一株血清5型副豬嗜血桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一株血清5型副豬嗜血桿菌菌株JX1002，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2014127。該菌株生物學性能穩定，對仔豬具有很強的致病性，滅活后接種仔豬，具有很好的免疫原性。將其作為疫苗候選株制成的單價疫苗安全性好，能夠對仔豬產生較高的抗體，持續期長，能夠抵抗同型野毒株的攻擊，具有很好的免疫效力。在臨床上使用該滅活疫苗，能夠有效降低該病的發生，減少豬場的經濟損失，其免疫效果達到或優于市場上現有商品化疫苗。CCTCC NO：M 201412720140410
【專利說明】一株血清5型副豬嗜血桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物免疫領域，具體地說，涉及一株血清5型副豬嗜血桿菌及其應用。

【背景技術】
[0002] 副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏病（Glasser ' sdisease),由副豬嗜血桿菌 (Haemophilus parasuis, Hps)引起。該病于1910年由德國學者Glasser首先報道，現已 在全世界范圍內廣泛分布。目前，副豬嗜血桿菌感染是引起豬場仔豬高死亡率的主要病因 之一。在美國，該病已成為危害保育豬群健康的重要傳染病，與藍耳病（PRRS)、圓環病毒 (PCV)并列為第一位，排在流感、鏈球菌和大腸桿菌病之前。該病目前也給中國豬群帶來很 大威脅，隨著豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS，藍耳病）的流行，副豬嗜血桿菌病給豬群造成的 損失比以往更為嚴重，而爆發性的副豬嗜血桿菌病也比以往更為普遍。
[0003] Hps只感染豬，有很強的宿主特異性，可以影響2周齡?4月齡的豬，主要在斷奶前 后和保育舍階段發病，常見于5?8周齡，感染高峰通常見于保育期的4?6周，有些可早 在保育舍內最初2周時就開始出現，并一直持續到肥育期早期，發病率可達40%，嚴重時死 亡率可達50%。與以往相比，本病的流行特點已經發生改變。以前本病是零星散發發生的， 且與斷奶豬的應激有關，但目前此病的發病率和死亡率均呈顯著上升趨勢，呈現地方流行 性，而且常與豬的幾種重要病原體并發感染，如與豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及 豬圓環病毒引起混合感染。
[0004] Hps是一種細小桿菌，在顯微鏡下呈多形態，非溶血性，不運動，無芽孢，無鞭毛，革 蘭氏陰性。新分離的菌株多呈球桿狀或雙球狀，有時可呈短鏈狀，在陳舊培養物中多呈多 形態，有長桿狀和絲狀。Hps屬于需氧或兼性厭氧菌，最適生長溫度為35?37°C，pH7. 6? 7.8, C023%?5%。在適宜培養基上生長的菌落呈圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊，灰白色 半透明，針尖大小。Hps培養條件嚴格，生長依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子）， 不需要X因子。在巧克力培養基上生長較差，在加 NAD、馬血清的M96支原體培養基或加酵 母浸出物的PPLO培養基上生長良好。目前副豬嗜血桿菌至少有15種血清型，其中血清1、 5、10、12、13、14型毒力最強，2、4、8、15型具有中等毒力，3、6、7、9、11型不能引起臨床感染。 從世界范圍內看，血清4、5、13型最為流行，日本、德國、美國、西班牙、加拿大和中國以血清 4型和5型最常見，澳大利亞和丹麥分離的菌株主要為血清5型和13型，但臨床分離菌中約 20%無法定型。但最新的研究結果表明，危害北美各豬場的Hps流行血清型發生了改變，在 美國的豬場中血清5型不再廣泛流行，而以血清4型（39%)和不能分型的分離株（27%) 最為流行。我國當前Hps流行的優勢血清型主要為4、5、12、13型。Hps毒力和致病性可能 與細菌毒素有關，但至今這方面的報道很少。副豬嗜血桿菌是否只產生巴氏桿菌科的一些 非常重要的毒力因子如莢膜、菌毛、脂多糖、外膜蛋白以及它們與本菌的毒力是否有關，目 前還知之甚少。
[0005] 我國是豬肉消費大國，豬肉的消費占總體肉食消費的80%以上，生豬價格的波動 會嚴重影響居民消費指數。目前曾嚴重影響我國養豬業的豬瘟、高致病性藍耳病、豬圓環病 毒病等已經得到有效控制，但以副豬嗜血桿菌病為代表的細菌病對養豬業的危害正日益加 重。從而導致大量使用抗生素進行治療，結果是：一方面導致豬產品抗生素超標，危害人的 身體健康，另一方面導致細菌耐藥性不斷增強，耐藥菌株不斷出現，尤其是副豬嗜血桿菌， 非常容易耐藥，導致治療效果不好，從而養殖戶加大抗生素用量，造成惡性循環。國外研究 表明，用同血清型的菌株制成的滅活疫苗能夠有效抵抗野毒株的感染，是預防和控制副豬 嗜血桿菌病最有效的措施。近年來，國內也開展了滅活疫苗的研究，顯示了很好的防治效 果。因此，在了解本我國主要流行菌的血清型的基礎上，采用滅活疫苗進行接種，可以有效 預防本病的發生。血清5型副豬嗜血桿菌致病力較強，在世界范圍內流行最廣，在我國也流 行最廣泛，引起的危害也最大。同為5型的不同副豬嗜血桿菌菌株毒力不同，免疫原性也不 同，所以，通過動物試驗篩選出一株毒力強、免疫原性好的菌株是制備副豬嗜血桿菌滅活疫 苗的關鍵技術。


【發明內容】

[0006] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一株毒力強、免疫原性好 的血清5型副豬嗜血桿菌及其應用。
[0007] 為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[0008] 本發明首先提供一株血清5型副豬嗜血桿菌株JX1002,分類命名為副豬嗜血桿 菌（Haemophilus parasuis)(血清5型）（Serovar5),已于2〇14年4月 10 日保藏于中 國典型培養物保藏中心CCTCC，地址：中國武漢武漢大學，郵編430072,保藏編號CCTCC M 2014127。
[0009] 該菌株是發明人于2010年2月在江西省南昌市一豬場發病豬分離獲得的一株副 豬嗜血桿菌，經瓊脂凝膠擴散試驗證明，該菌株為血清5型。培養該菌株，經甲醛滅活，與適 宜的佐劑混合，制成單價滅活疫苗，使疫苗中含菌量為2. 5X 109CFU/mL。經動物試驗表明， 該菌株是一株強毒株，對仔豬具有很強的致病力和很好免疫原性。
[0010] 所述血清5型副豬嗜血桿菌株JX1002與其他5型副豬嗜血桿菌比較具有如下生 物學特性：
[0011] 1.致病力強用該菌腹腔注射攻擊16g?20g健康Balb/c小鼠，劑量為 5. OXlO9CFU/只，可導致80%以上小鼠死亡。用該菌腹腔注射攻擊50日齡左右的健康易 感仔豬，劑量為5. 0 X IO9CFU/只，可導致100%以上仔豬發病或死亡。
[0012] 2.免疫原性好滅活該菌，與白油佐劑1 :2乳化制成滅活疫苗，使每毫升疫苗中 含滅活前活菌數為2. OX IO9CFU,接種2?3周齡健康易感仔豬，首免2周后，以相同劑 量再接種一次，二免3周后，用該菌腹腔注射攻擊50日齡左右的健康易感仔豬，劑量為 5. OX IO9CFU/只，免疫組豬80 %保護，而對照組至少80 %仔豬發病或死亡。
[0013] 3.繁殖滴度高該菌的培養液OD值與活菌數大致呈現一種線性關系，經過擬合，得 到菌液OD值與活菌數關系曲線Y = (15. 244X-0. 1959) X IO8CFUAiL (R = 0. 9862)。通過菌 液OD值與活菌數的關系曲線，在確定菌液中活菌數時，可以很方便的通過測定菌液的OD值 而得到。
[0014] 本發明還提供了所述血清5型副豬嗜血桿菌菌株JX1002在制備防治由血清5型 副豬嗜血桿菌導致的副豬嗜血桿菌病的藥物中的應用。
[0015] 本發明進一步提供一種防治副豬嗜血桿菌病的疫苗，包含前述菌株或由前述菌株 制備。所述疫苗可為單價或多價疫苗。
[0016] 當其為單價疫苗時，可針對性較強的防治由血清5型副豬嗜血桿菌導致的副豬嗜 血桿菌病；當其為多價疫苗時，也可有效的防治由血清5型副豬嗜血桿菌導致的副豬嗜血 桿菌病。
[0017] 作為優選，所述疫苗為滅活疫苗，包含滅活前述菌株。
[0018] 作為優選，所述疫苗為單價疫苗，含菌量為I. 0-5. 0X109CFU/mL。
[0019] 更為優選，所述單價疫苗的含菌量為2. OX 109CFU/mL。
[0020] 所述單價疫苗的制備方法為：培養前述菌株，經甲醛滅活，與佐劑混合，制成單價 滅活疫苗。
[0021] 所述佐劑可為本領域制備疫苗時常規選用的任何佐劑，為了更好的提高疫苗的免 疫效果，所述佐劑選自白油、鋁膠、206和GEL中的一種。
[0022] 本發明還進一步提供用于擴增所述菌株0mpA5基因的引物對，所述引物對的核 苷酸序列為：
[0023] 上游引物：0mpA5F : CCACAAGCTAACAC ;
[0024] 下游引物：OmpA5R :AACTTCTTTTGAACCT。
[0025] 0mpA5蛋白是副豬嗜血桿菌一個外膜蛋白，具有種屬特異性，而不具有型特異性， 是副豬嗜血桿菌一個主要免疫蛋白。通過該引物可以檢測所有型的副豬嗜血桿菌，不具有 血清型特異性。
[0026] 以及用于擴增所述菌株16S rRNA基因的引物對，所述引物對的核苷酸序列為：
[0027] 上游引物 F : 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'
[0028] 下游引物 R:5' -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'。
[0029] 該引物對可用于檢測本發明所述菌株。
[0030] 本發明的有益效果在于：
[0031] 本發明提供的血清5型副豬嗜血桿菌JX1002生物學性能穩定，對仔豬具有很強的 致病性，滅活后接種仔豬，具有很好的免疫原性。將其作為疫苗候選株制成的單價疫苗安全 性好，能夠對仔豬產生較高的抗體，持續期長，能夠抵抗同型野毒株的攻擊，具有很好的免 疫效力。在臨床上使用該滅活疫苗，能夠有效降低該病的發生，減少豬場的經濟損失，其免 疫效果達到或優于市場上現有商品化疫苗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為本發明實施例2中副豬嗜血桿菌活菌數與0D_值的相關性曲線。

【具體實施方式】
[0033] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0034] 實施例1血清5型副豬嗜血桿菌的分離與鑒定
[0035] 1.病原菌的分離
[0036] 用無菌接種環從疑似病豬新鮮的肺臟、心包積液、關節液等病料中取樣，在TSA培 養基（含終濃度5%血清和0. 001 %的NAD)上劃線接種，37°C培養24h?48h后觀察生長 情況，對疑似菌落進行革蘭氏染色鏡檢。挑取單個菌落，在TSA固體培養基上采取分區劃線 法，進行3?5次單菌落純化培養，直至無任何雜菌為止。
[0037] 2.病原菌的鑒定
[0038] 2. I NAD依賴性試驗
[0039] 在II級生物安全柜中，用接種環挑取上述可疑菌的單菌落，水平劃線于無 NAD的 TSA平皿上，在挑去金黃色葡萄球菌垂直于水平劃線，37°C培養24h?48h，結果出現了"衛 星生長現象"，即在葡萄球菌苔附近的的菌落較大，遠側的菌落較小甚至沒有菌落存在。
[0040] 2. 2 鏡檢
[0041] 挑取上述純化培養的單菌落在事先滴有生理鹽水的載玻片上涂菌，按照常規革蘭 氏染色法進行染色，在光學顯微鏡觀察。在顯微鏡下可見，細菌為革蘭氏陰性細小桿菌，具 有多種不同的形態，從單個的球桿菌到長的、細長的、甚至有細絲狀的菌體。
[0042] 2. 3生化鑒定試驗
[0043] 在II級生物安全柜中，用接種環分別挑取分離純化的疑似副豬嗜血桿菌的單菌 落，水平劃線于新的TSA培養基上，于37°C培養14h?16h。刮取多個菌落（成團狀最佳）， 分別接種尿素酶、氧化酶、硝酸鹽還原、蛋白胨水（吲哚）、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、半 乳糖、麥芽糖和〇NPG( β -半乳糖苷）等微量生化鑒定管中，并在每個微量生化鑒定管中加 入3 μ 1?5 μ 10. 1 % NAD，并設置對照管。于37°C培養24 h?48 h，觀察并參照廠家說明 書判定試驗結果。結果為半乳糖、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、尿素、0NPG、硝酸鹽還原、尿素 酶、麥芽糖為陽性，而阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、乳糖、山梨醇、硫化氫、Π 引哚為陰性。生化結果 表明該菌符合副豬嗜血桿菌的生化特征。
[0044] 2. 4 PCR 鑒定
[0045] 將待檢菌株菌液12, 000r/min離心3min，棄去上清液后，用無菌DEPC水懸浮，在 振蕩器上渦旋lmin，于沸水中水浴20min，取出后置于-20°C冰箱中凍結。凍融后12, OOOr/ min離心Imin,上清液即為模板DNA。
[0046] 參照Olveira S等發表的副豬嗜血桿菌16S rRNA基因序列設計引物，對分離的疑 似HPS菌株進行PCR鑒定。
[0047] 上游引物 F :5' -GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3'
[0048] 下游引物 R :5' -GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3'
[0049] PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0050] 以菌液DNA為模板，反應體系（25 μ 1)如下：
[0051]

【權利要求】
1. 一株血清5型副豬嗜血桿菌菌株JX1002,其特征在于，保藏在中國典型培養物保藏 中心，保藏編號為：CCTCC M 2014127。
2. 權利要求1所述的血清5型副豬嗜血桿菌菌株JX1002在制備防治由血清5型副豬 嗜血桿菌導致的副豬嗜血桿菌病的藥物中的應用。
3. -種防治副豬嗜血桿菌病的疫苗，其特征在于，包含權利要求1所述菌株或由權利 要求1所述菌株制備。
4. 根據權利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為滅活疫苗，包含滅活的權利要 求1所述菌株。
5. 根據權利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為單價疫苗，含菌量為 1. 0 ?5. 0X109CFU/mL。
6. 根據權利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的含菌量為2. 5X 109CFU/mL。
7. 根據權利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的制備方法為：培養權利要求1 所述菌株，經甲醛滅活，與佐劑混合，制成單價滅活疫苗。
8. 根據權利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述佐劑選自白油、鋁膠、206和GEL中的 一種。
9. 用于擴增權利要求1所述菌株的OmpA5基因的引物對，其特征在于，所述引物對的核 苷酸序列為： 上游引物：0mpA5F :CCACAAGCTAACAC ; 下游引物：0mpA5R :AACTTCTTITGAACCT。
10. 用于擴增權利要求1所述菌株的16S rRNA基因的引物對，其特征在于，所述引物對 的核苷酸序列為： 上游引物 F : 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'; 下游引物 R : 5' -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 '。
【文檔編號】C12N1/20GK104388340SQ201410588441
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月28日 優先權日:2014年10月28日
【發明者】李曉成, 邵衛星, 吳發興, 張志 , 劉爽, 董雅琴, 李鵬, 王佳, 于美芳 申請人:中國動物衛生與流行病學中心