專利名稱：重組牛堿性成纖維細胞生長因子外用溶液的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制品領域。特別是涉及一種重組牛堿性成纖維細胞生長因子外用溶液及其制備方法。
背景技術：
皮膚是機體避免遭受感染和脫水的重要屏障，嚴重創傷、燒燙傷以及某些疾病例如糖尿病引起的皮膚潰瘍會給患者帶來身體和精神上的巨大影響。因此，對皮膚創面的修復是醫藥領域十分關注的問題。自上世紀末開始，已對創傷后的組織修復過程、發生機制和治療等進行了多種研究，其中，分子生物學的迅速發展以及各學科之間的相互交叉影響，使創傷修復與組織再生等水平得到不斷提升。目前，已構建了多種促進肉芽組織生長、血管化和再上皮化的基因， 例如表皮細胞因子、堿性成纖維細胞生長因子和轉化生長因子等。已發現堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，簡寫為 bFGF)在體內可參與多種組織的創傷修復過程，是重要的創傷愈合因子之一，它能誘導微血管的形成、發育和分化，同時直接刺激成纖維細胞和細胞外基質的蛋白合成，以形成膠原纖維，增加創面的抗張力強度，并促進真皮細胞的移行、分裂、分化，以完成皮膚的修復過程， 并能促進皮膚軟骨組織、骨組織和神經組織損傷修復和肢體再生。大量基礎研究和臨床試驗證實，bFGF對燒傷、外傷及各種慢性難愈合創面具有顯著的促修復作用，并且安全、有效、 無不良反應。重組牛堿性成纖維細胞生長因子(Recombinant bovine basic fibroblast growth factor，簡寫為rb-bFGF)是由含有高效表達牛堿性成纖維細胞生長因子基因的大腸桿菌，經發酵、分離和高度純化后得到的活性因子。rb-bFGF可促進創面愈合，用于燒傷創面(包括淺II度、深II度、肉芽創面)、慢性創面(包括體表慢性潰瘍等)和新鮮創面(包括外傷、供皮區創面、手術傷等)。創傷愈合是復雜而又高度協調的過程，基本上可以分為局部炎癥反應、細胞增殖分化和組織修復重建三個既有區別又相互交錯的階段。這一過程涉及多種生長因子和細胞因子的相互作用、相互影響，共同調控細胞遷移、增生、分化、血管生成、基質沉積和組織塑型等。在傳統的創傷修復治療中，均以抗感染和增強機體營養及創面局部保護等措施使創面自然愈合，是一個被動的愈合過程。一般愈合時間較長，而且容易留下疲痕和導致色素沉著，同時對受損傷的皮膚附屬功能器官的功能恢復也不是十分有效。目前陸續發現了多種生長因子，對其生理功能、作用機制和基因調控等的研究逐漸深入，它們在創傷修復中起著舉足輕重的作用，調控著創傷修復的各個階段。隨著細胞生長因子類藥物的出現，在不排除傳統治療方法的情況下，為創面愈合的治療帶來一條全新的思路，即將創面修復由被動修復變為主動修復。研究發現重組牛堿性成纖維細胞生長因子(Recombinant bovine basicfibroblast growth factor，簡寫為rb_bFGF)能刺激創面愈合過程中幾乎所有的細胞反應，已有大量的實驗證明其對燒燙傷創面愈合，特別是對那些用傳統方法無效的難愈性的慢性潰瘍，有很好的治療作用。其作用機制是促進創面的主動修復愈合，與傳統的被動修復藥物在作用機理上有原則上的區別。rb-bFGF是由含有高效表達牛堿性成纖維細胞生長因子基因的大腸桿菌，經發酵、分離和高度純化后得到的活性因子。rb-bFGF可促進創面愈合， 用于燒傷創面(包括淺II度、深II度、肉芽創面)、慢性創面(包括體表慢性潰瘍等)和新鮮創面(包括外傷、供皮區創面、手術傷等)。另外，rb-bFGF與傳統的創面修復藥物有協同作用，可能獲得比傳統藥物更好的愈合質量。因此，rb-bFGF將成為治療創面愈合的一種新型藥物。但此類活性蛋白物質包括酶、疫苗、生長因子等的保存條件一直是此類物質應用的瓶頸，也是目前蛋白技術研究的重點。現在的活性蛋白類物質保存一般用凍干后呈固體狀態低溫保存，生產成本高且使用不方便。為此，現有技術中也公開了一些適合在低溫條件下保存的rb-bFGF外用溶液劑型，中國專利申請200510036641. 3公開了一種重組人堿性成纖維細胞生長因子外用溶液， 其采用肝素鈉保護劑，實現了活性多肽溶液狀態低溫保存。但是，在該方案中并未公開外用溶液中的主要有效成分rb-bFGF的活性指標，同時，肝素鈉可能存在的一些對患者的排異性和過敏反應也是難以避免的，因此仍然無法滿足rb-bFGF溶液作為外用藥的實際要求。因此，開發一種含rb-bFGF的外用溶液，克服上述現有技術中存在的缺陷是本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容
有鑒于此，本發明要解決的技術問題對現有的含重組牛堿性成纖維細胞生長因子的外用溶液，避免了配伍禁忌和輔料可能給人體帶來的危害，且能快速、持久、有效地促進創面愈合，增加了病人的順應性，并能實現了活性多肽在溶液狀態下的低溫保存，使用方便。本發明通過如下技術方案解決上述技術問題一種含重組牛堿性成纖維細胞生長因子的外用溶液，每15毫升所述外用溶液中包含的組分及用量為重組牛堿性成纖維細胞生長因子40000-120000IU、蛋白保護劑l-10mg、PH緩沖劑適量、加注射用水至15mL其中，所述的蛋白保護劑為人血白蛋白，所述外用溶液的pH值為6. 5-7. 5。優選地，所述PH緩沖劑為Na2HP04/NaH2P04緩沖劑，每15毫升所述外用溶液中包含 Na2HP0470-110, NaH2P0440_60mg。在本發明的一種優選的實施方式中，重組牛堿性成纖維細胞生長因子的外用溶液中，每15毫升所述外用溶液中包含的組分及用量為重組牛堿性成纖維細胞生長因子63000IU、蛋白保護劑5mg、Na2HP0490mg
NaH2P0450mg加注射用水至15mL其中，所述的蛋白保護劑為人血白蛋白，所述外用溶液的pH值為7.0。優選地，該外用溶液還包括溶液保護劑，所述溶液保護劑為甘露醇和聚乙二醇中的一種或者二者的組合。另一方面，本發明所解決的技術問題還在于提供一種上述含重組牛堿性成纖維細胞生長因子的外用溶液的制備方法，包含以下步驟包括如下步驟一、將處方量的重組牛堿性成纖維細胞生長因子原液、蛋白保護劑和PH緩沖劑溶于注射用水中，保證每15mL溶液中含有重組牛堿性成纖維細胞生長因子40000-120000IU ；二、除菌過濾1-3次，收集濾液；三、在無菌條件下按照規格分裝；上述步驟必須在嚴格的無菌條件下操作。優選地，所述除菌過濾包括至少一次0. 22 μ m除菌過濾。相比于現有技術，本發明的技術方案至少具有以下的優點和效果本發明外用溶液中的以人血白蛋白作為rb-bFGF的蛋白保護劑，能夠保證 rb-bFGF在溶液狀態下低溫保存時的性能和療效，并且該蛋白保護劑的使用還能有效避免配伍禁忌和輔料可能給人體帶來的危害，且能快速、持久、有效地促進創面愈合，增加了病人的順應性。另外，本發明的外用溶液還詳細公開了其中含有的rb-bFGF的活性指標，且在該活性范圍內能保證外用溶液能快速、持久、有效地促進創面愈合，具有良好的療效。
具體實施例方式下面結合本發明較佳的實施例做進一步的說明，這些實施例應理解為不會限制本發明的實施范圍，其變型及等同方式均被涵蓋在本發明的保護范圍內。實施例1 :rb_bFGF外用溶液的制備一處方重組牛堿性成纖維細胞生長因子4000 X IO4IU ；人血白蛋白3g;Na2HP0470g ；NaH2P0440g注射用水加至15000ml ；共制1000 支具體制備方法如下一、將上述處方中的重組牛堿性成纖維細胞生長因子原液、蛋白保護劑和PH緩沖劑溶于注射用水中，并保證每15mL溶液中含有重組牛堿性成纖維細胞生長因子40000IU ； 此過程中需對溶液的PH進行控制，保證外用溶液的pH為6. 8，調節pH采用IM的鹽酸溶液 /氫氧化鈉溶液進行調整。二、用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，收集濾液；
三、在無菌條件下按照規格分裝。需要注意是，上述步驟必須在嚴格的無菌條件下操作。實施例2 :rb-bFGF外用溶液的制備二處方重組牛堿性成纖維細胞生長因子6300 X IO4IU ；人血白蛋白5g;Na2HP0490g ；NaH2P0450g注射用水加至15000ml ；_共制1000 支具體制備方法為具體制備方法如下一、將上述處方中的重組牛堿性成纖維細胞生長因子原液、蛋白保護劑和PH緩沖劑溶于注射用水中，并保證每15mL溶液中含有重組牛堿性成纖維細胞生長因子63000IU ； 此過程中需對溶液的PH進行控制，保證外用溶液的pH為7. 2，調節pH采用IM的鹽酸溶液 /氫氧化鈉溶液進行調整。二、用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，收集濾液；三、在無菌條件下按照規格分裝。需要注意是，上述步驟必須在嚴格的無菌條件下操作。實施例3 :rb-bFGF外用溶液的制備三處方重組牛堿性成纖維細胞生長因子8000 X IO4IU ；人血白蛋白7g;Na2HPO4IlOg ；NaH2P0460g注射用水加至15000ml ；_共制1000 支具體制備方法為具體制備方法如下—、將上述處方中的重組牛堿性成纖維細胞生長因子原液、蛋白保護劑和PH緩沖劑溶于注射用水中，并保證每15mL溶液中含有重組牛堿性成纖維細胞生長因子80000IU ； 此過程中需對溶液的PH進行控制，保證外用溶液的pH為7. 2調節pH采用IM的鹽酸溶液 /氫氧化鈉溶液進行調整。二、用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，收集濾液；三、在無菌條件下按照規格分裝。需要注意是，上述步驟必須在嚴格的無菌條件下操作。實施例4 :rb-bFGF外用溶液促進表皮細胞生長及燒傷創面愈合的實驗研究
1、試劑及儀器rb-bFGF ；細胞培養箱；流式細胞儀；電腦圖象分析系統。2、動物燒傷創面模型選20_25kg白色小豬5只，在實驗的前一天用刀片給動物的背部去毛。制成直徑為2. 5厘米的圓形深ΙΓ度燒傷創面18個(燒傷深度由病理切片和免疫組化分析證實)。每3個創面為一平行組，以不含rb-bFGF的生理鹽水用于創面作為陰性對照組，直接在創面涂1 %的磺胺嘧啶銀霜作為陽性對照組。3、給藥方式創面清創后，陽性對照組的創面直接涂的磺胺嘧啶銀。其余各組的實驗均按雙盲法進行，創面在清創后，以平行試驗的方式，分別涂抹實施例1、2和3中所得的外用溶液。以后10天每天以同樣的方法換藥一次。4、創面愈合指標在每次換藥時照相，照片經電腦圖象分析系統灰度積分來比較分析創面愈合的程度，創面面積越小，表明愈合效果越好。5、結果表1、各樣品涂抹前和涂抹48小時后的平均創面面積(cm2)
權利要求
1.一種重組牛堿性成纖維細胞生長因子的外用溶液，其特征在于，每15毫升所述外用溶液中包含的組分及用量為重組牛堿性成纖維細胞生長因子40000-120000IU、 蛋白保護劑l-10mg、 PH緩沖劑適量、 加注射水至15mL ；其中，所述的蛋白保護劑為人血白蛋白，所述外用溶液的PH值為6. 5-7. 5。
2.根據權利要求1所述的外用溶液，其特征在于，所述PH緩沖劑為Na2HP04/NaH2P04緩沖劑，每15毫升所述外用溶液中包含Na2HP0470-110，NaH2P0440_60mg。
3.根據權利要求1所述的外用溶液，其特征在于，每15毫升所述外用溶液中包含的組分及用量為重組牛堿性成纖維細胞生長因子63000IU、蛋白保護劑5mg、Na2HP0490mgNaH2P0450mg加注射水至15mL其中，所述的蛋白保護劑為人血白蛋白，所述外用溶液的PH值為7.0。
4.根據權利要求1所述的外用溶液，其特征在于，該外用溶液還包括溶液保護劑，所述溶液保護劑為甘露醇和聚乙二醇中的一種或者二者的組合。
5.一種如權利要求1-4中任意一項所述外用溶液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟一、將處方量的重組牛堿性成纖維細胞生長因子原液、蛋白保護劑和PH緩沖劑溶于注射用水中，保證每15mL溶液中含有重組牛堿性成纖維細胞生長因子40000-120000IU ；二、除菌過濾1-3次，收集濾液；三、在無菌條件下按照規格分裝； 上述步驟必須在嚴格的無菌條件下操作。
6.根據權利要求5所述的重組牛堿性成纖維細胞生長因子外用溶液的制備方法，其特征在于所述除菌過濾包括至少一次0. 22 μ m除菌過濾。
全文摘要
本發明公開了一種重組牛堿性成纖維細胞生長因子的外用溶液及其制備方法。在本發明的方案中，每15毫升所述外用溶液中包含的組分及用量為重組牛堿性成纖維細胞生長因子40000-120000IU、蛋白保護劑1-10mg、PH緩沖劑適量、加注射用水至15mL；其中，所述的蛋白保護劑為人血白蛋白，所述外用溶液的pH值為6.5-7.5。本發明的外用溶液避免了配伍禁忌和輔料可能給人體帶來的危害，且能快速、持久、有效地促進創面愈合，增加了病人的順應性，并能實現了活性多肽在溶液狀態下的低溫保存，使用方便。另外，本發明的制備方法操作簡單，且能保證外用溶液中重組牛堿性成纖維細胞生長因子的活性。
文檔編號A61P17/02GK102362856SQ201110342458
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者鄭贊順, 陳詠 申請人:珠海億勝生物制藥有限公司