專利名稱：一種雙歧桿菌微膠囊及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于益生菌制品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙歧桿菌微膠囊及其制備方法。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌是人和動物腸道內(nèi)重要的益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提供營養(yǎng)、降低膽固醇和抗癌等特性。然而它專性厭氧，對氧氣、PH、溫度、濕度等外界不良環(huán)境極為敏感，在生產(chǎn)、貯存和運輸過程中很難保持活性；而且干菌粉經(jīng)口服食用時，無法耐受低pH值的胃酸、膽鹽等環(huán)境，難以保證有大量的存活菌到達腸道而定殖于腸粘膜上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能有效延長雙歧桿菌保藏期的雙歧桿菌微膠囊及其制備方法，解決了液體雙歧桿菌制劑中活菌含量大幅度下降及不耐胃酸的問題。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是；
一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)
步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；
步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g膠原蛋白、11. 50 g糖類物質(zhì)和 4.65 mL甘油，其余為蒸餾水；
步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為50-100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；
步驟四向質(zhì)量分數(shù)為的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 (3-5)，混合均勻后得到菌膠混合液；
步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30 分鐘；
步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥。所述的步驟二中，膠原蛋白為動物源膠原蛋白或類人膠原蛋白； 所述的步驟二中，糖類物質(zhì)為海藻糖或蔗糖。所述的步驟五中，乳化的攪拌速度為300-500 rpm/min,乳化時間為5_15分鐘， CaCl2溶液的加入速度為20 mL/s。所述的步驟六中，離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；
所述的步驟六中，真空冷凍干燥的條件為-20°C預(yù)凍2小時，然后在-50°C、真空度為50-100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12小時。所述的一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)
步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；
步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g類人膠原蛋白、11. 50 g海藻糖、 以及4. 65 mL甘油，其余為蒸餾水；
步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為75毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；
步驟四向質(zhì)量分數(shù)為1. 5%的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 4，混合均勻后得到菌膠混合液；
步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30 分鐘；乳化的攪拌速度為400 rpm/min,乳化時間為10分鐘，CaCl2溶液的加入速度為20 mL/s ；
步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥；離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；真空冷凍干燥的條件為-20°C預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為75毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12小時。如所述的一種雙歧桿菌微膠囊。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
本發(fā)明的雙歧桿菌微膠囊具有耐胃酸性、耐膽鹽性和腸溶性的優(yōu)點，菌體的存活率高， 制備方法簡單，實用性強，便于工業(yè)化大生產(chǎn)；微膠囊的貯藏穩(wěn)定性良好，解決了益生菌制劑保藏期短的問題。


圖1為雙歧桿菌微膠囊人工胃液的耐受性測試結(jié)果。圖2為菌粉人工膽鹽的耐受性測試結(jié)果。圖3為雙歧桿菌微膠囊人工膽鹽的耐受性測試結(jié)果。圖4為雙歧桿菌微膠囊人工腸液的腸溶性測試結(jié)果。圖5為常溫下貯藏一年對雙歧桿菌微膠囊活菌數(shù)的影響結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細的說明。真空冷凍干燥技術(shù)是制備高效活性制劑的重要方法之一。該過程中，保護劑的添加可以改變凍干過程中樣品的物化性質(zhì)，為菌體提供一個骨架結(jié)構(gòu)，保持菌體原有的生化特征和生物活性。甘油、蔗糖、海藻糖和L-半胱氨酸已經(jīng)被證實可以用來提高益生菌的存活率。膠原蛋白作為一種新型蛋白，具有良好的生物相容性，而且經(jīng)基因工程改性過的膠原蛋白具有良好的水溶性特性，不但能為凍干粉末提供一種多孔結(jié)構(gòu)，而且能使溶液呈過冷狀態(tài)，即在零度以下的相同溫度下溶質(zhì)的濃度減小，蛋白質(zhì)的鹽析變性減少，相比大豆蛋白更具優(yōu)勢。本發(fā)明所涉及的一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，由以下步驟實現(xiàn)
步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；
步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g動物源膠原蛋白或類人膠原蛋白、11. 50 g海藻糖或蔗糖、以及4. 65 mL甘油，其余為蒸餾水；
步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為50-100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；
步驟四向質(zhì)量分數(shù)為的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 (3-5)，混合均勻后得到菌膠混合液；
步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30 分鐘；乳化的攪拌速度為300-500 rpm/min，乳化時間為5_15分鐘，CaCl2溶液的加入速度為 20 mL/s ；
步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥；離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；真空冷凍干燥的條件為_20°C預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為50-100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12 小時。在上述條件下，粒徑分布在100-500 μ m的微膠囊的百分含量為78. 3%，且平均粒徑為402. 834 μ m。通過掃描電鏡觀察，微膠囊的形態(tài)基本呈球形，表面結(jié)構(gòu)均勻完整，沒有破損、孔洞和裂縫現(xiàn)象。以下為本發(fā)明所涉及的一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法的具體實施例 實施例一
步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；
步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g動物源膠原蛋白、11. 50 g海藻糖、以及4. 65 mL甘油，其余為蒸餾水；
步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為50毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；
步驟四向質(zhì)量分數(shù)為1%的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 3，混合均勻后得到菌膠混合液；
步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30 分鐘；乳化的攪拌速度為300 rpm/min,乳化時間為5分鐘，CaCl2溶液的加入速度為20 mL/ s ；步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥；離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；真空冷凍干燥的條件為-20°C預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為50毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12小時。實施例二
步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；
步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g類人膠原蛋白、11. 50 g海藻糖、 以及4. 65 mL甘油，其余為蒸餾水；
步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為75毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；
步驟四向質(zhì)量分數(shù)為1. 5%的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 4，混合均勻后得到菌膠混合液；
步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30 分鐘；乳化的攪拌速度為400 rpm/min,乳化時間為10分鐘，CaCl2溶液的加入速度為20 mL/s ；
步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥；離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；真空冷凍干燥的條件為-20°C預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為75毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12小時。實施例三
步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；
步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g類人膠原蛋白、11. 50 g蔗糖、 以及4. 65 mL甘油，其余為蒸餾水；
步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；
步驟四向質(zhì)量分數(shù)為m的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 5，混合均勻后得到菌膠混合液；
步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30 分鐘；乳化的攪拌速度為500rpm/min，乳化時間為10分鐘，CaCl2溶液的加入速度為20 mL/ s ；
步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥；離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；真空冷凍干燥的條件為_20°C預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12小時。以下為雙歧桿菌微膠囊的功能特性實驗 1、耐胃酸性
將1 g微膠囊置于9 mL的人工胃液中，人工胃液PH值為2.0，37°C厭氧處理，分別于 0,0. 5、1、2、3小時后收集微膠囊，并進行活菌計數(shù)，分析微膠囊對人工胃液的耐受情況，同時以未經(jīng)包埋的凍干菌粉進行對照。實驗結(jié)果表明，菌粉和微膠囊在pH 6. 5的條件下處理 3 h后，活菌含量基本不變。然而，當處于pH 2.0的人工胃液中時，活菌含量逐漸降低，而且隨著處理時間的延長，菌粉中的活菌數(shù)要比微膠囊下降的多。分析其原因可能是菌粉中的雙歧桿菌直接暴露于胃液環(huán)境中，遭受胃酸的破壞而死亡；海藻酸鈉微膠囊在胃液中很難溶解，可以減少菌體的釋放量，而且菌體周圍的凝膠體系能夠為細胞提供一個強有力的屏障，增大胃酸的穿透阻力，達到保護細胞的目的。之所以開始時間段內(nèi)，活菌含量有所下降，是由于少量沒有被包裹完全的微膠囊發(fā)生滲漏或者微膠囊表面附著有游離菌體的緣故。由此可見，制得的雙歧桿菌微膠囊在人工胃液中性質(zhì)較穩(wěn)定，可以較好的保護菌體免受胃酸的傷害，可以以較高的活性狀態(tài)到達腸道順利定殖。結(jié)果見圖1。2、耐膽鹽性 分別配制質(zhì)量分數(shù)為0%、1%和洲的膽鹽溶液模擬人工膽鹽，將1 g微膠囊置于9 mL
不同濃度的膽鹽溶液中，37°C厭氧處理3小時和12小時后收集微膠囊，并進行活菌計數(shù)， 分析微膠囊對人工膽鹽的耐受情況，同時以未經(jīng)包埋的凍干菌粉進行對照。實驗結(jié)果表明， 當膽鹽濃度為1%時，處理12 h后，微膠囊中的活菌數(shù)為3. 16 X IO8 cfu/ml，明顯高于菌粉的活菌數(shù)1.52 X IO7 cfu/ml，其結(jié)論與洲的膽鹽條件相同。可見，雙歧桿菌經(jīng)微膠囊化后，可以提高菌體對高濃度膽鹽的耐受程度。結(jié)果見圖2和圖3。3、腸溶性
將1 g微膠囊置于9 mL的人工腸液中，人工腸液的pH值為6.8，37°C厭氧處理，崩解破碎后稀釋，并進行活菌計數(shù)，分析微膠囊在人工腸液中的腸溶情況。實驗結(jié)果表明，微膠囊在人工腸液中處理15分鐘后開始迅速釋放菌體，30分鐘后基本保持不變，釋放率可達 80. 5%，而且經(jīng)人工觀察，30分鐘后已無固體顆粒存在，可斷定該微膠囊在人工腸液中已基本崩解完全，該法制得的微膠囊具有較好的腸溶性，能夠使雙歧桿菌從海藻酸鈉體系中釋放出來，從而發(fā)揮益生功能。結(jié)果見圖4。4、常溫貯藏特性
將雙歧桿菌菌液、凍干菌粉和微膠囊在恒溫37°C、相對濕度為60-65%的條件下儲存3 個月，不同時間段內(nèi)取樣，研究菌體在此過程中的存活情況。實驗結(jié)果表明，菌液中的雙歧桿菌在貯存30天后就已全部死亡，可看出沒有經(jīng)過任何處理的雙歧桿菌菌液常溫下難以儲存，這也證實了液體制劑中的活菌含量在儲藏過程中會大幅度下降這一現(xiàn)象。對于凍干菌粉而言，由于添加了各類保護劑，使得活菌含量比菌液下降的慢，當37°C儲存25天后活菌含量基本無法滿足市售商品的最低標準。相比之下，凍干的微膠囊儲存90天后，活菌含量雖然下降了 3個數(shù)量級，但活菌數(shù)仍然大于IO6 cfu/g，為1.12 X IO7 cfu/g，高于腸道中定殖的最小濃度。由此可見，本實驗制得的微膠囊能夠在常溫條件下儲存一年以上。結(jié)果見圖5。
權(quán)利要求
1.一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g膠原蛋白、11. 50 g糖類物質(zhì)和 4.65 mL甘油，其余為蒸餾水；步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為50-100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；步驟四向質(zhì)量分數(shù)為的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 (3-5)，混合均勻后得到菌膠混合液；步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30 分鐘；步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于 所述的步驟二中，膠原蛋白為動物源膠原蛋白或類人膠原蛋白；所述的步驟二中，糖類物質(zhì)為海藻糖或蔗糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于所述的步驟五中，乳化的攪拌速度為300-500 rpm/min，乳化時間為5_15分鐘，CaCl2 溶液的加入速度為20 mL/s。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于 所述的步驟六中，離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；所述的步驟六中，真空冷凍干燥的條件為-20°C預(yù)凍2小時，然后在-50°C、真空度為 50-100毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雙歧桿菌微膠囊的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)步驟一在37°C的溫度條件下，將活化的雙歧桿菌在液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)M小時， 離心收集菌體，用0. 85%的生理鹽水洗滌制備菌懸液；步驟二制備保護劑，每1000 mL保護劑添加有1.23 g類人膠原蛋白、11. 50 g海藻糖、 以及4. 65 mL甘油，其余為蒸餾水；步驟三將經(jīng)過滅菌處理的保護劑與菌懸液按2:1的體積比混合均勻，靜置30分鐘， 在-20°C的溫度條件下預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為75毫托的真空冷凍干燥箱中干燥48小時，制備得到凍干菌粉；步驟四向質(zhì)量分數(shù)為1. 5%的海藻酸鈉溶液中加入0. 1 g凍干菌粉，凍干菌粉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1 4，混合均勻后得到菌膠混合液；步驟五將菌膠混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐溫-80的大豆油中，菌膠混合液與大豆油的體積比為1 5，乳化并快速加入到摩爾濃度為0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，靜置30分鐘；乳化的攪拌速度為400 rpm/min，乳化時間為10分鐘，CaCl2溶液的加入速度為20 mL/s ；步驟六離心收集微膠囊，用質(zhì)量分數(shù)為0. 85%的生理鹽水洗滌，將制備好的微膠囊置于真空冷凍干燥箱中干燥；離心收集微膠囊的條件為350 g，10分鐘，4°C ；真空冷凍干燥的條件為-20°C預(yù)凍2小時，然后在_50°C、真空度為75毫托的真空冷凍干燥箱中干燥12小時。
6.如權(quán)利要求1所述的一種雙歧桿菌微膠囊。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種雙歧桿菌微膠囊及其制備方法。雙歧桿菌專性厭氧，對氧氣、pH、溫度、濕度等外界不良環(huán)境極為敏感，在生產(chǎn)、貯存和運輸過程中很難保持活性；而且干菌粉經(jīng)口服食用時，無法耐受低pH值的胃酸、膽鹽等環(huán)境，難以保證有大量的存活菌到達腸道而定殖于腸粘膜上。本發(fā)明將雙歧桿菌凍干菌粉加入到海藻酸鈉溶液中后混入大豆油中，乳化靜置、離心收集微膠囊，采用真空冷凍干燥技術(shù)進行干燥。本發(fā)明的雙歧桿菌微膠囊具有耐胃酸性、耐膽鹽性和腸溶性的優(yōu)點，菌體的存活率高，制備方法簡單，實用性強，便于工業(yè)化大生產(chǎn)；微膠囊的貯藏穩(wěn)定性良好，解決了益生菌制劑保藏期短的問題。
文檔編號A61K9/50GK102210659SQ20111014741
公開日2011年10月12日 申請日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者嚴建亞, 朱曉麗, 段志廣, 范代娣, 馬曉軒 申請人:陜西巨子生物技術(shù)有限公司