。
【權利要求】
1.一種集成微流控芯片，該集成微流控芯片包括樣品流動層和氣動控制層組成，所述樣品流動層設有入口、微腔、出口和微管道網絡，所述氣動控制層設有進氣入口、氣動控制結構和末端封閉的微管道網絡，所述氣動控制結構由末端封閉的微管道網絡與進氣口相連接，其特征在于:所述氣動控制結構的高度大于末端封閉的微管道網絡的高度。
2.如權利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述氣動控制結構的高度與末端封閉的微管道網絡的高度比值大于等于2，且小于等于5。
3.如照權利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片的制備材料為聚二甲基硅氧烷。
4.按照權利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片樣品流動層設有I個入口、4-16個微腔、4-16個出口和I個對稱微管道網絡，每個微腔對應連接一個出口，并且微腔與出口之間通過對稱微管道網絡連接；所述芯片氣動控制層設有I個進氣入口、144-1152個氣動控制結構和一個末端封閉的微管道網絡，氣動控制結構由末端封閉的微管道網絡與進氣口相連接；每36-72個氣動控制結構與一個微腔自下而上重疊對應。
5.按照權利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述樣品流動層高度為100-500 μ m;所述氣動控制結構的高度為20-150 μ m，所述末端封閉的微管道網絡高度為10-30 μ mD
6.如權利要求1所述的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤組織構建及回收，其特征在于:所述細胞樣品為哺乳動物腫瘤細胞及腫瘤細胞系。
7.如權利要求6所述的高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤組織構建及其回收，其特征在于:包括: 在流速范圍為5-20 μ L/min條件下，將含抗細胞黏附物的溶液由樣品流動層入口，通過對稱微管道網絡，灌注進入微腔內，對微腔進行抗細胞黏附修飾； 然后灌注新鮮腫瘤細胞培養液，清洗微腔； 灌注細胞密度為I X 15-1 X 17個/mL的腫瘤細胞懸液，細胞進入微腔內; 然后通過氣動控制層的進氣入口對氣動控制結構進行12-30psi外源氣壓作用，使其由二維結構轉變為三維結構，所形成的三維結構可完成對腫瘤細胞的攔截定位捕獲； 當細胞定位操作完成后，灌注新鮮腫瘤細胞培養液，進行3-20天的細胞培養，腫瘤細胞自聚集形成三維腫瘤組織； 當需要回收三維腫瘤組織時，可以隨時撤銷施加于氣動控制結構的外源氣壓，使其還原為二維結構，腫瘤組織隨液流離開氣動控制結構對應的微腔內捕獲位點，并到達樣品流動層出口。
8.按照權利要求7所述的高通量腫瘤細胞定位、三維腫瘤組織構建及其回收，其特征在于:所述抗細胞黏附物為牛血清白蛋白或聚乙二醇。
【文檔編號】C12M1/04GK104164360SQ201410366445
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】劉文明, 王進義, 王建春, 許娟, 李天保, 涂琴, 王垚磊 申請人:西北農林科技大學