本發明涉及了一種飼料、制作方法及其作用，尤其是涉及了一種含有miRNA-34的飼料、制作方法及其抗病毒抗癌作用。

背景技術：

目前主要通過注射microRNA模擬物及前體的方式，使microRNA維持過表達水平。這兩種方法價格昂貴，所需劑量高，不適用于實際應用。近年來，已有報道表明，人通過食入大米，在血液中可以檢測出大米特有的microRNA，并且此microRNA可以調控人低密度脂蛋白受體銜接蛋白1基因。另外，通過灌胃方式把中藥金銀花湯劑中的金銀花microRNA灌入小鼠循環系統，可以有效抑制小鼠體內的流感病。但是，目前還沒有制做出來一種產品能有效地通過喂食microRNA的方式來對抗疾病。

技術實現要素：

為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述不足，而提供了一種含有miRNA-34的飼料、制作方法及其抗病毒抗癌作用，具體是利用microRNA可以跨物種調控的機制來制作含有microRNA的飼料，方便、經濟、安全，通過喂食該飼料達到抗病毒抗癌癥的目的，從而有效地通過喂食microRNA的方式來對抗疾病。

本發明解決上述問題所采用的技術方案包括以下步驟：

一、一種含有miRNA-34的對蝦飼料制作方法，包括以下步驟：

1)把用于表達成熟miRNA-34的DNA序列構建到LITMUS 38i載體質粒上，構建成功的質粒轉入RNAse III缺陷型的大腸桿菌菌株HT115中，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTTG)誘導大量轉錄獲得miRNA-34；

所述的LITMUS 38i載體質粒為2814個堿基，可轉錄雙鏈RNA的載體。

2)把步驟1)產生miRNA-34的菌體滅活，把滅活的菌體拌入對蝦飼料中，加入魚餌飼料粘合劑；

3)均勻攪拌飼料后，置于烘箱中烘干，獲得對蝦飼料。

所述的用于表達成熟miRNA-34的DNA序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，miRNA-34的堿基序列為SEQ ID NO.3。

所述步驟2)菌體滅活是在60℃水浴下滅活約90min，所述步驟3)烘箱中烘干是在60℃烘箱中烘干1h。

所述步驟1)的大腸桿菌菌株HT115是在37℃下培養，加入IPTTG的工作濃度為1mM。

所述步驟2)滅活的菌體拌入對蝦飼料后，菌含量為每克蝦飼料中含有的菌個數是3×10¹²數量級，魚餌飼料粘合劑加入量為蝦飼料質量的3％。

二、一種含有miRNA-34的對蝦飼料，是采用上述方法制備獲得的蝦飼料。

三、所述含有miRNA-34的對蝦飼料在抗對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)中的應用。

四、一種含有miRNA-34的鼠飼料制作方法，包括以下步驟：

步驟一、用權利要求1-4任一所述方法制備獲得的蝦飼料持續喂食對蝦，對蝦采用日本對蝦，是在27℃養殖；

步驟二、收集對蝦肌肉，加熱2min后，拌入到裸鼠飼料中，烘箱中烘干約2-3h，完成獲得鼠飼料。

所述步驟二中的收集對蝦肌肉是在喂食對蝦的3-5天后收集。

所述步驟二中對蝦肌肉拌入到裸鼠飼料后，對蝦肌肉與裸鼠飼料的質量比為1:1。

五、一種含有miRNA-34的鼠飼料，是采用上述方法制備獲得的鼠飼料。

六、所述含有miRNA-34的鼠飼料在抗乳腺癌中的應用。

本發明與現有技術相比，具有以下優點：

本發明發現了miR-34可跨物種調控的機制，并且建立了方便、經濟、安全的制備方法，使日本對蝦及乳腺癌細胞中維持miR-34的過表達水平，從而達到既可以抗病毒又可以治療癌癥的目的，本發明解決了現有傳統的注射microRNA模擬物及前體的方式所帶來的經濟壓力。

附圖說明

圖1是實施例1通過Northern blot檢測miR-34在菌里的表達水平。

圖2是實施例1通過Northern blot檢測miR-34在對蝦中的表達水平。

圖3是實施例1對白斑綜合征病毒(WSSV)復制的影響結果檢測圖。

圖4是實施例1檢測喂食對蝦含有miR-34的對蝦飼料后，對對蝦死亡率的影響結果檢測圖。

圖5是實施例2檢測miR-34對乳腺癌細胞遷移的影響結果檢測圖。

圖6是實施例2動物活體成像以及化學熒光信號結果圖。

大腸桿菌菌株HT115已于2016年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC No.13128。分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。

本發明的實施例如下：

實施例的LITMUS 38i載體質粒購買于New England Biolabs公司。其制備過程如下：

a)在上海捷瑞公司合成帶有酶切位點(Hind III及EcoRI)的成熟miRNA-34的單鏈DNA序列，兩條序列分別是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，使用購買于日本Takara公司的退火緩沖液，合成雙鏈的成熟miRNA-34的序列。

b)使用購買于New England Biolabs公司的Hind III及EcoRI內切酶37℃處理LITMUS 38i載體質粒1個小時。即在SEQ ID NO.1的序列5’-GTAAAGCTTTGGCAGTGTGGTTAGCTGGTTGTGAATTCCTG-3’及SEQ ID NO.2的序列5’-CAGGAATTCACAACCAGCTAACCACACTGCCAAAGCTTTAC-3’進行酶切，下劃線為Hind III及EcoRI的酶切位點。

c)將步驟a)和b)中得到的帶有酶切位點的成熟的雙鏈miRNA-34以及酶切后的LITMUS 38i載體在T4DNA連接酶(Takara,日本)的作用下連接。

d)將步驟c)中連接成功的載體轉入大腸桿菌菌株HT115中。

以下實施例的大腸桿菌菌株HT115已于2016年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC No.13128。并且也可以從BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心購買獲得，菌株為CGC菌株為#4597，BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心的CGC菌株為#4597對外開放可通過公眾渠道購買獲得。

實施例1

1、把如SEQ ID NO.1的用于表達成熟miRNA-34的DNA序列構建到LITMUS 38i載體質粒上，構建成功的質粒轉入在37℃下培養的RNAse III缺陷型的大腸桿菌菌株HT115中，加入濃度為1mM的IPTTG誘導大量轉錄獲得miRNA-34，miRNA-34的堿基序列為SEQ ID NO.3；

通過Northern blot檢測miR-34在菌里的表達水平如圖1所示，圖中結果表明，構建成功的質粒轉入在37℃下培養的RNAse III缺陷型的大腸桿菌菌株HT115中，加入濃度為1mM的IPTTG可以誘導轉錄大量miR-34。

2、把步驟1)產生miRNA-34的菌體在60℃水浴下滅活約90min，把滅活的菌體拌入對蝦飼料中，拌入后每克蝦飼料中含有的菌個數是3×10¹²數量級，加入3％蝦飼料質量的魚餌飼料粘合劑；

3、均勻攪拌飼料后，在60℃烘箱中烘干1h，獲得對蝦飼料。

在持續3天喂食對蝦含有miR-34的對蝦飼料后，檢測miR-34在對蝦中的表達水平。對蝦體內的表達量結果如圖2所示，圖中顯示出miR-34在對蝦體內的表達量隨著喂食時間的延長而增加。

檢測獲得對白斑綜合征病毒(WSSV)復制的影響如圖3所示，圖中表明喂食對蝦含有miR-34的對蝦飼料后，可以顯著抑制白斑綜合征病毒(WSSV)的復制。

檢測獲得對對蝦死亡率的影響如圖4所示，圖中表明喂食對蝦含有miR-34的對蝦飼料后，可以顯著降低對蝦死亡率。

實施例2

1、用實施例1制備獲得的蝦飼料持續喂食對蝦，對蝦采用日本對蝦，是在27℃養殖；

2、喂食3-5天后收集對蝦肌肉，加熱2min后，拌入到裸鼠飼料中，對蝦肌肉與裸鼠飼料的質量比為1:1，烘箱中烘干約2-3h，完成獲得鼠飼料。

通過Northern blot檢測miR-34在對蝦肌肉里的表達水平如圖5所示，圖中顯示，用實施例1制備獲得的蝦飼料持續喂食對蝦3天后，日本對蝦體內的miR-34水平與直接注射miR-34的方法相比，可以更有效地使miR-34在對蝦體內表達水平升高。

3、檢測miR-34對乳腺癌細胞遷移的影響。

自裸鼠尾靜脈注射乳腺癌細胞開始，乳腺癌細胞采用MDA-MB-231，持續喂食加工后的裸鼠飼料(拌入miR-34過表達的對蝦肌肉的裸鼠飼料)，約5-7周。

裸鼠尾靜脈注射乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞個數為3×10⁵，MDA-MB-231是遷移能力較強的乳腺癌細胞，且動物實驗中把熒光素酶(luciferase)構建到MDA-MB-231細胞的基因組上。動物活體成像以及化學熒光信號結果如圖6所示，結果顯示miR-34能顯著抑制乳腺癌的遷移。

本發明涉及的遺傳序列如下：

SEQ ID NO.1：用于表達成熟miRNA-34的DNA序列第一璉

來源：人工合成

序列：5’-GTAAAGCTTTGGCAGTGTGGTTAGCTGGTTGTGAATTCCTG-3’

SEQ ID NO.2：用于表達成熟miRNA-34的DNA序列第二璉

來源：人工合成

序列：5’-CAGGAATTCACAACCAGCTAACCACACTGCCAAAGCTTTAC-3’

SEQ ID NO.3：miRNA-34的堿基序列

來源：miRNA-34

序列：5’-UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUGU-3’。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學

<120> 含有miRNA-34的飼料、制作方法及其抗病毒抗癌作用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtaaagcttt ggcagtgtgg ttagctggtt gtgaattcct g 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caggaattca caaccagcta accacactgc caaagcttta c 41

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> miRNA-34

<400> 3

uggcagugug guuagcuggu ugu 23