本發明涉及一種飼料添加劑及其應用，特別涉及一種促進雛雞生長及增強雛雞抵抗雞白痢沙門氏菌感染能力的飼料添加劑及其應用，屬于飼料研究
技術領域：
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背景技術：
：雞白痢沙門氏菌病是由雞白痢沙門氏菌引起的一種死亡率高，影響范圍廣的傳染病，在自然情況下，很多品種的雞均易感，尤其以1～2周齡以內的雛雞發病率與病死率最高，嚴重危害家禽業。病雞常出現采食量減少，瞌睡，懼冷，易靠近熱源，不喜歡活動，萎靡不振等癥狀；同時排出白色糞便，嚴重的會出現肛門周圍粘有糞便的糊肛情況。在正常情況下，雞白痢沙門氏菌的宿主主要是雞，不過也有報道顯示火雞、鵪鶉、雉雞、麻雀等動物能夠感染雞白痢沙門氏菌。雞白痢可能通過死亡率高，發病率高和產蛋量減少造成全球經濟損失。由雞白痢沙門氏菌引起的疾病，不僅給家禽生產繁殖造成影響，同時也是人類食源性疾病的主要病原菌，因此防治和解決沙門氏菌污染迫在眉睫。目前，通過接種疫苗，使用抗生素和其他藥物是預防雞白痢沙門氏菌病的主要措施，但抗生素會造成病原體的耐藥性和在禽類產品抗生素殘留等安全性問題。而抗菌肽和益生乳酸菌作為微生態飼料添加劑已經廣泛應用于飼料加工業，因其具有安全、綠色、無污染、無殘留等化學特性備受人們的關注，研究與使用抗菌肽替代抗生素是養殖業生產中的發展趨勢。乳鐵蛋白肽(Lfcin)是乳鐵蛋白在酸性環境條件下，經胃蛋白酶作用，釋放出來的一段小分子抗菌肽，具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、消炎、促生長及參與免疫反應等功能。由于牛乳鐵蛋白肽具有普通抗生素具有的廣譜抗菌能力和抗生素所不具有的不易產生耐藥性優點，還能夠抑制病毒、真菌增殖和抑制腫瘤細胞生長，對真核細胞卻幾乎沒有毒性，在目前研究范圍內，是一種健康、安全、綠色的抗菌肽，并對于應用在養殖業方面，具有廣泛的使用前景和巨大的市場開發潛力。本發明發明人在前期工作中成功構建了能夠表達牛乳鐵蛋白肽的乳酸乳球菌重組菌株pAMJ399-LFBA/MG1363，該重組菌既有乳酸菌的益生性，又具有牛乳鐵蛋白肽的生物學功能，為研究替代飼料中抗生素的可行性，將重組菌株pAMJ399-LFBA/MG1363添加到飼料中對雛雞進行飼喂，從雛雞的生長性能、腸道菌群的變化以及抗雞白痢沙門氏菌感染的保護作用等方面綜合分析，以探索表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌在家禽業中的應用前景。本發明的提出為以乳酸菌為載體的抗菌肽在飼料添加劑應用、開發和工業化生產等方面提供了新的技術手段和理論支持。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠促進雛雞生長及增強雛雞抵抗雞白痢沙門氏菌感染能力的飼料添加劑及其用途。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：本發明以牛乳鐵蛋白上的17-41位(LFcin)和268-284位(LFampin)氨基酸為參考序列，優化設計這兩段基因，成功構建了表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363。該重組系統既具有乳酸乳球菌益生性、安全性，還具有牛乳鐵蛋白肽的抗菌、抗病毒等生物學特性；該重組菌還可以通過先天性免疫激活腸道黏膜免疫系統，卻不刺激機體產生抗體。為檢測表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌對雛雞生長的影響，將1日齡雛雞隨機分成4組，每組8只，實驗組飼喂含有2×1013cfu/kgpAMJ399-LFBA/MG1363重組乳酸乳球菌的飼料，同時以飼喂含有pAMJ399/MG1363飼料的空載體組、飼喂含有GM17培養基飼料的組和飼喂含有抗生素的組作為對照，連續飼喂14d，測定雛雞體重變化及飼料重量；心臟采血處死雛雞測定免疫器官胸腺、脾和法氏囊的指數；同時收集回腸和盲腸的腸黏液，用菌落計數的方法比較各組腸道菌群差異。結果表明飼喂pAMJ399-LFBA/MG1363重組乳酸乳球菌組與培養基和空載體對照組相比，雛雞的日增重顯著增加，料重比顯著降低，提高了飼料的轉化率。飼料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363組與培養基組相比，胸腺指數、脾指數和法氏囊指數均有所增加且差異極顯著(P＜0.01)。回腸和盲腸腸道菌群測定結果可見，pAMJ399-LFBA/MG1363組降低了大腸桿菌、鏈球菌的數量，提高了乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量。以上結果表明，表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌能夠促進雛雞生長，改善腸道菌群和提高機體免疫。為進一步檢測重組乳酸乳球菌的抗菌活性，本發明對其抗雞白痢沙門氏菌感染的保護作用進行研究。將1日齡雛雞隨機分成4組，每組15只，實驗組飼喂含有2×1013cfu/kgpAMJ399-LFBA/MG1363重組乳酸乳球菌的飼料，同時以飼喂含有pAMJ399/MG1363飼料的空載體組、飼喂含有GM17培養基飼料的組和飼喂含有抗生素的組作為對照，連續飼喂14d，第7d時給雛雞灌服雞白痢沙門氏菌1mL(3.16×1012cfu/mL)，連續觀察7天，并記錄臨床癥狀和發病情況；分別于攻菌前0h和攻菌后的1d、3d、5d和7d心臟采血處死雛雞，采集血清及盲腸黏液，通過試劑盒檢測血清中總IgG和盲腸黏液中總SIgA的水平；取雛雞盲腸扁桃體，研磨后提取RNA，qRT-PCR測定非特異免疫信號通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的轉錄水平；攻菌后的第7d采集各組雛雞的心臟、肝臟、脾臟及十二指腸，HE染色觀察各組織器官病變情況。結果表明飼料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363能提高血清總IgG和黏液中總SIgA免疫球蛋白水平，增強其免疫力；其中攻菌后5d和7d雛雞血清中IgG的含量顯著升高，與培養基組相比差異極顯著(P＜0.01)，攻菌7d后雛雞黏液中SIgA的含量高于培養基組，且差異極顯著(P＜0.01)，與抗生素組無明顯差異。對各組織器官進行HE染色后，pAMJ399-LFBA/MG1363組和抗生素組心臟、肝臟、脾臟及十二指腸病變情況明顯輕于培養基組和空載體組。對非特異免疫信號通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的轉錄水平測定結果表明，pAMJ399-LFBA/MG1363組雛雞感染3d時，TLR4、MyD88mRNA相對水平顯著升高；7d時有所下降，其中pAMJ399-LFBA/MG1363組TLR4mRNA相對水平高于培養基組，差異極顯著(P＜0.01)，MyD88mRNA相對水平高于培養基組，差異顯著(P＜0.05)；感染7d時，pAMJ399-LFBA/MG1363組與培養基組相比，TNF-α、NF-κB、IL-8mRNA相對水平高，TNF-αmRNA轉錄水平差異極顯著(P＜0.01)，NF-κB、IL-8mRNA相對水平差異性顯著(P＜0.05)，IL-6mRNA相對水平差異不顯著(P＞0.05)；本研究表明，雛雞感染雞白痢沙門氏菌后，表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌能夠緩解各器官病變，提高血清和黏液中免疫球蛋白水平，激活先天免疫系統及信號通路，在抗雞白痢沙門氏菌感染的過程中起到了保護作用。以上結果表明表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌作為抗生素的替代品應用于飼料添加劑中具有潛在的應用前景，能夠起到促進雛雞生長、抗雞白痢沙門氏菌感染的保護作用。因此，在上述研究的基礎上，本發明提出了一種促進雛雞生長及增強雛雞抵抗雞白痢沙門氏菌感染能力的飼料添加劑，所述飼料添加劑中含有表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌，所述的表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌是通過將含有SEQIDNO.1所示的牛乳鐵蛋白肽基因的載體導入乳酸乳球菌MG1363中得到的。在本發明中，優選的，所述的載體為乳酸乳球菌表達載體質粒pAMJ399。在本發明中，優選的，所述的表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌是通過以下方法構建得到的：(1)根據乳酸乳球菌MG1363密碼子偏嗜性，通過密碼子優化設計并合成兩段牛乳鐵蛋白肽LFcin和LFampin的基因序列，然后通過在兩段基因間添加信號肽和RBS序列，使兩段牛乳鐵蛋白肽基因在乳酸乳球菌中共表達，并在5’添加BglⅡ酶切位點；在3’添加SalⅠ酶切位點，將構建得到的融合基因命名為LFBA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)將LFBA基因定向插入到乳酸乳球菌表達載體質粒pAMJ399的BglⅡ以及SalⅠ酶切位點之間，得到含有LFBA基因的重組載體，命名為pAMJ399-LFBA；(3)將pAMJ399-LFBA電轉化乳酸乳球菌MG1363，構建得到分泌型表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌。進一步的，本發明還提出了所述的飼料添加劑在促進雛雞生長中的用途。以及所述的飼料添加劑在制備增強雛雞抵抗雞白痢沙門氏菌感染能力的飼料中的用途。相較于現有技術，本發明的有益效果在于：本發明提出了一種具有安全、綠色、無污染、無殘留特點的飼料添加劑，該飼料添加劑能夠促進雛雞生長及增強雛雞抵抗雞白痢沙門氏菌感染能力，而且相較于傳統抗生素，能提高腸內有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌，同時降低了大腸桿菌和鏈球菌的數量，很好的調節了腸道內的菌群；而傳統抗生素整體上降低了各種菌群的菌落數，造成宿主出現菌群紊亂，不利于菌群的定植。附圖說明圖1為重組乳酸乳球菌表達產物的WesternBlot鑒定結果；M超低分子量蛋白標準蛋白Marker；1pAMJ399/MG1363TCA濃縮20倍上清；2pAMJ399-LFBA/MG1363TCA濃縮20倍上清；圖2為pAMJ399/MG1363菌體以及pAMJ399-LFBA/MG1363菌體的免疫熒光鑒定結果；圖3為雛雞各器官指數；圖4為肝臟中雞白痢沙門氏菌菌落數；圖5為雛雞肝臟病理變化(40×)；圖6為雛雞脾臟病理變化(40×)；圖7為雛雞心臟病理變化(40×)；圖8為雛雞十二指腸病理變化(100×)；圖9為雛雞總IgG抗體水平；圖10為雛雞腸黏液中總SIgA抗體水平；圖11為盲腸中TLR4mRNA相對水平；圖12為盲腸中MyD88mRNA相對水平；圖13為盲腸中NF-κBmRNA相對水平；圖14為盲腸中TNF-αmRNA相對水平；圖15為盲腸中IL-8mRNA相對水平；圖16為盲腸中IL-6mRNA相對水平。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363的構建1、重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363的構建本實驗根據乳酸乳球菌MG1363密碼子偏嗜性，通過密碼子優化設計并合成兩段牛乳鐵蛋白肽LFcin(17-41)和LFampin(268-284)的基因序列，然后通過在兩段基因間添加信號肽和RBS序列，使兩段牛乳鐵蛋白肽基因在乳酸乳球菌中共表達，并在5’添加BglⅡ酶切位點(AGATCT)；在3’添加SalⅠ酶切位點(GTCGAC)，將構建得到的融合基因命名為LFBA(SEQIDNO,1所示)，交由DNA2.0公司合成；將LFBA基因定向插入到乳酸乳球菌表達載體質粒pAMJ399的BglⅡ以及SalⅠ酶切位點之間，經酶切以及測序鑒定，證明載體構建正確，命名為pAMJ399-LFBA。pAMJ399-LFBA經電轉化構建分泌表達型重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363。2、重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363表達產物的Western-blot的鑒定在發酵罐中培養24h后取樣，通過TCA濃縮處理上清，Tricine-SDS-PAGE結束后，經轉印將凝膠中的蛋白轉印至PVDF膜上，檢測結果可見重組菌pAMJ399-LFBA/MG1363與制備的牛乳鐵蛋白單克隆抗體4E10發生特異性的反應，在約4.3KDa處獲得特異的反應帶，表明重組乳酸乳球菌中牛乳鐵蛋白肽獲得表達。結果如圖1：3、菌體免疫熒光鑒定重組乳酸乳球菌的表達通過間接免疫熒光法檢測，熒光顯微鏡觀察可知重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363菌體表面有黃綠色熒光，而對照組pAMJ399/MG1363菌體表面沒有熒光，觀察結果見圖2，表明重組乳酸乳球菌表面表達了牛乳鐵蛋白肽。通過間接免疫熒光法和Western-blot法確定重組乳酸乳球菌在菌體和上清中都確定已經表達。實施例2重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363在促進雛雞生長及增強雛雞抵抗雞白痢沙門氏菌感染能力中的應用1.材料1.1菌種與細胞表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363由實施例1構建；沙門氏菌CVCC528株由東北農業大學動物醫學學院藥理實驗室饋贈。鼠骨髓瘤細胞株SP2/0由本實驗室凍存。1.2實驗動物1日齡海蘭白雛雞購自哈爾濱市先鋒種雞場；SPF級4～6周齡BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司。2.重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363對雛雞生長的促進作用2.1重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363對雛雞生長性能的影響將1日齡雛雞隨機分成4組，每組8只，實驗組飼喂添加2×1013cfu/kg的pAMJ399-LFBA/MG1363重組乳酸乳球菌的飼料，空載體組飼喂添加相同量pAMJ399/MG1363的飼料、GM17組飼喂添加相同量GM17培養基的飼料，抗生素組飼喂添加相同量金霉素的飼料，各組連續飼喂14d，測定雛雞體重變化及飼料重量，結果見表1，可見重組乳酸乳球菌組與培養基組相比提高了雛雞的平均日增重，同時降低了料重比。由此結果可見在飼料中添加表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363能夠提高雛雞的生長性能。表1雛雞日增重、料重比pAMJ399-LFBA/MG1363組空載體組抗生素組GM17組日增重(g)7.29±0.186.77±0.127.25±0.166.64±0.25料重比2.82±0.093.19±0.052.91±0.063.39±0.132.2重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363對雛雞器官指數的影響處死飼喂14d的雛雞，取出胸腺、脾臟、法氏囊進行稱量，計算每組免疫器官指數的平均值。稱量結果顯示，飼料中添加pAMJ399-LFBA/MG1363的重組乳酸乳球菌組與培養基組和空載體組相比，脾指數均有所增加且差異極顯著(P＜0.01)；pAMJ399-LFBA/MG1363組與pAMJ399/MG1363空載體組相比，胸腺指數和法氏囊指數增加且差異性顯著(P<0.05)，與培養基組相比差異極顯著(P＜0.01)。結果見圖3。以上結果表明，在飼料中添加重組乳酸乳球菌，與培養基和空載體組相比，這些器官指數均有所增加，與抗生素的作用相似。由此可見重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363對免疫器官的發育有促進作用，在一定程度上能夠提高雛雞的免疫功能。2.3重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363對雛雞腸道菌群的影響連續飼喂14d后，心臟采血處死雛雞并無菌采集回腸和盲腸，對其內容物中的大腸桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌和雙歧桿菌進行傳統的菌落計數，可見與培養基對照組相比，在回腸和盲腸菌群分布中，重組乳酸乳球菌組均降低了大腸桿菌和鏈球菌的數量，同時增加了乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量。結果見表2和3。表2回腸中菌群分布情況大腸桿菌乳酸桿菌鏈球菌雙歧桿菌pAMJ399-LFBA/MG1363組2.21×1042.86×1061.05×1047.56×106空載體組3.53×1042.18×1061.17×1045.60×106抗生素組1.71×1041.53×1061.14×1045.14×106GM17組4.18×1041.89×1061.98×1044.66×106表3盲腸中菌群分布情況大腸桿菌乳酸桿菌鏈球菌雙歧桿菌pAMJ399-LFBA/MG1363組4.92×1076.81×1073.62×1041.14×108空載體組1.42×1085.14×1076.78×1045.17×107抗生素組1.31×1074.42×1072.14×1045.12×107GM17組2.15×1084.64×1074.52×1045.08×107本實驗通過對14日齡雛雞的料重比和腸道菌群數差異對雛雞的生長性能進行研究。由實驗結果發現，添加重組菌pAMJ399-LFBA/MG1363和抗生素能顯著降低料重比，提高飼料的轉化率；大腸桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌和雙歧桿菌是腸道內的常見菌，通過傳統菌落計數方法對雛雞回腸和盲腸進行以上四種菌的計數，分析得出pAMJ399-LFBA/MG1363組與培養基組和空載體組相比，能提高腸內有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌，同時降低了大腸桿菌和鏈球菌的數量，很好的調節了腸道內的菌群；而抗生素組整體上降低了各種菌群的菌落數，造成宿主出現菌群紊亂，不利于菌群的定植。3.重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363對抗雞白痢沙門氏菌感染的雛雞的作用.3.1雞白痢沙門氏菌感染雛雞的致病性實驗雛雞灌服不同濃度的雞白痢沙門氏菌后，部分出現精神不振、絨毛松亂、兩翼下垂、怕冷、昏睡、糞便呈灰白色，沾染肛門等癥狀，表明雛雞感染了雞白痢沙門氏菌。根據karber法計算雛雞感染雞白痢沙門氏菌的半數致死量，LD50＝3.16×1012CFU/mL，結果見表4。表4雞白痢沙門氏菌半數致死量實驗結果組別菌液濃度(cfu/mL)總數量死亡只數11×10135321×10125231×10115041×10105051×109506對照組(生理鹽水)503.2雛雞感染雞白痢沙門氏菌的臨床癥狀為進一步檢測重組乳酸乳球菌的抗菌活性，本發明對其抗雞白痢沙門氏菌感染的保護作用進行研究。將1日齡雛雞隨機分成4組，每組15只，實驗組飼喂添加2×1013cfu/kg的pAMJ399-LFBA/MG1363重組乳酸乳球菌的飼料，空載體組飼喂添加相同量pAMJ399/MG1363的飼料、GM17組飼喂添加相同量GM17培養基的飼料，抗生素組飼喂添加相同量金霉素的飼料，連續飼喂14d，第7d時給雛雞灌服雞白痢沙門氏菌1mL(3.16×1012cfu/mL)，連續觀察7天，并記錄臨床癥狀和發病情況。結果發現，雛雞在感染雞白痢沙門氏菌后，各組雛雞陸續出現精神不振、食欲下降、怕冷、體重減輕以及不同程度腹瀉等癥狀，表明已經發病。其中重組乳酸乳球菌組和抗生素組雛雞癥狀較輕，畏冷，少食，排白色糞便；空載體組雛出現雞閉眼昏睡，排白色稀漿樣糞便癥狀；GM17組臨床癥狀最為明顯，羽毛干燥松亂，縮頭頸，發病后期呼吸困難，排白色糞便甚至有糊肛癥狀，并且雛雞發病死亡持續不斷。3.3感染后雛雞肝臟組織沙門氏菌菌落計數攻菌7d后，無菌取出雛雞的肝臟研磨均勻，倍比稀釋，涂布于SS瓊脂平板上，每個稀釋度做3個平行樣，37℃溫箱中培養24h后選取合適的稀釋倍數進行菌落計數。從結果可見，重組乳酸乳球菌組中的沙門氏菌數低于空載體組，差異性顯著(P＜0.05)；與培養基組相比，也顯著低于培養基組，且差異性極顯著(P＜0.01)，結果見圖4。3.4雞白痢沙門氏菌對雛雞各組織器官的影響在感染雞白痢沙門氏菌7d后處死雛雞，剖檢取出心臟、肝臟、脾臟、十二指腸，用甲醛固定做石蠟切片及HE染色以觀察各組各器官病理組織學變化情況。圖5肝臟切片顯示，重組乳酸乳球菌組核染色均勻，形態整齊，而其余三組結締組織中均可見不同程度的淋巴細胞浸潤，抗生素組較輕；空載體組、培養基組在顯微鏡下能夠看到肝細胞著色變淡，竇狀系有少量紅細胞。圖6重組乳酸菌組和抗生素組脾臟白髓完整，紅髓白髓界線明顯，空載體和培養基組脾臟白髓中央有壞死的跡象，脾小體萎縮較嚴重。圖7心臟切片均有一定程度的充血，少量心肌纖維斷裂，但重組乳酸菌組明顯癥狀輕于其他三組。圖8十二指腸腸道切片顯示重組乳酸菌組和抗生素組癥狀較輕，空載體和培養基組腸道間質變寬，固有層充血，部分絨毛斷裂脫落到官腔，有少量炎性細胞浸潤。3.5血清總IgG和腸黏液總SIgA抗體水平的測定雛雞感染雞白痢沙門氏菌后，血清和黏液中免疫球蛋白水平能夠反映其抵抗外界病原菌和病毒侵襲的能力，這些免疫球蛋白主要包括IgG、IgA和IgM，從實驗結果表明，飼料中添加表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌能明顯提高血清和黏液中免疫球蛋白水平，增強其主動免疫力。其中5日齡和7日齡雛雞血清中IgG的含量與培養基組相比較高，且差異極顯著(P＜0.01)，7日齡雛雞黏液中SIgA的含量高于培養基組，且差異極顯著(P＜0.01)，見圖9和10。這些結果可以表明，重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363能夠顯著提高血清和黏液中免疫球蛋白水平，增強機體主動免疫能力，對宿主的體液免疫和腸黏膜局部免疫具有一定的調節作用。3.6TLR4/MyD88/NF-кB信號通路分子及細胞因子轉錄水平的測定本實驗中，雛雞感染雞白痢沙門氏菌后，為研究表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363對發揮先天性免疫作用信號通路中信號分子的影響，對TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6mRNA基因相對轉錄水平進行了測定。(1)本實驗將培養基組攻菌1d時基因的轉錄水平作為參照因子，其它組及不同時間點基因的轉錄水平與其相比，得到相應基因轉錄水平的倍數，采用內參β-actin對基因進行均一化處理。從圖11和12中可見，在攻菌1d、3d、7d時，pAMJ399-LFBA/MG1363組和抗生素組盲腸中MyD88-依賴信號通路基因中的TLR4、MyD88mRNA相對水平均高于空載體組和培養基組，1d時TLR4、MyD88mRNA相對水平差異不顯著；3d時，TLR4、MyD88mRNA相對水平顯著升高；7d時，相對水平有所下降，其中重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363組和抗生素組盲腸中TLR4mRNA相對水平高于培養基且差異性極顯著(P＜0.01)，MyD88基因與培養基組相比相對水平高，且差異性顯著(P＜0.05)，空載體組基因相對水平與培養基組相近。(2)為進一步比較各組之間細胞因子的差異，本實驗選用培養基組感染7d時基因的轉錄水平作為參照因子，其他組基因的轉錄水平與其相比，得到相應基因轉錄水平的倍數，采用內參β-actin對基因進行均一化處理。盲腸中NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6mRNA相對水平分別見圖13、14、15、16，其中pAMJ399-LFBA/MG1363組與培養基組相比，TNF-αmRNA相對水平較高，差異性極顯著(P＜0.01)，NF-κB、IL-8mRNA相對水平也高于培養基組，差異性顯著(P＜0.05)，IL-6mRNA相對水平不顯著(P＞0.05)。本研究表明，雛雞感染雞白痢沙門氏菌后，MyD88-依賴途徑被激活，TLR4與MyD88表達趨勢一致，NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6與TLR4/MyD88/NF-кB信號通路有一定的關聯，由此可見，表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363能夠通過調節MyD88-依賴途徑中信號分子和細胞因子的相對轉錄水平從而激活先天免疫系統，抵抗雞白痢沙門氏菌感染。經上述研究證實，飼喂表達本發明的牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363可提高雛雞日增重，降低料重比，增加免疫器官指數，提高免疫能力，對雛雞的生長具有一定的促進作用。此外，以表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363飼喂雛雞，可以降低雛雞感染程度，提高免疫球蛋白含量，對雛雞抗雞白痢沙門氏菌感染有一定的保護作用。序列表<110>東北農業大學<120>一種促進雛雞生長及增強雛雞抵抗雞白痢沙門氏菌感染能力的飼料添加劑及其應用<130>KLPI161341<160>11<170>PatentIn3.5<210>1<211>355<212>DNA<213>LFBA<400>1agatctttcaaatgtagacgttggcaatggcgtatgaaaaagcttggagcaccatctatt60acatgtgtaagacgagccttttagtaactgcagtctagattagggtaactttgaaaggat120attcctcatgaaattt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