專利名稱：高分子嵌段共聚物－藥物復合制劑的制作方法
本申請是國際申請號為PCT/JP96/02789，國際申請日為1996年9月26日的PCT國際申請進入中國階段后的國家申請號為96191130.1的中國專利申請的分案申請。
本發明涉及新穎的蒽環類化合物衍生物和含有這種衍生物的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑。
已知由放線菌的培養液獲得的柔紅霉素(英國專利1003383，美國專利3616242)、阿霉素(美國專利3590028，美國專利3803124)等是蒽環類(anthracycline)抗癌藥劑。它們對實驗腫瘤具有廣譜的抗實驗腫瘤性能，而且也廣泛用作癌癥化學治療藥。然而在另一方面，已知它們常引起嚴重的副作用，如白細胞減少癥、脫毛癥、心肌疾病等。
為了解決這個問題，曾提出了各種衍生物。例如，吡柔比星(通用名)通過在阿霉素糖部分的4’位引入一個四氫吡喃基而企圖減少其毒性。
同樣，表柔比星(通用名)是這樣一種化合物，在該化合物中使阿霉素糖部分的4’位羥基與α位連接，從而企圖減少其毒性。
然而，雖然這些藥與阿霉素相比具有較低的毒性，但還未完全解決其問題，如有限的總劑量等。
在另一方面，利用嵌段共聚物形成的高分子膠束改善微溶于水的藥物的溶解性是一種已知的技術。現已證明在日本專利申請(公開)2-300133、日本專利申請(公開)6-107565、日本專利申請(公開)5-955、日本專利申請(公開)5-124969、日本專利申請(公開)5-117385、日本專利申請(公開)6-206830、日本專利申請(公開)7-69900和日本專利申請(公開)6-206815中制得的高分子嵌段共聚物藥物復合制劑具有比阿霉素更好的抗癌作用。
本發明人曾對比現有高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑具有更高藥效和更低毒性的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑進行了深入的研究。結果完成了本發明。
因此，本發明涉及(1)蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物，這種化合物可通過堿處理使具有抗癌活性的蒽環類化合物互相直接化學鍵合而制得；
(2)上述第(1)項所述的蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物，其中蒽環類化合物至少含有選自阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式鹽的一種化合物；(3)蒽環類化合物的二聚物，這種二聚物可通過堿處理使阿霉素分子或其酸式鹽直接相互化學鍵接或者使阿霉素或其酸式鹽與柔紅霉素或其酸式鹽直接化學鍵接而制得；(4)上述第(1)、(2)或(3)項所述的蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物，其中蒽環類化合物的相互成鍵模式是席夫堿成鍵模式；(5)具有如下結構式(AA)的阿霉素二聚物 (6)通過堿處理使阿霉素分子或其酸式鹽相互直接化學鍵接而制得并具有如圖7所示質譜的阿霉素三聚物；(7)一種高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中具有親水聚合物片段和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成親水片段為外層的膠束，在其疏水內芯含有蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物，如有必要還含其它藥物；(8)如上述第(7)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物是上述第(1)、(2)、(3)、(4)、(5)或(6)項所述的蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物；(9)如上述第(7)或(8)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中高分子嵌段共聚物具有如下通式(1)或(2)的結構 式中R1表示氫原子或低級烷基，R2表示連接基團，R3表示亞甲基或亞乙基，R4獨立地表示羥基或具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基，R5表示氫原子或保護基團，n是5-1000之間的一個整數，m是2-300之間的一個整數，x是0-300之間的一個整數，前提是x不大于m；(10)如上述第(9)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中具有抗癌活性的蒽環類化合物殘基是用如下通式(3)表示的一個基團 式中Y表示-CH2OH或-CH3,Z表示H或 (11)如上述第(7)、(8)、(9)或(10)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中在由高分子嵌段共聚物形成的膠束內芯中含有2-60％重量的蒽環類化合物二聚物、三聚物或四聚物，以高分子嵌段共聚物為基準；(12)如上述第(7)、(8)、(9)、(10)或(11)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中蒽環類化合物二聚物、三聚物或四聚物是阿霉素的二聚物；(13)如上述第(7)、(8)、(9)、(10)、(11)或(12)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中在由高分子嵌段共聚物形成的膠束內芯中含有重量比為1∶0.5～20的蒽環類抗癌藥物和蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物；
(14)如上述第(13)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中蒽環類抗癌藥物和蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物重量比為1∶0.7～10；(15)如上述第(13)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中含有重量比為1∶1～5的蒽環類抗癌藥物和蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物；(16)如上述第(13)、(14)或(15)項所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中蒽環類抗癌藥物至少是選自阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式鹽的一個藥物；(17)一種高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中具有親水聚合物片段和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成親水片段為外層的膠束，并且在其疏水內芯含有蒽環類抗癌藥物，其特征在于當將該藥物制劑給7至9周齡CDF1小鼠靜脈注射時，如果注射制劑中蒽環類抗癌藥物的用量定為100，則注射1小時后1毫升鼠血漿中蒽環類抗癌藥物的含量為10(％劑量/毫升)或更多；(18)如上述第(17)項所述的藥物制劑，其中注射1小時后1毫升小鼠血漿中蒽環類抗癌藥物的含量為20-60(％劑量/毫升)；(19)如上述第(17)或(18)項所述的藥物制劑，其中蒽環類抗癌藥物至少是一種選自阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式鹽的藥物；(20)如上述第(7)至(19)中任一項所述的藥物制劑，其特征在于用于治療實體癌(solid cancer)。


圖1是阿霉素二聚物的紅外吸收光譜圖。
圖2是阿霉素二聚物的紫外光譜圖。
圖3是阿霉素二聚物的質譜圖。
圖4是可能具有式(4)結構的化合物的紅外吸收光譜圖，它是用酸處理阿霉素二聚物時與阿霉素一起產生的化合物。
圖5是可能具有式(4)結構的化合物的紫外光譜圖，它是用酸處理阿霉素二聚物時與阿霉素一起產生的化合物。
圖6是可能具有式(4)結構的化合物的質量色譜圖(m/z=560)，它是用酸處理阿霉素二聚物時與阿霉素一起產生的化合物。
圖7是阿霉素三聚物的質譜圖。
圖8、9、10或11分別是由實施例1(2)分離得到的組分的NMR分析得到的1H一維譜、13C一維譜、COSY譜或CH COSY譜。
圖12是柔紅霉素和阿霉素的二聚物的質譜圖。
圖13是實施例3中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖14是實施例4中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖15是實施例5中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖16是應用例1中小鼠給予鹽酸阿霉素后小鼠結腸(Colon)26腺癌的腫瘤生長曲線圖。
圖17是應用例1中小鼠給予實施例3中制得的藥物制劑后小鼠結腸(Colon)26腺癌的腫瘤生長曲線圖。
圖18是實施例6中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖19是實施例7中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖20是實施例8中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖21是實施例9中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖22是實施例10中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖23是實施例11中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖24是實施例12中制得的藥物制劑的高壓液相色譜圖。
圖25、26或27分別是應用例3中小鼠給予鹽酸阿霉素、實施例8中制得的藥物制劑或實施例12中制得的藥物制劑后小鼠結腸(Colon)26腺癌的腫瘤生長曲線圖。
以下詳細描述本發明。
根據本發明，能夠獲得具有比常規蒽環類抗癌藥物或現有高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑更高藥效和更低毒性的藥物制劑。
本發明中所用的具有抗癌活性的蒽環類化合物的例子包括阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式鹽。
制備本發明蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物的方法沒有特別限制，例如對具有抗癌活性的蒽環類化合物進行堿處理就可獲得所述的二聚物、三聚物或四聚物。堿處理時，通過相互直接化學鍵接(即不是用交聯劑的化學鍵接，而是通過蒽環類化合物的官能團間的反應形成的化學鍵接)可以得到蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物。
蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物可以通過使相同或不同化合物分子成鍵而制得。
所述的堿處理的例子有將蒽環類化合物溶解于一種溶劑中，然后加入堿的方法。只要能溶解所述的化合物，對所用的溶劑沒有特別的限定。它的例子包括水、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二噁烷、四氫呋喃(THF)、甲醇、乙腈以及它們的混合溶劑。
如果所加入的堿能溶解于所述的溶劑，而且加入堿后的溶液具有7-14的pH值，則對所加入的堿沒有限制，可以為任何一種無機堿、有機堿及其鹽。對堿的濃度也沒有特別的限制。所需堿的例子包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、具有2-20個碳原子的仲胺或叔胺、及其酸式加成鹽。堿處理時pH值為7-14，較好的為8-10。
如果溶液沒有凍結或沸騰，對堿處理的溫度沒有特別的限定，但優選的為0-50℃，更優選的為0-40℃。處理時間為1分鐘-120小時，較好的為10分鐘至24小時。
所得的蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物可以使用已知的純化技術進行提純。例如，可以通過凍干、沉淀等，或通過滲析交換溶劑或超濾后凍干、沉淀等獲得固體物質。當需要進一步提純所得固體物質時，可以使用薄層色譜、液相色譜等。
當將既有羰基結構取代基又有氨基的化合物用作蒽環類化合物，或將具有羰基結構取代基的化合物與另一種具有氨基的化合物組合使用時，通過上述的堿處理得到蒽環類化合物經席夫堿成鍵相互化學結合的二聚物、三聚物或四聚物。結果將既有羰基結構取代基又有氨基的化合物或者與有氨基的化合物結合使用具有羰基結構取代基的化合物作為蒽環類化合物，是令人滿意的。關于這一點，具有羰基結構取代基的例子包括可被羥基或鹵原子(如氟、氯、溴和碘原子)取代的具有2-5個碳原子的酰基；或可被羥基或鹵原子取代的具有3-10個碳原子的酰基烷基。
當用酸處理蒽環類化合物經席夫堿成鍵相互結合而形成的二聚物、三聚物或四聚物時，至少產生一種曾用作原料的蒽環類化合物。所述的酸處理的例子有將蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物溶解于溶劑中，并加入酸的方法。只要能溶解所述的化合物，對所用的溶劑沒有特別的限制。溶劑的例子包括水、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二噁烷、四氫呋喃(THF)、甲醇、乙腈以及它們的混合溶劑。任何一種無機酸(如鹽酸、硝酸、硫酸和磷酸)或有機酸(如甲酸、乙酸和三氟乙酸)都可用作所加入的酸。
酸處理時pH值較好的為2-4。如果溶液不凍結或沸騰，對酸處理的溫度也沒有特別的限制，但較好的為0-50℃，更好為20-40℃。處理時間為1分鐘-120小時，更好為24-72小時。
具有圖1中所示的紅外吸收光譜和圖2中所示的紫外光譜的阿霉素二聚物可以列舉為可通過上述堿處理使蒽環類化合物直接化學鍵接制得的本發明蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物。這種阿霉素二聚物也具有圖3所示的質譜。這種阿霉素二聚物具有上述結構式(AA)所示的結構。
紅外吸收光譜1676,1417,1217,1158cm-1；紫外光譜λmas=486nm；質譜(ESI),m/z(％):1067(100),964(10),938(15),921(13),653(20),524(20),506(50),488(98)。
關于這一點，用于測量這些光譜的儀器和測量條件如下。紅外吸收光譜用Perkin-Elmer Co.制造的System 2000以及溴化鉀壓片法測量。紫外光譜用HitachiCo.制造的U3200型分光光度計在甲醇溶液中測量。質譜用VG公司制造的QUATTRO 2質譜儀和電噴霧法測量。
用酸處理時，該阿霉素二聚物產生阿霉素以及可能具有如下式(4)所示結構的化合物 可能具有通式(4)結構的化合物的紅外吸收光譜、紫外光譜或質量色譜(m/z=560，用液相色譜/質譜(LC/MS)得到)分別表示在圖4、圖5或圖6中。
關于這一點，測量這些光譜和色譜所用的儀器和測量條件如下。紅外吸收光譜用測量圖1所示光譜所用的相同儀器和相同條件進行測量。紫外光譜用Hitachi公司制造的U3200型在芐醇溶液中進行測量。用LC/MS測量質量色譜的儀器和測量條件如下。
LC
柱C4.300埃/5微米，Waters Co.制造；洗脫劑乙腈/0.1％三氟乙酸+0.05％MS7(MS7；Gasukuro Kogyo Co.制造)；梯度洗脫時間(分)0 202530353640乙腈濃度(％)22405090902222流速1毫升/分MS:VG公司制造的QUATTRO 2(電噴霧法)。
具有圖7中所示的質譜，而且當用酸處理時能產生阿霉素的阿霉素三聚物可以列舉作為本發明的另一種可用上述堿處理方法使蒽環類化合物直接化學結合而得到的蒽環類化合物二聚物、三聚物或四聚物的例子。
本發明高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑中所用的高分子嵌段共聚物的親水聚合物片段的結構可以包括聚乙二醇、多糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、脫乙酰殼多糖等的結構，雖然只要具有親水聚合物的結構，對此并沒有特別的限定。特別優選的結構是聚乙二醇結構。
疏水高聚物片段的結構可以包括聚苯乙烯、聚氨基酸(聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚賴氨酸等)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚馬來酸、或其衍生物或其鹽等的結構，雖然只要具有疏水聚合物的結構，對此并沒有特別的限定。其中聚氨基酸、其衍生物或其鹽是優選的，聚天冬氨酸、聚谷氨酸、其衍生物或其鹽是特別優選的。雖然沒有特別的限定，所述鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽等。
聚氨基酸結構的衍生物例子包括芳族胺、脂族胺、芳族醇、脂族醇、芳族硫醇、脂族硫醇之類的疏水化合物被連接到其側鏈上的衍生物，只要疏水基團能連接到側鏈上，并使聚氨基酸片段具有疏水性，對連接到側鏈上的疏水基團并沒有特別的限制。優選的衍生物是具有芳環的胺被連接到側鏈上的聚天冬氨酸或聚谷氨酸衍生物。
高分子嵌段共聚物的優選例子包括具有用通式(1)或(2)表示的上述化學結構的高分子嵌段共聚物。
在上述通式(1)或(2)中，R1表示氫或低級烷基，其中低級烷基的例子是具有1-3個碳原子的烷基，優選的為甲基。
用R2表示的連接基團具有與在聚乙二醇片段末端處形成聚氨基酸片段所用的方法和化合物相應的結構，以便將形成聚乙二醇片段的化合物末端轉化為適于上述形成過程的結構。它的例子包括具有1-8個碳原子的亞烷基，如亞甲基、亞乙基、1,2-亞丙基、1,3-亞丙基和亞異丁基，其中1,3-亞丙基是優選的。
R3表示亞甲基、亞乙基，優選的是亞甲基。
R4獨立地表示羥基或具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基。各種殘基可用作具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基，對此沒有特別的限定，可優選使用通式(3)表示的基團。用通式(3)表示的基團的示意性例子包括阿霉素殘基、柔紅霉素殘基、吡柔比星殘基和表柔比星殘基。
雖然R4獨立地表示羥基或具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基，但至少一部分，較好的為5-80％高分子嵌段共聚物中存在的所有R4基團宜為具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基，更好的為20-60％的高分子嵌段共聚物中存在的R4基團為上述蒽環類化合物的殘基。
雖然R4獨立地表示羥基或具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基，但具有蒽骨架或蒽醌骨架的基團，如日本專利申請(公開)6-206830中所揭示的具有蒽骨架或蒽醌骨架的取代基，可用于代替上述蒽環類化合物的殘基。
R5表示氫或保護基團，其中脂族或芳族酰基可列舉為保護基團。雖然沒有特別的限定，但保護基團可用已知的方法引入，如用酸酐進行的方法或用酰鹵進行的方法。氫原子或乙酰基適用作R5。
另外，n為5-1000，較好的為15-400,m為2-300，較好的為10-100,x為0-300，較好的為0-100。
高分子嵌段共聚物的分子量較好的為1000-100000，更好的為5000-50000，雖然當嵌段共聚物可溶于水時對分子量并沒有特別的限定。只要本發明藥物制劑能保持水溶解性，對高分子嵌段共聚物中親水聚合物片段與疏水聚合物片段之比沒有特別限定，但較好的為1∶0.1～10(重量)，更好的為1∶0.1～5(重量)。
雖然可包含在高分子嵌段共聚物膠束內芯的除蒽環類化合物二聚物、三聚物或四聚物以外的藥物并不一定是必要組分，但它的例子包括阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星、氨甲蝶呤、絲裂霉素、依托泊甙、順鉑及其衍生物之類的抗癌藥物。其中蒽環類抗癌藥物是優選的，阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星或其酸式鹽是特別優選的。
高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑中蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物的含量較好為1-100％重量，更好為2-60％重量(以高分子嵌段共聚物為基準)。然而，只要不損害高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑的膠束形成能力，二聚物、三聚物或四聚物盡可能大的用量是沒有問題的。
高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑中蒽環類化合物二聚物、三聚物或四聚物以外的其它藥物的含量較好為0-100％重量，更好為2-60％重量，以高分子嵌段共聚物為基準。然而，只要不損害高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑的膠束形成能力，所述其它藥物盡可能大的用量是沒有問題的。
當高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑含有“蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物以外的藥物”時，“蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物以外的藥物”與“蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物”的重量比一般為1∶0.05～100，較好的為1∶0.5～20，更好的為1∶0.7～10，最好的為1∶1～5。
雖然對高分子嵌段共聚物膠束內芯所含的蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物沒有特別限定，但上述第(1)至(6)項中所述的蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物是適宜的。膠束內芯中可只含這些二聚物、三聚物或四聚物中的一種，或膠束內芯中可含這些二聚物、三聚物或四聚物中的兩種或多種。
制備高分子嵌段共聚物的方法是已知的，例如它可用如下方法制備，即可使構成親水聚合物片段的化合物(如聚乙二醇、多糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、脫乙酰殼多糖等或其衍生物)或其末端改性的產物與構成疏水聚合物片段的聚合物化合物反應，或使構成親水聚合物片段的化合物或其末端改性產物與可聚合單體反應，然后如有必要，進行衍生物形成反應之類的化學反應。
當疏水聚合物片段具有聚合的羧酸結構時，衍生物形成反應的例子可以列舉為與疏水化合物的反應，以提高其疏水性。疏水化合物形成酯鍵、酰胺鍵等，并由此連接到高分子嵌段共聚物上。這些反應可用酯化、酰胺化之類的常規已知方法進行。例如，當疏水化合物用酰胺鍵連接到具有親水聚合物片段和聚合物羧酸片段的高分子嵌段共聚物(原料共聚物)上時，可按稱為肽鍵形成方法的常規方法進行反應。例如，可用酰鹵法、酸酐法或偶合法等，其中使用縮合劑的偶合法是適宜的。對于縮合劑，可以使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)、鹽酸1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC·HCl)、二環己基碳化二亞胺(DCC)、羰基咪唑(CDI)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(EEDQ)、二苯基磷酰疊氮(DPPA)等。縮合劑的用量較好為0.5-20摩爾/摩爾疏水化合物，更好為1-10摩爾/摩爾疏水化合物。在這種情況下，可讓N-羥基丁二酰亞胺(HONSu)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亞胺(HONB)等共存。
當進行將疏水化合物連接到原料共聚物上的反應時，對疏水化合物的用量沒有特別的限定，但它的用量一般為0.1-2摩爾(以1當量原料共聚物中的羧基為基準)。
縮合反應宜在溶劑中進行。例如，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二噁烷、四氫呋喃(DMF)、水或其溶劑混合物可用作溶劑，對此沒有特別的限定。雖然沒有特別的限定，但溶劑的用量一般比原料共聚物的重量多1-500倍。
縮合反應較好在-10-50℃，更好在-5-40℃的溫度下進行。當反應進行2-48小時時，該反應可能已充分。
本發明高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑例如可用如下方法制備。在第一種方法中，將所得的高分子嵌段共聚物溶解在一種溶劑中。所用溶劑的例子可包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二噁烷、四氫呋喃(DMF)、水或其溶劑混合物等。其中DMF或DMF和水的混合溶劑是優選的。這種溶液中蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物的加入量為1-200％(重量)(以高分子嵌段共聚物為基準)，并將混合物攪拌。當借助于滲析、超濾等方法用水代替混合物溶液中的溶劑后，得到所需的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑。當也包含其它藥物時，可將其與蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物一起加入，其用量為為1-200％(重量)(以高分子嵌段共聚物為基準)。
在第二種方法中，通過同時進行蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物的合成和將其引入高分子嵌段共聚物中，也可制備高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑。例如，將高分子嵌段共聚物溶解于一種溶劑中，所用溶劑的例子可包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、二噁烷、四氫呋喃(DMF)、水或其溶劑混合物等。其中DMF或DMF和水的混合溶劑是優選的。將蒽環類化合物或其鹽(如上述蒽環類抗癌藥物)溶解于該溶液中，加入堿，然后加以攪拌。當借助于滲析、超濾等方法用水代替混合物溶液中的溶劑后，得到所需的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑。
在第二種方法中，高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑中蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物與其它藥物的組分比可用如下方法進行控制。例如，所得高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑中蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物與蒽環類化合物(蒽環類抗癌藥物)的組分比可通過改變蒽環類化合物或其鹽(蒽環類抗癌藥物)的加入量(以高分子嵌段共聚物為基準)，或改變pH值來加以控制。
本發明也涉及高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中具有親水聚合物片段和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成以親水片段為外層的膠束，在其疏水內芯含有蒽環類抗癌藥物，其特征在于當將該藥物制劑給7至9周齡的CDF1小鼠靜脈注射時，如果注射制劑中蒽環類抗癌藥物的用量定為100，則注射1小時后1毫升小鼠血漿中蒽環類抗癌藥物的含量為10(％劑量/毫升)或更多，優選的為20-60。
在膠束內芯中含有蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物以及蒽環類抗癌藥物的上述高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑可被列舉為這種藥物制劑。
當將一種市售的現有抗癌藥物(如阿霉素)靜脈注射到人體中時，它的血濃度(bloodlevel)在極短的時間內就會減少。與之相反，當靜脈注射本發明的藥物制劑時，它的血濃度在較長的時間內維持在一個高的水平，結果蒽環類抗癌藥物可被大量進入到腫瘤組織中。因此，可有效地治療癌癥。
當本發明的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑用作抗癌藥物時，具有高的藥理作用。例如，劑量幾乎相同時，它的抗癌活性比阿霉素高得多。具體地說，它可顯示使實體癌癥消失的顯著作用。因此，對治療患肺癌、消化系統癌癥、乳腺癌、膀胱癌、骨原性肉瘤之類的固體癌的病人特別有效。另外，本發明的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑的降低毒性的良好效果。
本發明的藥物制劑可按常規所用的不同劑型進行使用，如固體配方、軟膏、液體配方等。這些配方可通過將本發明的藥物制劑與載體、填充劑、稀釋劑、增溶劑之類的藥物上可接受的添加劑混合而制得。而且當用作抗癌藥物時，一般使用注射劑型，該劑型較好含有99.99-1％的添加劑(以總的配方為基準)。用蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物和其它藥物的總量表示，它的劑量約為10-200mg/m2/周。每周分1-3次給予。
這種阿霉素二聚物具有上述的紅外吸收光譜、紫外光譜和LC/MS質譜。用1％乙酸處理所得的阿霉素二聚物。所得產物的質譜圖表示在圖6中。
關于這一點，HPLC分離和純化以及測量光譜和色譜所用的儀器和條件同前所述。
(2)將500毫克鹽酸阿霉素溶解于由40毫升DMF和40毫升甲醇組成的混合溶劑，在此溶液中加入1.2毫升三乙胺，并讓其在25℃反應12小時。反應溶液用填充在內徑為26毫米，長度為65厘米的玻璃管中的350毫升LH-20(Pharmacia制造)制得的柱提純。在柱提純過程中，甲醇用作流動相。甲醇的流速為5毫升/分。按每份5毫升收集洗脫液，合并第11份至第25份洗脫液，蒸發至干，用質譜儀分析確定已形成阿霉素的二聚物。高分辨質譜分析的結果表明，它的分子式為C54H54N2O21。
將這樣獲得的10毫克阿霉素二聚物溶解在2毫升甲醇中，在此溶液中加入1毫克NaBH3CN，讓其在室溫下反應12小時，與3毫升1N鹽酸混合，然后再反應12小時。反應溶液用LC/MS進行分析，分離m/z524的峰后，用NMR進行分析。NMR分析得到的1H一維譜表示在圖8,13C一維譜表示在圖9,COSY譜表示在圖10，以及CH COSY譜表示在圖11。
在這些結果的基礎上，確定該化合物是具有式(AA)結構的阿霉素二聚物。
(3)將500毫克鹽酸阿霉素溶解于由40毫升DMF和40毫升甲醇組成的混合溶劑中，在此溶液中加入1.2毫升三乙胺，并讓其在25℃反應12小時。反應溶液用填充在內徑為26毫米，長度為65厘米的玻璃管中的350毫升LH-20(Pharmacia制造)制得的柱提純。在柱提純過程中，甲醇用作流動相。甲醇的流速為5毫升/分。按每份5毫升收集洗脫液，合并第5份至第9份洗脫液，蒸發至干，用質譜儀分析得到圖7所示的質譜。該結果確證了阿霉素三聚物的形成。
在這些產物中，阿霉素二聚物顯示與上述相同的質譜。柔紅霉素和阿霉素二聚物的質譜表示在圖12中。在這些反應條件下，沒有形成柔紅霉素二聚物。關于這一點，獲得這些譜所用的儀器和條件與上述相同。
柔紅霉素和阿霉素二聚物的質譜(ESI),m/z(％):1051(90),948(15),922(20),904(10),653(20),524(30),506(50),488(100)。
HLPC的測量條件如下。
柱C4.300埃/5微米，Waters Co.制造；洗脫劑乙腈/1％乙酸+40mM十二烷基硫酸鈉；梯度洗脫時間(分)0 4 12253031乙腈濃度(％)153535858515檢測485納米流速1毫升/分。
表1對小鼠結腸26腺癌的抗腫瘤活性
表2化療指數的比較
1)初次給予藥后，在第14天T/C為42％或更小時的最小劑量2)化療指數LD50/(最小T/C42)
在65毫升DMF中溶解103.5毫克實施例1(2)制備的阿霉素二聚物和49.1毫克阿霉素鹽酸鹽，所得溶液與實施例8制備的含12毫克/毫升(按阿霉素計)的PEG-P(Asp.)ADR的水溶液23毫升混合，在暗處室溫下攪拌該混合物2小時。用滲析膜(分子量截留值=12,000-14,000)滲析后，用超濾膜ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)進行提純和濃縮。用0.45微米的濾器進一步過濾，獲得14.9毫升嵌段共聚物-藥物復合制劑的水溶液。發現獲得的水溶液具有圖23所示的HPLC色譜圖。圖中，峰1是阿霉素，峰2是阿霉素的二聚物，寬峰3是連接在聚合物上的阿霉素。阿霉素(峰1)的濃度為1.13毫克/毫升，阿霉素二聚物(峰2)的濃度為2.76毫克/毫升。阿霉素與阿霉素二聚物的重量比為1∶2.44。HPLC測定條件按實施例3所述。
表3周期變化(％劑量/毫升)(血漿)
(A)阿霉素鹽酸鹽(B)實施例6的藥劑(C)實施例7的藥劑表4周期變化(％劑量/克)(腫瘤)
(A)阿霉素鹽酸鹽(B)實施例6的藥劑(C)實施例7的藥劑表5周期變化(％劑量/克)(心臟)
(A)阿霉素鹽酸鹽(B)實施例6的藥劑(C)實施例7的藥劑表6對小鼠結腸26腺癌的抗腫瘤活性
(*僅第一次給藥)表7周期變化(％劑量/毫升)(血漿)
(A)實施例8的藥劑(B)實施例9的藥劑(1)阿霉素(2)阿霉素二聚物表8周期變化(％劑量/克)(腫瘤)
(A)實施例8的藥劑(B)實施例9的藥劑(1)阿霉素(2)阿霉素二聚物表9周期變化(％劑量/毫升)(血漿)
(2)阿霉素二聚物表10周期變化(％劑量/克)(腫瘤)
(A)實施例8的藥劑(B)實施例10的藥劑(C)實施例12的藥劑(1)阿霉素(2)阿霉素二聚物通過在嵌段共聚物的膠束的內芯加入抗癌藥等，賦予本發明含有二、三、四聚物的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑以較高的藥效和較低的毒性。因而本發明可提供顯著有效的藥物制劑。
權利要求
1．一種高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于具有親水聚合物片段和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成親水片段為外層的膠束，在其疏水內芯含有蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物，如有必要還含其它藥物。
2．如權利要求1所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于通過用堿處理使具有抗癌活性的蒽環類化合物直接相互化學結合可制得蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物。
3．如權利要求2所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于所述的蒽環類化合物至少包括一種選自阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式鹽的化合物。
4．如權利要求1所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于通過用堿處理使阿霉素分子或其酸式鹽直接化學相互結合或者使阿霉素或其酸式鹽與柔紅霉素或其酸式鹽直接化學相互結合可制得蒽環類化合物的二聚物。
5．如權利要求2所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于蒽環類化合物的相互結合模式是席夫堿鍵合模式。
6．如權利要求4所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于所述的二聚物具有如下結構式(AA)
7．如權利要求2所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于通過用堿處理使阿霉素分子或其酸式鹽直接相互化學結合可制得阿霉素的三聚物，所述的三聚物具有圖7所示的質譜。
8．如權利要求2所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于高分子嵌段共聚物具有如下通式(1)或(2)的結構 式中R1表示氫原子或低級烷基，R2表示連接基團，R3表示亞甲基或亞乙基，R4獨立地表示羥基或具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基，R5表示氫原子或保護基團，n是5-1000之間的一個整數，m是2-300之間的一個整數，x是0-300之間的一個整數，前提是x不大于m。
9．如權利要求8所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于具有抗癌活性的蒽環類化合物的殘基是用如下通式(3)表示的基團 式中Y表示-CH2OH或-CH3,Z表示H或
10．如權利要求1所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于在由高分子嵌段共聚物形成的膠束內芯中以高分子嵌段共聚物為基準含有2-60％重量的蒽環類化合物二聚物、三聚物或四聚物。
11．如權利要求1所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于在由高分子嵌段共聚物形成的膠束內芯中含有重量比為1∶0.5～20的蒽環類抗癌藥物和蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物。
12．如權利要求11所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于蒽環類抗癌藥物和蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物的重量比為1∶0.7～10。
13．如權利要求11所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于蒽環類抗癌藥物和蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物的重量比為1∶1～5。
14．如權利要求11所述的高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其特征在于蒽環類抗癌藥物至少是一種選自阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式鹽的藥物。
15．一種高分子嵌段共聚物-藥物復合制劑，其中具有親水聚合物片段和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成親水片段為外層的膠束，并且在其疏水內芯含有蒽環類抗癌藥物，其特征在于當將該藥物制劑給7至9周齡CDF1鼠靜脈注射時，如果注射制劑中蒽環類抗癌藥物的用量定為100，則注射1小時后1毫升小鼠血漿中蒽環類抗癌藥物的含量為10(％劑量/毫升)或更多。
16．如權利要求15所述的藥物制劑，其特征在于注射1小時后1毫升小鼠血漿中蒽環類抗癌藥物的含量為20-60(％劑量/毫升)。
17．如權利要求15所述的藥物制劑，其特征在于蒽環類抗癌藥物至少是一種選自阿霉素、柔紅霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式鹽的藥物。
18．如權利要求1-17中任一項所述的藥物制劑，其特征在于它用于治療實體癌癥。
全文摘要
本發明公開可用堿處理使具有抗癌活性的蒽環類化合物直接相互化學結合而制得的蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物,以及一種高分子嵌段共聚物－藥物復合制劑,其中具有親水聚合物片段和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成以親水片段為外層的膠束,在其疏水內芯含有蒽環類化合物的二聚物、三聚物或四聚物,如有必要還含其它藥物。上述的藥物制劑具有高的藥效和低的毒性。
文檔編號A61K9/51GK1288728SQ0012190
公開日2001年3月28日 申請日期2000年7月11日 優先權日1995年9月29日
發明者櫻井靖久, 橫山昌幸, 片岡一則, 岡野光夫, 福島重人, 植原隆治, 阿久津智子, 岡本一也, 真柴洋子, 町田芽久美, 清水和久 申請人:科學技術振興事業團, 櫻井靖久, 日本化藥株式會社