植物葉片總rna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種富含多糖多酚的植物葉片總RNA提取方法。植物材料經(jīng)液氮研磨后，經(jīng)連續(xù)兩次裂解，水飽和酚與氯仿混合溶液抽提，異丙醇沉淀得到總RNA。本發(fā)明的有益效果在于：1、連續(xù)兩次裂解，有效克服多糖、多酚、次生代謝物對(duì)RNA提取過(guò)程的影響，2、無(wú)需水浴，減少RNase污染，3、無(wú)需使用低溫離心機(jī)，操作方便，4、本方法有效避免傳統(tǒng)沉淀方法中LiCl殘留對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的影響，所提取的RNA可以滿足反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【專利說(shuō)明】植物葉片總RNA提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種富含多糖多酚的植物葉片總RNA提取的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]從植物組織中提取高質(zhì)量的總RNA對(duì)于基因克隆及其功能鑒定、基因的表達(dá)和調(diào)控分析、分子標(biāo)記輔助育種等具有重要意義[I]。
[0003]從植物組織中提取高質(zhì)量的總RNA存在困難。植物體內(nèi)富含多糖多酚，在RNA提取過(guò)程中，細(xì)胞破碎后多糖多酚物質(zhì)與RNA發(fā)生作用。酚類化合物極易被氧化，生成物(如醌類)能與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失，用苯酚、氯仿抽提時(shí)RNA丟失[2]，從而影響RNA的分離純化；多糖會(huì)形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來(lái)[3];多糖還可以抑制很多酶的活性，因此污染了多糖多酚的RNA無(wú)法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究；RNase會(huì)造成RNA的化學(xué)降解和酶解，RNA提取過(guò)程中污染的RNA酶有兩種來(lái)源:外源性RNA酶和內(nèi)源性RNA酶。外源性RNA酶來(lái)自RNA制備過(guò)程中使用的玻璃、塑料制品和試劑及操作人員本身等，而內(nèi)源性RNA酶是組織本身所固有的，當(dāng)細(xì)胞破碎后即釋放出來(lái)。因此，能否有效去除多糖、酚類化合物及去除或抑制RNA酶活性是提取高質(zhì)量RNA成敗的關(guān)鍵[4]。
[0004]現(xiàn)成的提取植物材料總RNA的方法對(duì)除多糖、酚類化合物及去除或抑制RNA酶活性等亟需改良。目前，常見(jiàn)植物材料總RNA的方法主要有SDS法、CTAB法、異硫氰酸胍法
[5]、熱硼酸法[6]、商業(yè)化試劑盒Trizol[7]等，但對(duì)于多糖、多酚、次生代謝物較多的植物組織RNA的提取效果并不理想，阻礙了其分子生物學(xué)方面研究的進(jìn)展[8]。我們迫切需要一種成本低廉，操作簡(jiǎn)單、方便，就能徹底除去材料中的蛋白質(zhì)、DNA、多糖、多酚等有機(jī)類物質(zhì)的提取方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有RNA提取方法對(duì)多糖、多酚、次生代謝物較多的植物組織RNA提取效果較差的缺陷，提供一種能徹底除去植物材料中蛋白質(zhì)、DNA、多糖、多酚、以及次生代謝產(chǎn)物等有機(jī)類物質(zhì)的總RNA提取方法。本方法所提取的RNA可滿足反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等研究的需要，同時(shí)大大降低實(shí)驗(yàn)的成本。
[0006]本發(fā)明為解決上述問(wèn)題，提供一種新的植物葉片總RNA提取方法，其包括以下步驟:
[0007](I)植物葉片在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)粉狀，快速轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞裂解液I的離心管中，混勻后加入鹽-醇溶液混勻后離心；
[0008](2)轉(zhuǎn)移上清液到含有細(xì)胞裂解液II的離心管中，混勻后加入鹽-醇溶液混勻后離心；
[0009](3)轉(zhuǎn)移上清液到新離心管中，經(jīng)等體積的水飽和酚與氯仿組成的混合試劑抽提后離心；
[0010](4)取上清液，加入異丙醇沉淀離心，加DEPC水(滅菌過(guò)的0.1%DEPC水簡(jiǎn)稱DEPC水))溶解總核酸，再用DNA酶I溶液消化DNA ；
[0011](5)經(jīng)等體積氯仿抽提離心；
[0012](6)轉(zhuǎn)上清液到新的離心管，加入異丙醇沉淀離心；
[0013](7)用醇洗滌，再經(jīng)空氣干燥后，溶解在DEPC水中低溫保存。
[0014]在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞裂解液I為含有2% -4% CTAB(每10ml蒸餾水中含2-4g CTAB)、2%-3% PVP(每 10ml 蒸餾水中含 2-3g PVP)、0.1-0.3mol/L Tris-Hcl 和25-50mmol/L EDTA的水溶液；所述細(xì)胞裂解液II為含有I % _3 % SDS、25_50mmol/L的EDTA、0.1-0.3mol/L Tris-Hcl和2% -3% PVP的水溶液，細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II都調(diào)至PH8.0。在一種實(shí)施方式中，pH用0.1M-1M NaOH調(diào)節(jié)。
[0015]在一種實(shí)施方式中，鹽-醇溶液為含有裂解液體積1/20-1/10的β -巰基乙醇、裂解液體積1/4-1/2的無(wú)水乙醇和裂解液體積1/4-1/2的3mol/L NaAc的水溶液。
[0016]在一種實(shí)施方式中，DNA酶I溶液濃度為0.1-0.5單位/μ 1，消化時(shí)間為10-60分鐘。
[0017]在一種實(shí)施方式中，在上述步驟(4)和(6)中異丙醇的體積為上清液體積的1/2-2/3。
[0018]在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II以500-800ul細(xì)胞裂解液/0.1-0.3g植物葉片的量加入。
[0019]在一種實(shí)施方式中，上述步驟(3)中水飽和酚與氯仿的體積比為1:1。
[0020]在一種實(shí)施方式中，步驟(7)中醇為75%乙醇。
[0021]在一種實(shí)施方式中，離心的轉(zhuǎn)速為5000-20000rpm，時(shí)間2-20分鐘。
[0022]本發(fā)明的有益效果在于:1、連續(xù)兩次裂解，有效克服多糖、多酚、次生代謝物對(duì)RNA提取過(guò)程的影響，2、無(wú)需水浴，減少RNase污染，3、無(wú)需使用低溫離心機(jī)，操作方便，4、本方法有效避免傳統(tǒng)沉淀方法中LiCl殘留對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的影響，所提取的RNA可以滿足反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是根據(jù)實(shí)施例1步驟提取的芍藥葉片總RNA的電泳結(jié)果圖。
[0024]圖2是根據(jù)實(shí)施例1步驟提取的芍藥葉片總RNA的反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果圖。
[0025]圖3是根據(jù)實(shí)施例2步驟提取的美國(guó)黃櫨RNA的電泳結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明但不用來(lái)限制本發(fā)明。
[0027]溶液及試劑準(zhǔn)備:
[0028](I)細(xì)胞裂解液I
[0029]2% CTAB (w/v)
[0030]3 % PVP (w/v)
[0031]0.lmol/L Tris-Hcl (ρΗ8.0)
[0032]25mmol/L EDTA(pH8.0)
[0033]pH 用 IM NaOH 調(diào)至 8.0
[0034](2)細(xì)胞裂解液II
[0035]2% SDS (w/v)
[0036]2 % PVP (w/v)
[0037]25mmol/L EDTA(pH8.0)
[0038]0.lmol/L Tris-Hcl (pH8.0)
[0039]pH 用 IM NaOH 調(diào)至 8.0
[0040](3) 3mol/L NaAc
[0041](4)水飽和酚:氯仿體積比為1:1
[0042](5) DNA酶I溶液濃度為0.5單位/ μ I
[0043](6)75%乙醇(現(xiàn)配)、異丙醇(分析純)、巰基乙醇(分析純)、氯仿(分析純)、無(wú)水乙醇(分析純)、液氮和滅菌過(guò)的0.1 % DEPC水(簡(jiǎn)稱DEPC水)。
[0044]實(shí)施例1:芍藥葉片總RNA提取
[0045]I)、稱取0.2g芍藥葉片(液氮保存)在液氮中研磨至粉末狀，快速轉(zhuǎn)移到含有600ul細(xì)胞裂解液I的2.0ml離心管中，顛倒混勻加入30ul β -巰基乙醇、150ul無(wú)水乙醇和150ul 3mol/L NaAc,顛倒混勻,冰上靜置10分鐘，離心5min。
[0046]2)、轉(zhuǎn)移上清液到含有600ul細(xì)胞裂解液II的2.0ml離心管中，顛倒混勻再加入30ul β -巰基乙醇、150ul無(wú)水乙醇和150ul的3mol/L NaAc，顛倒混勻，冰上靜置10分鐘，離心5min。
[0047]3)、轉(zhuǎn)移上清液到含有與上清液等體積水飽和酚:氯仿(體積比為1:1)的
2.0ml離心管中，顛倒混勻，冰上靜置10分鐘，離心5min。
[0048]4)、轉(zhuǎn)移上清液到含有上清液體積2/3的異丙醇的2.0ml離心管中，上下顛倒混勻，冰上靜置10分鐘，離心5分鐘，棄上清。
[0049]]5)、加入420ul DEPC水溶解沉淀，加入80ulDNaseI混合液(10ulDNaseI+70ulRDD)，室溫放置 20min。
[0050]6)、加入與上清液等體積氯仿，上下顛倒混勻，冰上靜置10分鐘，離心5分鐘，取上清。
[0051]7)、轉(zhuǎn)移上清液到含有上清液體積2/3的異丙醇的2.0ml離心管中，上下顛倒混勻，冰上靜置10分鐘，離心5分鐘，棄上清。
[0052]8)、加入 Iml 75% 乙醇，12000r/min 離心 3min,棄上清。
[0053]9)、加入Iml 75%乙醇，12000r/min離心3min,棄上清，干燥。
[0054]10)、加入 30ulDEPC 水溶解。
[0055]以上離心轉(zhuǎn)速均為12，OOOrpm,離心機(jī)為湘義離心機(jī)的TG16-WS。
[0056]快速電泳檢測(cè):用I %含溴化乙錠EB的瓊脂糖凝膠電泳，電壓150V，電泳時(shí)間15分鐘，電泳后用紫外成像儀觀察。結(jié)果顯示電泳帶有5S、18S、28S三條RNA譜帶完整性良好，未見(jiàn)DNA干擾，具體見(jiàn)圖1。圖1中從左到右分別為本分發(fā)明的方法、CTAB法和SDS法的結(jié)果；從圖1中可以看出，對(duì)照樣品降解明顯，本發(fā)明方法所提取的RNA優(yōu)于常規(guī)CTAB法和對(duì)照SDS法。
[0057]紫外法檢測(cè):樣品的濃度取IulRNA用紫外分光光度計(jì)(SM 3000)測(cè)定測(cè)定0D260/0D280。0D260/0D280越接近2.0說(shuō)明RNA純度越高，此方法提取RNA0D260/0D280為1.932，純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0058]反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn):反應(yīng)按北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司TransScriptFirst-Strand cDNA SynthesisSuperMix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT 反應(yīng)步驟為 42 °C 45min 后，85°C5min。用芍藥內(nèi)參基因特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為，10XPCR buffer2.0 μ L,25mmol/L MgCl2 0.2 μ L,10mmol/L dNTP Mix2 μ L,10 μ mol/L 正向引物(5，-ACTGCTGAACGGGAAATTGT-3’ )和反向引物(5，-CAACCGATGAGCTGCTTTTG-3’)各 I μ L，cDNA第一鏈模板I μ L，rTaq酶(5U/ μ L，TakaRa) 0.4 μ L，加無(wú)菌超純水至20 μ L ;擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，55°C退火30s，72°C延伸30s,40個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，擴(kuò)增出分子量約為10bp的預(yù)期條帶，說(shuō)明本發(fā)明方法得到的RNA容易進(jìn)行RT-PCR。
[0059]實(shí)施例2:美國(guó)黃櫨葉片總RNA提取
[0060]采用的植物組織是美國(guó)黃櫨葉片，提取步驟同實(shí)施例1。
[0061]快速電泳檢測(cè):用I %含溴化乙錠EB的瓊脂糖凝膠電泳，電壓150V，電泳時(shí)間15分鐘，電泳后用紫外成像儀觀察。結(jié)果顯示電泳帶有5S、18S、28S三條RNA譜帶完整性良好，未見(jiàn)DNA干擾(圖3)。
[0062]應(yīng)該理解到披露的本發(fā)明不僅僅限于描述的特定的方法、方案和物質(zhì)，因?yàn)檫@些均可變化。還應(yīng)理解這里所用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述特定的實(shí)施方式方案的目的，而不是意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受限于所附的權(quán)利要求。
[0063]本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，或者能夠確認(rèn)使用不超過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，在本文中所述的本發(fā)明的具體的實(shí)施方案的許多等價(jià)物。這些等價(jià)物意欲包含在所附的權(quán)利要求中。
[0064]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.植物葉片總RNA提取方法，其特征在于: (1)植物葉片在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)粉狀，快速轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞裂解液I的離心管中，混勻后加入鹽-醇溶液混勻后離心； (2)轉(zhuǎn)移上清液到含有細(xì)胞裂解液II的離心管中，混勻后加入鹽-醇溶液混勻后離心； (3)轉(zhuǎn)移上清液到新離心管中，經(jīng)等體積的水飽和酚與氯仿組成的混合試劑抽提后離心； (4)取上清液，加入異丙醇沉淀離心，加DEPC水溶解總核酸，再用DNA酶I溶液消化DNA ； (5)經(jīng)等體積氯仿抽提離心； (6)轉(zhuǎn)上清液到新的離心管，加入異丙醇沉淀離心； (7)用醇洗滌，再經(jīng)空氣干燥后，溶解在DEPC水中低溫保存。
2.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:所述細(xì)胞裂解液I為含有2% -4% CTAB,2% -3% PVP,0.1-0.3mol/L Tris-Hcl 和 25-50mmol/L EDTA 的水溶液；所述細(xì)胞裂解液 II 為含有 1% -3% SDS、25-50mmol/L 的 EDTA、0.1-0.3mol/L Tris-Hcl 和2% -3% PVP的水溶液，細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II都調(diào)至pH8.0。
3.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:所述鹽-醇溶液為含有裂解液體積1/20-1/10的β-巰基乙醇、裂解液體積1/4-1/2的無(wú)水乙醇和裂解液體積1/4-1/2的3mol/L NaAc的水溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:DNA酶I溶液濃度為0.1-0.5單位/ μ 1，消化時(shí)間為10-60分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:步驟(4)和(6)中異丙醇的體積為上清液體積的1/2-2/3。
6.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II以500-800ul細(xì)胞裂解液/0.1-0.3g植物葉片的量加入。
7.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:步驟(3)中水飽和酚與氯仿的體積比為1:1。
8.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:步驟(7)中醇為75%乙醇。
9.如權(quán)利要求1所述的總RNA提取方法，其特征在于:離心的轉(zhuǎn)速為5000-20000rpm，時(shí)間2-20分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104263720SQ201410444486
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】唐文思, 吳國(guó)棟, 王華芳 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)