本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及紫檀芪在防治葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：葡萄和荔枝均是重要的經(jīng)濟作物，已成為許多農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展的支柱，但兩種果品都不易貯藏保鮮，發(fā)明新的保鮮劑或發(fā)展新保鮮技術(shù)以控制其采后病害在兩果品的采后增值和延長供應(yīng)期上將起到至關(guān)重要的作用。葡萄灰霉病是葡萄采后最重要的病害之一，病原菌為灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，可導(dǎo)致葡萄在銷售和低溫貯運過程中果實腐爛、脫粒。由荔枝霜疫霉病菌(PeronophythoralitchiChenexKoetal.)引起的霜疫霉病是荔枝采后貯藏保鮮中最主要的病害，在溫濕度適宜的條件下，病菌迅速侵染擴展，引起果皮的褐變、果肉腐爛并滲出酒酸味的汁液，嚴重限制了果實的采后貯運。目前對果實采后病害的控制主要以化學(xué)藥劑為主，但存在使用不當(dāng)造成農(nóng)藥殘留危及人類健康及易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險。因此，選擇對人、畜和有益生物安全，對生態(tài)環(huán)境無壓力的天然產(chǎn)物控制采后病害成為近年的研究熱點之一。紫檀芪(Pterostilbene:3,5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯)是一種重要的植物多酚，存在于紫檀木、越桔漿果和花生等植物中。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服有機合成農(nóng)藥在防治果實采后病害上的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種天然植物代謝產(chǎn)物紫檀芪在水果采后病害葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病防治方面的新用途。本發(fā)明的一個目的是提供紫檀芪或其溶液的如下用途：本發(fā)明提供了紫檀芪或其溶液抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了紫檀芪或其溶液抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)菌絲生長和/或孢子囊萌發(fā)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了紫檀芪或其溶液在防治荔枝霜疫霉病(Peronophythoralitchii)中的應(yīng)用；或紫檀芪或其溶液在防治采后果實感染荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述防治采后果實感染荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)體現(xiàn)在降低采后果實感染荔枝霜疫霉病菌病情指數(shù)和/或褐變指數(shù)；或所述果實為荔枝。本發(fā)明提供了紫檀芪或其溶液在抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了紫檀芪或其溶液在抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)菌絲生長和/或孢子萌發(fā)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了紫檀芪或其溶液在防治葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)中的應(yīng)用；或，紫檀芪在防治采后果實感染葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述防治采后果實感染葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)體現(xiàn)在降低采后果實感染葡萄灰霉病菌發(fā)病率和或病斑直徑；或所述果實為葡萄。本發(fā)明另一個目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為紫檀芪或紫檀芪溶液；所述產(chǎn)品具有如下1)-8)中至少一種功能：1)抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)；2)抑制荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)菌絲生長和/或孢子囊萌發(fā)；3)防治荔枝霜疫霉病(Peronophythoralitchii)；4)防治采后果實感染荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)；5)抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)；6)抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)菌絲生長和/或孢子萌發(fā)；7)防治葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)；8)防治采后果實感染葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)。上述中，所述紫檀芪溶液的溶質(zhì)為紫檀芪，溶劑為由濃度為50.0mmol/L、PH值為7.4的磷酸鹽緩沖液和濃度為1.0mol/L、PH值為13的NaOH水溶液按照體積比為9:1混合得到的混合液。通過對葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和荔枝霜疫霉病菌(Perononphythoralitchii)的體外抑菌活性實驗發(fā)現(xiàn)紫檀芪對兩種病原菌均有顯著的抑菌活性，另外通過紫檀芪顯著減少采后接種病原菌的葡萄和荔枝果實腐爛實驗證實了紫檀芪對葡萄灰霉病和荔枝霜疫霉病的防效，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。實際使用時，為了使紫檀芪在葡萄或荔枝表面可以很好的粘附，紫檀芪溶液可以添加一些保鮮常用的粘附劑。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明的紫檀芪物質(zhì)可用于葡萄和荔枝上兩種采后葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和荔枝霜疫霉病菌(Perononphythoralitchii)病害的防治，既可以單獨使用，也可以與其他抗菌劑聯(lián)合使用，以增強抗菌效果或降低其毒副作用，綠色、安全，有益于人體健康，符合食品安全要求，起到了防治灰霉病和霜疫霉病及對果品的保鮮作用。附圖說明圖1為紫檀芪對葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)菌絲生長的抑制作用。圖2為紫檀芪對采后葡萄果實灰霉病的防治效果；A無紫檀芪處理果實并接種病菌；B用100μg/mL紫檀芪處理果實后接種病菌；C用250μg/mL紫檀芪處理果實后接種病菌；D用500μg/mL紫檀芪處理果實后接種病菌；E用1000μg/mL紫檀芪處理果實后接種病菌；F用10000μg/mL紫檀芪處理果實后接種病菌。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、紫檀芪對葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌活性用菌絲生長速率法檢測：供試病原菌：葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea分離自發(fā)病的葡萄果實(RosslenbroichH,StueblerD.Botrytiscinerea-historyofchemicalcontrolandnovelfungicidesforitsmanagement[J].CropProtection.2000,19:557-561)，荔枝霜疫霉病菌Peronophythoralitchii(蔡學(xué)清，林娜，陳煒，等.荔枝霜疫霉的生物學(xué)特性[J].熱帶作物學(xué)報,2009,30(9):1226-1231)分離自發(fā)病的荔枝果實。主要試劑：紫檀芪購自百靈威科技有限公司，純度＞98％。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA用于培養(yǎng)葡萄灰霉病菌，胡蘿卜榨汁瓊脂培養(yǎng)基CA用于培養(yǎng)荔枝霜疫霉病菌。以菌絲生長速率法測定不同濃度紫檀芪對病原菌菌絲生長的抑制作用，具體操作：(1)用磷酸鹽緩沖液(PBS；50.0mmol/L,PH7.4，配方：若配制100mL，取80.0mL50.0mmol/LNa2HPO4與20.0mL50.0mmol/LKH2P04混勻即可)：NaOH水溶液(1.0mol/L,PH13)(體積比為9:1)作為溶劑溶解紫檀芪配置成母液；(2)分別準(zhǔn)確加入一定量所配制的紫檀芪母液至融化后降至50℃的PDA或CA培養(yǎng)基中混勻，使得培養(yǎng)基中紫檀芪的終濃度分別達到25、50、100和200μg/mL，每個濃度處理設(shè)置3個重復(fù)，以加入相同體積的溶劑作為對照，以15mL/皿的量倒入直徑9cm培養(yǎng)皿；(3)用滅菌打孔器在PDA上已活化培養(yǎng)5d的葡萄灰霉病菌的菌落邊緣或CA上已活化培養(yǎng)5d的荔枝霜疫霉病菌的菌落邊緣打菌齡一致的菌餅(d＝6mm)，并將菌餅反接入含有上不同濃度紫檀芪的培養(yǎng)基平板中央，置于22℃(葡萄灰霉病菌)或25℃(荔枝霜疫霉病菌)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(4)定期觀察記錄實驗結(jié)果。結(jié)果見圖1，紫檀芪對葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌均有顯著的抑菌效果，當(dāng)紫檀芪濃度達到200μg/mL時，對葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌率分別達到57.9％和70.1％。實施例2、紫檀芪對葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌活性孢子萌發(fā)法：病原菌孢子/孢子囊懸浮液的制備：分別將葡萄灰霉病菌和荔枝霜疫霉病菌于PDA或CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d，然后在平板中加入無菌水5mL進行沖洗和振蕩，配制孢子/孢子囊懸浮母液。向葡萄灰霉病菌孢子懸浮母液中加入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)，得到稀釋后葡萄灰霉病菌孢子懸浮液；向荔枝霜疫霉病菌孢子囊懸浮液中加入無菌水，得到稀釋后荔枝霜疫霉病菌孢子囊懸浮液；稀釋病原菌的孢子/孢子囊懸浮液至濃度為105個/mL。孢子萌發(fā)法測定的具體操作：(1)用磷酸鹽緩沖液(PBS；50.0mmol/L,PH7.4)：NaOH水溶液(1.0mol/L,PH13)(體積比為9:1)作為溶劑溶解紫檀芪配置成母液；(2)分別準(zhǔn)確加入一定量配制的紫檀芪母液至稀釋后的孢子/孢子囊懸浮液中充分混勻，使得孢子液中紫檀芪的終濃度分別達到10、20、30和40μg/mL，以加入相同體積的溶劑作為對照；(3)將各處理孢子液置于22℃(葡萄灰霉病菌)或25℃(荔枝霜疫霉病菌)的條件下培養(yǎng)；(4)定期觀察孢子/孢子囊的萌發(fā)情況，每個濃度處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)計數(shù)3個視野區(qū)域共約100個孢子/孢子囊，統(tǒng)計孢子/孢子囊的萌發(fā)率。試驗結(jié)果見表1所示：表1紫檀芪對葡萄灰霉病菌孢子和荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌發(fā)的抑制作用表1結(jié)果表明，紫檀芪對葡萄灰霉病菌孢子和荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌發(fā)的抑制效果明顯高于對照組，在10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL的紫檀芪濃度下對葡萄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制率分別達到20.4％、43.4％、93.3％和100％，對荔枝霜疫霉病菌孢子囊萌發(fā)的抑制率達到70.4％、100％、100％和100％，均呈現(xiàn)極強的抑菌活性。實施例3、紫檀芪對采后葡萄灰霉病(B.cinerea)的防效實驗供試材料：供試葡萄品種“馬奶”，購自市場。將單粒葡萄果實人工分離，留有果蒂，選取大小、形狀、成熟度一致的健康果粒于質(zhì)量百分含量2％的次氯酸鈉水溶液中消毒2min，然后用無菌水沖洗2次，晾干后分組處理。具體操作：(1)用無菌接種針在果實赤道位置刺出一個深度2mm，直徑為1.5mm的傷口；(2)在每個果實的傷口處分別接入10μL濃度為100、250、500、1000、10000μg/mL的紫檀芪溶液(磷酸鹽緩沖液(PBS；50.0mmol/L,PH7.4)：NaOH水溶液(1.0mol/L,PH13)(體積比為9:1)作為溶劑)，每個濃度處理設(shè)置3個重復(fù)，共接種60顆果實，以接入相同體積的溶劑作為對照；(3)室溫放置30min晾干果實后，在每顆果實的傷口處接種10μL濃度為5×104個/mL的葡萄灰霉病菌孢子懸浮液(配制方法同實施例2)；(4)將各濃度處理的果實分別置于塑料保鮮盒中，噴霧保濕，置于22℃貯藏；(5)貯藏6d和9d后，觀察并記錄果實的發(fā)病率及病斑直徑。實驗結(jié)果如表2和圖2所示：表2紫檀芪對采后葡萄果實灰霉病的防治效果實驗結(jié)果表明：紫檀芪對葡萄灰霉病有很好的防效，且隨著濃度的升高防效提高。供試濃度為500μg/mL時，貯藏9d后對果實發(fā)病率的抑制率達到36.12％，對病斑直徑的抑制效果高達51％。當(dāng)紫檀芪的濃度為10000μg/mL時即能完全抑制葡萄灰霉病的發(fā)生。實施例4、紫檀芪對荔枝采后霜疫霉病(P.litchii)的活體防效實驗供試材料：供試荔枝品種“淮枝”，采自廣東省從化市，采后即時運回實驗室進行處理。剪取果實并保留果蒂，選取大小、成熟度一致的健康果實進行實驗。具體操作：(1)用2％的次氯酸鈉溶液對荔枝果實進行表面消毒2min，用無菌水沖洗2次，晾干后分組處理；(2)將荔枝果實分別浸泡于200、400、800和1600μg/mL的紫檀芪溶液中，處理10min后取出室溫自然晾干，每個濃度處理設(shè)置3個重復(fù)，共接種60顆果實，以相同體積的溶劑處理果實作為對照；(3)在荔枝果皮的赤道位置接種10μL濃度為2×104個/mL的霜疫霉孢子囊懸浮液(配制方法同實施例2)；(4)將果實分別放入保鮮盒中噴霧保濕，置于25℃下培養(yǎng)；(5)觀察并記錄果實的病情指數(shù)和褐變指數(shù)。果實發(fā)病等級計算的標(biāo)準(zhǔn)為：0無明顯感染；1感染面積為果實的≤5％；3感染面積為果實的6％-15％；5感染面積為果實的16％-25％；7感染面積為果實的26％-49％；9感染面積為果實的≥50％。病情指數(shù)＝Σ(發(fā)病等級×相應(yīng)果實數(shù)量)/(9×果實總數(shù)量)×100。果實褐變等級計算的標(biāo)準(zhǔn)為：1無褐變；2輕微褐變；3褐變面積為果實的＜1/4；4褐變面積為果實的1/4–1/2；5感染面積為果實的＞1/2。褐變指數(shù)＝Σ(發(fā)病等級×相應(yīng)果實數(shù)量)/果實總數(shù)量。實驗結(jié)果如表3所示：表3紫檀芪對荔枝采后霜疫霉病的防治效果紫檀芪濃度(μg/mL)病情指數(shù)褐變指數(shù)對照64.263.1220055.562.7540042.222.6080033.332.53160028.152.20實驗結(jié)果表明：紫檀芪對荔枝霜疫霉病有較好的防效，且隨著紫檀芪濃度的升高防效提升。貯藏6d后，對照處理的果實整體病情指數(shù)高達64.26，紫檀芪濃度為200、400、800和1600μg/mL時，對荔枝果實發(fā)病的防效分別達到13.54％、34.30％、48.13％和56.19％。另外，紫檀芪能夠減緩果皮的褐變，延長果實的保鮮，提高其品質(zhì)(以上材料方法中已列舉出褐變等級的劃分，理論上若降低了荔枝果皮的褐變，則一定程度上提高了果實的保鮮和品質(zhì))。當(dāng)前第1頁1 2 3