一種洪湖碘泡蟲特異性pcr檢測引物及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于洪湖碘泡蟲的PCR檢測引物，屬于生物檢測【技術領域】。該洪湖碘泡蟲PCR檢測引物包括正向和反向引物：正向引物F：5’–TCGCTCAGGGTGTAATG–3’和反向引物R：5’–ATGAGGCAGCGTAAAGG–3’。其通過洪湖碘泡蟲基因組DNA的提取、洪湖碘泡蟲的特異性引物設計、PCR反應和電泳檢測得到結果。本發明的PCR檢測引物具有特異性強、靈敏度高、耗時短的優點。該引物可以應用于普通PCR和熒光定量PCR檢測中，在洪湖碘泡蟲的病原種類鑒定、監測、疾病檢疫方面具有一定的應用前景。
【專利說明】—種洪湖碘泡蟲特異性PCR檢測引物及其檢測方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于檢測的引物及其檢測方法，具體涉及一種用于檢測洪湖碘泡蟲的PCR檢測引物及其檢測方法，屬于生物檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002]洪湖碘泡蟲iMyxobolus honghuensis)是一種微小的,營寄生生活的后生動物,隸屬于粘孢子動物門雙殼目。它主要感染水體底棲的寡毛類動物和淡水鯽魚，導致養殖及野生的鯽魚發生“喉孢子蟲病”。喉孢子蟲病是鯽魚養殖中非常重要的一種寄生蟲疾病，每都造成大量的死亡，給鯽魚養殖產業帶來極大的經濟損失。被感染的鯽魚在發病初期眼球突出，咽喉部充血發炎；隨著病情的發展，洪湖碘泡蟲的孢子不斷無性繁殖，形成無數白色孢囊，最終撐破鯽魚喉咽腔上壁，孢子流出病灶，進入水體。巨大的孢囊阻礙病魚攝食和鰓部的呼吸功能，導致病魚大量死亡。從3_4cm的鯽魚幼魚到成魚都有該病的發生。對該病的診斷主要根據發病魚病灶組織顯微鏡鏡檢是否有洪湖碘泡蟲的孢子。然而，當病魚喉部出現明顯病癥，鏡檢出現孢子時已處于發病后期，此時藥物完全無法治療該疾病。在病原潛伏和發病的早期，洪湖碘泡蟲的很難用常規的鏡檢方法檢測出來。為了預防該疾病發生，出現了在不清楚是否感染有洪湖碘泡蟲的情況下盲目的濫用藥物。粘孢子蟲的孢子通常僅有5-20Mm大小，很容污染水、泥土、工具等，造成廣發傳播。因此，實際生產中迫切需要一種特異性強、靈敏度高、快速的檢測手段。
[0003]通過對現有資料文獻檢索發現，尚未有與本發明的洪湖碘泡蟲特異性PCR檢測方法及核酸引物相關的報道。PCR技術具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強等特點，已廣發應用于各領域病原生物的快速檢測。本發明根據洪湖碘泡蟲檢測靶點設計特異性引物并與PCR技術相結合，建立特異性強、靈敏度高、耗時短的檢測方法。該方法在洪湖碘泡蟲的病原種類鑒定、監測、疾病檢疫方面具有一定的應用前景。


【發明內容】

[0004]本發明的目的在于克服現有技術不足，提供一種洪湖碘泡蟲特異性PCR檢測引物。該引物可用于洪湖碘泡蟲的普通PCR檢測和熒光定量PCR檢測，具有檢測結果特異性強、靈敏度高，實用性強。
[0005]按照本發明提供的技術方案，一種洪湖碘泡蟲特異性PCR檢測引物，包括正向引物和反向引物；正向引物F:5’ -TCGCTCAGGGTGTAATG-3’ ；反向引物R:5， -ATGAGGCAGCGTAAAGG-3，。
[0006]所述洪湖碘泡蟲特異性PCR檢測引物的檢測方法，步驟為:以18S rDNA序列為靶基因，通過PCR方法，以待檢樣品DNA為模板，以權力要求I中核苷酸序列為引物擴增靶基因，檢測是否存在擴增產物，有則表明檢測結果為陽性；
具體步驟為:
(I)洪湖碘泡蟲的DNA提取:采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取洪湖碘泡蟲的DNA，溶解在50 μL、ρΗ7.8的TE緩沖液中，置于_20°C保存備用；
(2)PCR 反應:
PCR檢測體系為25 μL的總量，具體包含:
10XPCR buffer(含 Mg2+)2.5 μ L,
2.5mmol/L 的 dNTP2.0 μ L,
rTaq 酶(5 U/μ L)0.2 μ L,
引物 F(10 μ mol/L)0.5-1 μ L,
引物 R (10 μ mol/L)0.5-1 μ L, 樣品 DNA1-3 μ L，
最后用滅菌雙蒸水補至25 UL0
[0007]PCR檢測反應程序為:94°C預變性3min ；30個循環，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s ;72°C延伸7min，最后降溫至4_12°C ；
(3)電泳檢測:取5-10μ L PCR檢測產物，以1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，電壓100-140V, TAE 電泳緩沖液中含 Tris 堿 0.04mol/L, EDTA 2mM/L。
[0008]本發明的有益效果:本發明能快速、靈敏、準確的檢測出洪湖碘泡蟲的感染，對藥物的預防以及苗種檢疫有重要的意義；熒光PCR檢測技術具有特異性好和靈敏度高等特點，使得粘孢子蟲的快速檢測成為可能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1洪湖碘泡蟲PCR引物的特異性檢測。
[0010]圖2洪湖碘泡蟲特異引物PCR檢測方法靈敏度試驗。
[0011]圖3洪湖碘泡蟲特異引物的熒光定量PCR檢測。

【具體實施方式】
[0012]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0013]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0014]本發明檢測系統中的特異性引物均通過核酸合成設備制備。核酸合成設備可委托相關基因公司合成。
[0015]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0016]實施例1洪湖碘泡蟲特異引物獲得
根據實驗室獲得的洪湖碘泡蟲18S rDNA序列(GenBank登錄號HM188545)和常見的塔形碘泡蟲、瓶囊碘泡蟲、吳李碘泡蟲、武漢單極蟲、卡特碘泡蟲、楚克拉蟲的基因序列比對分析，在洪湖碘泡蟲的物種特異性核苷酸序列區域運用Primer5.0中設計出一組特異性PCR引物。所述引物的核苷酸序列如下所示:
正向引物 F: 5 ’ - TCGCTCAGGGTGTAATG - 3 ’
反向引物 R: 5 ’ - ATGAGGCAGCGTAAAGG - 3 ’
實施例2洪湖碘泡蟲PCR引物的特異性檢測
1、洪湖碘泡蟲、塔形碘泡蟲、瓶囊碘泡蟲、吳李碘泡蟲、武漢單極蟲、卡特碘泡蟲、楚克拉蟲的基因組DNA提取:
粘孢子蟲DNA提取參照Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)的手冊指南進行(公眾可從上海生工獲取詳細資料)，溶解在50 μL TE緩沖液(ρΗ7.8)，置_20°C保存備用。
[0017]2、PCR反應體系和程序:
在 200 μ L 的反應管中加入 10 X PCR buffer (含 Mg2+) 2.5 μ L, dNTP2.5mmol/L2.0yL，rTaq 酶(5 U/yL)0.2yL，引物 F(10 μ mol/L) 0.5-1 μ L,引物 R (10 μ mol/L)0.5-1 μ L,每個管中分別加入洪湖碘泡蟲、塔形碘泡蟲、瓶囊碘泡蟲、吳李碘泡蟲、武漢單極蟲、卡特碘泡蟲、楚克拉蟲的基因組DNA模板1-3 μ L，最后用滅菌雙蒸水補至25 μ L。
[0018]PCR檢測反應程序為:94°C預變性3min ；30個循環，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s ;72°C延伸7min，最后降溫至4_12°C。
[0019]3、取1yL PCR檢測產物 ，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果圖1所示，圖中M是標準條帶DL2000，泳道1-7依次為洪湖碘泡蟲、塔形碘泡蟲、瓶囊碘泡蟲、吳李碘泡蟲、武漢單極蟲、卡特碘泡蟲、楚克拉蟲的擴增產物樣品，僅有洪湖碘泡蟲樣品在電泳泳道I出現80bp陽性條帶。
[0020]實施例3洪湖碘泡蟲特異引物PCR檢測方法靈敏度試驗
通過細胞計數和梯度稀釋制備104，103，12JO1,10° (個/μ L)的孢子懸液。在200 μ LPCR反應管中直接分別加入I μ L孢子液，設立2個空白對照管，再加入2 μ L裂解液(寶生物)，置80°C孵育15min，然后冰浴lOmin，低速離心。按實施例1中加入除DNA模板外的其他PCR反應試劑進行，PCR擴增產物凝膠電泳后在紫外燈下觀察拍照，如圖2所示。泳道1-7依次為14至空白樣品。孢子濃度14 -1O1都能檢測到清晰條帶。
[0021]實施例4洪湖碘泡蟲特異引物在熒光定量PCR中的檢測
以實施例3中不同梯度洪湖碘泡蟲DNA樣品為模板，在PCR管中加入實施例1中引物F和 R 各 0.8 μ L (20 pmol), SYBR Premix ExTaqII (寶生物)10 μ L, ROX Refrence Dye (寶生物)0.4 μ L，滅菌雙蒸水6 μ L，在熒光定量PCR儀(ABI 7500)中進行反應檢測。反應程序設置為50°C 2min ；95°C 5 min ；94°C 30s, 60°C 45s，進行40個循環；在601:收集熒光信號。圖3中，1-4依次為14, 13, 12, 11樣品，都能檢測到清晰擴增曲線。
【權利要求】
1.一種洪湖碘泡蟲特異性PCR檢測引物，其特征是:包括正向引物和反向引物；正向引物 F:5’ -TCGCTCAGGGTGTAATG-3’ ；反向引物 R:5’ -ATGAGGCAGCGTAAAGG-3’。
2.權利要求1所述洪湖碘泡蟲特異性PCR檢測引物的檢測方法，其特征是步驟為:以18S rDNA序列為靶基因，通過PCR方法，以待檢樣品DNA為模板，以權力要求I中核苷酸序列為引物擴增靶基因，檢測是否存在擴增產物，有則表明檢測結果為陽性； 具體步驟為: (1)洪湖碘泡蟲的DNA提取:采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取洪湖碘泡蟲的DNA，溶解在50 μL、ρΗ7.8的TE緩沖液中，置于_20°C保存備用； (2)PCR反應:在200yL的反應管中加入10XPCRbuffer，其中含Mg2+ 2.5 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP 2.0 μ L,5 U/μ L 的 rTaq 酶 0.2 μ L，10 μ mol/L 的正向引物 F0.5-1 μ L, 10 ymol/L 的引物 R 0.5-lyL; PCR檢測反應程序為:94°C預變性3min ；30個循環，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s ;72°C延伸7min，最后降溫至4-12°C ； (3)電泳檢測:取5-10μ L PCR檢測產物，以1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，電壓100-140V, TAE 電泳緩沖液中含 Tris 堿 0.04mol/L, EDTA 2mM/L。
【文檔編號】C12N15/11GK104164515SQ201410444476
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月2日 優先權日:2014年9月2日
【發明者】習丙文, 謝駿, 梁利國 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心