斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白h基因序列及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白H基因序列及其制備方法和用途，旨在提供斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白H基因序列，可以作為設計抗腫瘤藥物的靶位點或者調節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程，有利于人工繁殖斑節(jié)對蝦細胞；該H基因序列的核苷酸如SEQ?ID?NO：1所示；制備方法是通過提取斑節(jié)對蝦總RNA來cDNA第一鏈的合成，再以合成的第一鏈cDNA作為模板，利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-F1、cycH-F2對目的基因的3ˊ末端進行兩次PCR擴增；然后對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白H基因的測定，最后進行對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白H基因分布和表達測定；屬于分子生物學中基因克隆領域。
【專利說明】斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列及其制備方法和用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細胞周期蛋白Η基因序列，具體地說，是涉及一種斑節(jié)對蝦細胞 周期蛋白Η基因序列，本發(fā)明還涉及該斑斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，屬 于分子生物學中基因克隆領域。

【背景技術】
[0002] 細胞周期調控是一個精確調控的過程。在細胞分裂過程中真核生物的細胞周期可 以概括為兩個大的階段：細胞分裂間期（即G1時期、S時期和G2時期）和細胞分裂期（即 Μ時期），在細胞分裂時期，需要許多周期蛋白參與調控以保證其精確性。
[0003] 周期蛋白Η基因做為CAK的重要組成部分，從酵母到人類具有高度的保守型。CAK 的激活需要周期蛋白Η基因與CDK7及ΜΑΤΙ結合，通過對CAK的磷酸化來實現其激酶活性。 周期蛋白Η基因也參與通用轉錄復合物TFIIH的構成。TFIIH是一個多蛋白復合物，在轉 錄、DNA修復及細胞周期調控中起重要作用。與其他周期蛋白相比周期蛋白Η基因在整個 細胞周期中表達量穩(wěn)定，所有周期時相均有表達。另有證據表明CDK2、CDK4及CDK6等的磷 酸化都與周期蛋白Η基因密切相關，周期蛋白Η基因通過對這些底物的磷酸化從而實現對 細胞周期的準確調控，進而可以實現對卵巢發(fā)育的調控。
[0004] 長期以來，斑節(jié)對蝦的人工繁育問題一直都是限制斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖產業(yè)發(fā)展的技術 瓶頸。在實際生產過程中，親蝦的性腺成熟參差不齊，難以集中育苗的問題是對蝦養(yǎng)殖過程 中一個非常重要的限制因素。眼柄切除手術作為促進親蝦性腺同步成熟的常用方法，對親 蝦本身存在非常大破壞性，不利于可持續(xù)養(yǎng)殖，加大了養(yǎng)殖成本。因此出于尋求一種新的對 蝦繁育方法的需求，對對蝦卵巢發(fā)育機理及其分子調控機理進行研究勢在必行。


【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述問題，本發(fā)明的以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎設計的PCR 擴增引物，并通過RACE技術克隆到斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的全表達序列，有利于人 工催熟斑節(jié)對蝦。
[0006] 為解決前一技術問題，本發(fā)明提供的第一個技術方案是這樣的：該斑節(jié)對蝦細胞 周期蛋白Η基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0 :1所示。
[0007] 本發(fā)明提供的后一技術方案是這樣的：該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制 備方法，依次包括下述方法 ：
[0008] 1)總RNA的提取
[0009] 對斑節(jié)對蝦解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃組織，并分別將 各組織溶于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存；
[0010] 2)cDNA第一鏈的合成
[0011] 將步驟1)中的斑節(jié)對奸總RNA與反轉錄引物混合，在反轉錄酶的作用下合成cDNA 第一鏈；
[0012] 3)斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的PCR擴增、克隆
[0013] 以步驟2)合成的第一鏈cDNA作為模板利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-Fl、 cycH-F2對目的基因的：Τ末端進行兩次PCR擴增得PCR產物；
[0014] 4)對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的測定
[0015] 對步驟3)所得到的PCR產物分離檢測、純化后，再將PCR產物克隆到pMD-18T載 體中，轉化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序；
[0016] 5)斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的分布和表達
[0017] a)提取斑節(jié)對蝦不同組織以及不同發(fā)育時期的卵巢的總RNA，按照 PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊進行反轉錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA 稀釋作為模板，采用SYBR Green I染料法，在Eppendorf?熒光定量PCR儀上進行擴增和數 據分析；
[0018] b)依照 TaKaRa SYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit 試劑盒說明書進行 PCR 反應， 實驗數據采用相對Λστ法分析斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因在各樣品中的相對表達量。
[0019] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟2)所述的 反轉錄引物反轉錄引物為：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3。
[0020] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于，步 驟2)所述的反轉錄酶為M-MLV。
[0021] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟2)所述的 反應條件：42°C 60min，70°C 15min。
[0022] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟3)所述的 接頭引物為：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
[0023] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟3)所述的
[0024] cycH-Fl ：5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG<3 ；
[0025] cycH-F2 :5>AACCTCCTGCCTCGGACACT〈3。
[0026] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟3)中兩次 擴增的所述反應條件均為：94°C，5min ;94°C，30s ;55°C，45s，35cycles ;72°C，60s ;72°C， 10min〇
[0027] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟b)中PCR 反應使用引物步驟b)中PCR反應使用引物為：
[0028] RTCYCH-F ：5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3 ；
[0029] RTCYCH-R :5>GCTTCCCCAATGCAGGAA〈3。
[0030] 該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列作為設計抗腫瘤藥物的靶位點或者調節(jié)斑 節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過。
[0031] 與現有技術相比，本發(fā)明提供的技術方案具有如下優(yōu)點：
[0032] 1、本發(fā)明提供的技術方案是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎設計的 PCR擴增引物，并通過RACE技術克隆到斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的全表達序列；此外 通過斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因設計熒光定量PCR引物，對周期蛋白Η基因在斑節(jié)對蝦 卵巢各個發(fā)育時相的分布情況及在不同組織中的分布情況進行研究分析，更好的了解生物 體細胞中的信號通路的機制。不僅為研究斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因在卵巢發(fā)育中的作 用奠定基礎，而且可以為斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖過程中所出現的性腺發(fā)育參差不齊的情況從分子層 面提供理論基礎；有利于人工繁育斑節(jié)對蝦，并且減小了養(yǎng)殖成本。
[0033] 2、本發(fā)明提供的細胞周期蛋白Η作為細胞周期調控中一個重要的蛋白，在細胞分 裂、細胞周期調控、腫瘤發(fā)生、DNA的轉錄修復等方面起重要作用，也是對相關方向進行研究 的一個重要突破點，可以用來作為抗腫瘤藥物設計的靶位點，在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中 起重要作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1是斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因 mRNA組織表達模式；
[0035] 其中：垂直線表示平均值土標準誤差（重重復樣品數=4)，不同的字母表示存在 顯著性差異（P〈〇. 05)。
[0036] 圖2是斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因 mRNA卵巢發(fā)育六期表達模式；
[0037] 其中：垂直線表示平均值土標準誤差（重重復樣品數=4)。不同的字母表示存 在顯著性差異（P〈〇. 05)。

【具體實施方式】
[0038] 為了更好的理解、實施本發(fā)明的權利要求，下面結合具體實施例，對本發(fā)明的權利 要求做進一步的詳細說明，但本發(fā)明并不限于下述實施例，而是以權利要求為限。
[0039] 1、總RNA的提取
[0040] 試驗所用的雌雄斑節(jié)對蝦（鮮重200g左右）均取自于海南三亞，室內水族箱內暫 養(yǎng)三天，水溫控制在24?25°C之間。解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃等組 織，并分別將組織于lmL Trizol(Invitrogen，日本）中勻楽，按Trizol試劑盒使用手冊提 取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于-80°C保存。
[0041] 1、總RNA具體提取步驟：
[0042] (1)加 200 μ L 預冷氯仿，渦旋振蕩 lmin 混勻，靜置 5min，12000g，4°C，15min。
[0043] (2)取三分之一上清溶液，加入等體積的預冷的異丙醇，顛倒混勻，冰上放置 lOmin，12000g，4°C，lOmin。
[0044] (3)倒掉上清，加 lmL75%乙醇重懸沉淀，7500g，4°C離心5min。
[0045] (4)重復步驟3 -次，并用槍頭吸出上清，干燥5?lOmin
[0046] (5)加 40 μ LddH20 溶解沉淀
[0047] (6) RNA的電泳檢測：將電泳槽、梳齒等置于3% H202過夜浸泡，配置1. 5%的瓊脂 糖凝膠（用〇. 5 X TBE溶液配制），取5 μ L總RNA加1 μ L上樣緩沖液，進行30min電泳檢 測，對提取的RNA質量進行測定。
[0048] 2、cDNA第一鏈的合成
[0049] 取步驟1中斑節(jié)對蝦總RNA與反轉錄引物（5>GGCCACGCGACTAGTAC (T) 16〈3) (10pmol/L)混合在反轉錄酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA-鏈，
[0050] cDNA的反轉錄實驗按照相關試劑盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa))操作方法進行。
[0051]

【權利要求】
1. 一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 制備權利要求1所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的方法，其特征在于，依次 包括下述方法： 1) 總RNA的提取 對斑節(jié)對蝦解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃組織，并分別將各組 織溶于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存； 2. cDNA第一鏈的合成 將步驟1)中的斑節(jié)對奸總RNA與反轉錄引物混合，在反轉錄酶的作用下合成cDNA第 一鏈； 3) 斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的PCR擴增、克隆 以步驟2)合成的第一鏈cDNA作為模板利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-F 1、 cycH-F2對目的基因的：Τ末端進行兩次PCR擴增得PCR產物； 4) 對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的測定 對步驟3)所得到的PCR產物分離檢測、純化后，再將PCR產物克隆到pMD-18T載體中， 轉化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序； 5) 斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因的分布和表達 a) 提取斑節(jié)對奸不同組織以及不同發(fā)育時期的卵巢的總RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊進行反轉錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA稀釋作為模板，采用 SYBR Green I染料法，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析； b) 依照TaKaRaSYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit試劑盒說明書進行PCR反應，實驗 數據采用相對△CT法分析斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因在各樣品中的相對表達量。
3. 根據權利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反轉錄引物為：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16〈3。
4. 根據權利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反轉錄酶為M-MLV。
5. 根據權利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反應條件：42°C 60min，70°C 15min。
6. 根據權利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟3)所述的接頭引物為：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
7. 根據權利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟 3)所述的 cycH-Fl 為：5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG〈3 ; cycH-F2 為：5>AACCTCCTGCCTCGGACACT〈3。
8. 根據權利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在 于，步驟3)中兩次擴增所述的反應條件均為：94°C，5min ;94°C，30s ;55°C，45s，35cycles ; 72°C，60s ;72°C，lOmin。
9. 根據權利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟b)中PCR反應使用引物為： RTCYCH-F ：5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3 ； RTCYCH-R : 5>GCTTCCCCAATGCAGGAA〈3。
10.權利要求1所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白Η基因序列作為設計抗腫瘤藥物的靶位 點或者調節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程。
【文檔編號】C12N15/70GK104099339SQ201410366921
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權日:2014年5月20日
【發(fā)明者】趙超, 邱麗華, 江世貴, 周發(fā)林, 傅明駿 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所