專利名稱：抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于口蹄疫防治技術領域，特別涉及一種抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑及其制備方法與應用。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄類動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病感染率高，感染后發病率最高可達100%，易感動物多達70余種，其中重要的經濟畜種如豬、牛、羊等均易感。鑒于FMD不僅降低動物生產性能，造成巨大的直接經濟損失，而且還影響動物及動物產品的國際貿易，因此所造成的間接損失更大，同時還會影響一個國家的國際形象，故素有“政治經濟病”之稱。各國學者對FMDV進行了廣泛而又深入的研究。FMDV屬小RNA病毒科 (Picornaviridae) 口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)成員。該病毒有7個血清型，分別為A型、 0型、C型、Asia I型、SAT I型、SAT II型和SAT III型，且血清型間無血清交叉反應和交叉免疫現象。各血清型又根據抗原親緣關系分為不同的亞型，其亞型間抗原也有很大的差
已目前，FMD是嚴重威脅畜牧業發展的重要傳染病，發達國家主要采取撲殺為主的防控措施，發展中國家主要采取疫苗接種和撲殺相結合的方法。但是疫苗接種后需要至少七天的時間才能產生保護作用，同時由于FMDV血清型多，各血清型之間幾乎沒有交叉保護性，所以現在應用的單血清型疫苗難以達到對不同血清型和亞型的變異毒株產生保護作用。RNA干擾(RNA interference, RNAi)現象的發現為疾病防控開啟了希望之門。RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由功能性雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引發的序列特異性轉錄后同源靶基因沉默現象，是近幾年迅速發展起來的一項用于抑制病毒復制的新技術。科研人員將RNAi技術應用于多種病毒性疾病的治療研究，如艾滋病病毒、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、禽流感病毒等；RNAi技術也為抗 FMDV感染方面的研究提供了新的思路。

發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑。本發明的另一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法。本發明的再一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒復制與感染的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，活性成分為siRNA-VPl和siRNA-2B ；
SiRNA-VPl的轉錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)GAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC ；反義鏈為(5’-3’)GGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC ；siRNA-2B的轉錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)CCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGC ；反義鏈為(5’-3’)GCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGG ；以上序列的小寫部分為莖環結構，粗體部分和斜體部分互補，以以上序列為模板， 轉錄得到的siRNA為具有loop結構的dsRNA ；所述的siRNA-VPl和siRNA_2B是將其轉錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入載體制備得到；所述的載體優選為人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X ；所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，更優選為重組腺病毒rAden0-2B-VP 1 ；所述的重組腺病毒rAden0-2B-VPl通過如下方法制備得到是將siRNA_VPl的轉錄模板和siRNA-2B的轉錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X，得到能分別轉錄、串聯結構的質粒；接著通過包裝細胞包裝，得到該重組腺病毒 Adeno-2B-VPl ；所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法，優選包含以下步驟(1)將如下所示的siRNA-VPl的轉錄模板和siRNA_2B的轉錄模板分別克隆入PSIREN-shuttle穿梭載體，位于TO啟動子的下游，得到重組質粒Paiuttle-2B和 pShuttIe-VPl ；siRNA-VPl的轉錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAG AG ；反義鏈為(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC CG ；siRNA-2B的轉錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG ；反義鏈為(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG ；正義鏈寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位點粘性末端，反義鏈寡核苷酸的 5’端突出部分是EcoRI酶切位點粘性末端，加粗部分為siRNA正義鏈，斜體部分為siRNA的反向互補鏈，小寫字體為loop環序列，下劃線部分為7個連續T終止信號及其互補序列；(2)分別通過 PHce I/I-Ceu I 雙酶切重組質粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl， 得到目的片段；再通過體外連接法分別將目的片段與人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體 pAdeno-X 連接，得到重組質粒 pAdeno_2B 和 pAdeno-VPl ；(3)將重組質粒pAden0-2B和pAdeno-VPl分別線性化后，通過包裝細胞包裝，得到重組腺病毒Adeno-2B和Adeno-VPl ；該重組腺病毒Adeno_2B和Adeno-VPl即為抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，使用時將其接種到動物體身上即可；所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法，更優選包含以下步驟(1)以前述得到重組質粒pShuttle_2B和pShuttle_VPl為模板，通過PCR分別得到U6啟動子+2B融合片段和U6啟動子+VPl融合片段，再將這兩個融合片段串聯，克隆入克隆載體上，得到串聯結構、能分別獨立轉錄的重組質粒P-2B-VP1 ；(2)通過體外連接法將PI-Sce I/I-Ceu I雙酶切重組質粒P_2B_VP1得到的目的片段與人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X載體骨架連接，得到重組質粒 pAdeno-2B-VPl ；(3)將重組質粒pAden0-2B-VPl線性化后，通過包裝細胞包裝，得到重組腺病毒 Adeno-2B-VPl ；該重組腺病毒Aden0-2B-VPl即為抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，使用時將其接種到動物體身上即可；所述的克隆載體優選為pMD19-T simple載體；所述的包裝細胞優選為人胚腎細胞株HEK293 ；所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑在制備抗口蹄疫病毒制劑中的應用。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果本發明提供的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑能有抑制口蹄疫病毒復制和抗口蹄疫病感染。通過實驗證實，重組腺病毒rAden0-2B-VPl的防治效果優于重組腺病毒 r Adeno-2B和rAdeno-VPl分別單獨應用或聯合應用的效果。


圖1是篩選重組腺病毒質粒pAden0-2B-VPl進行的菌落PCR鑒定電泳圖；其中，泳道1 9為被篩選的菌落；泳道10為陰性對照；泳道M為DNA Marker DL15000。圖2是重組腺病毒質粒pAden0-2B-VPl的I^acI酶切鑒定電泳圖；其中，泳道 Ml為DNA Marker DL2000 ；泳道M2為DNA Marker DL15000 ；泳道1為重組腺病毒質粒 pAdeno-2B-VPl PacI 酶切產物。圖3是不同時間點上清中FMDV滴度的測定圖。圖4是不同時間細胞上清液中FMDV滴度測定圖。圖5是各試驗組不同時間細胞上清液中FMDV拷貝數檢測圖。圖6是重組腺病毒感染量與豚鼠保護率的關系圖。圖7是不同重組腺病毒對豚鼠保護效果的比較圖。圖8是重組腺病毒的預防保護時機圖。圖9是重組腺病毒多次治療防控FMD的效果圖。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
實施例1
本發明是以不同年代和地區分離的0型FMDV為基礎，選擇FMDV 2B、VP1基因高度保守序列設計合成siRNA，克隆入PSIREN-shuttle穿梭載體，構建重組質粒pShuttle_2B、 pShuttle-VPl，具體過程如下
(1)將siRNA-VPl的轉錄模板和siRNA_2B的轉錄模板分別用去離子水稀釋成相同的濃度(5pmol/ μ L)，分別把互補的兩段寡核苷酸(各5 μ L混合)混勻后放在PCR擴增儀上，95°C處理2min，然后自然降到常溫進行處理。將處理后形成的雙鏈siRNA寡核苷酸片段分別與經BamHI和EcoRI雙酶切處理后的pSIREN-Shuttle (Clontech公司)連接(連接反應按照T4 DNA連接酶說明書操作，陽性克隆篩選按照分子克隆實驗指南操作)，得到 pShuttle-2B(siRNA-2B的轉錄模板位于TO啟動子下游)和pShuttle-VPl (siRNA-VPl的轉錄模板位于U6啟動子下游)。
siRNA-VPl的轉錄模板的核苷酸序列如下所示
正義鏈為(5，-3，)
GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAG AG ；
反義鏈為(5，-3，)
AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC CG ；
siRNA-2B的轉錄模板的核苷酸序列如下所示
正義鏈為(5，-3，)
GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG ；
反義鏈為(5，-3，)
AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG ；
(2)分別設計 2 對引物 Pvp1_f/Pvp1_k 與 P2B-F/P2B_K，模板分別為 pShuttIe-VPl 和 pShuttle-2B,用PCR方法分別擴增U6啟動子與siRNA-VPl融合片段(理論擴增片段長為329bp)、U6啟動子與siRNA-2B融合片段(理論擴增片段長為32^p)，引物序列如下 (5， -3，)
PVP1_F CCGCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTA ；
PVP1_E :AAAACTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTC ；
P2B_F :ATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG ；
P2B_E :AACTGCAGACTCTCGAGGCACCCGACATAGATGAATTC。
PCR反應過程按TaKaRa公司Ex-Taq DNA聚合酶使用說明進行，擴增體系 (50 μ L)組成分別如下權利要求
1.一種抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于包括siRNA-VPl和 siRNA-2B ；所述的siRNA-VPl的轉錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的siRNA-VPl的轉錄模板的反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述的siRNA_2B 的轉錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID而.3所示；所述的^1 嫩-28的轉錄模板的反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.根據權利要求1所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于所述的 siRNA-VPl和siRNA-2B是將其轉錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入載體制備得到。
3.根據權利要求2所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于所述的載體為人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X。
4.根據權利要求3所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑為重組腺病毒Aden0-2B-VPl ；所述的重組腺病毒Aden0-2B-VPl通過如下方法制備得到是將siRNA-VPl的轉錄模板和siRNA-2B的轉錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體 pAdeno-X，得到能分別轉錄、串聯結構的質粒；接著通過包裝細胞包裝，得到該重組腺病毒 Adeno^B-VPl。
5.權利要求1所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)將如下所示的siRNA-VPl的轉錄模板和siRNA-2B的轉錄模板分別克隆入 PSIREN-shuttle 穿梭載體，得到重組質粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl ；siRNA-VPl的轉錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為5' -GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGA G-3，；反義鏈為5' -AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC G-3，；siRNA-2B的轉錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為5' -GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGA G-3，；反義鏈為5， -AATTCTCTAGMAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG-3 ；正義鏈寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位點粘性末端，反義鏈寡核苷酸的5’ 端突出部分是EcoRI酶切位點粘性末端，加粗部分為siRNA正義鏈，斜體部分為siRNA的反向互補鏈，小寫字體為loop環序列，下劃線部分為7個連續T終止信號及其互補序列；(2)分別通過PHce I/I-Ceu I 雙酶切重組質粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl， 得到目的片段；再通過體外連接法分別將目的片段與人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體 pAdeno-X 連接，得到重組質粒 pAdeno_2B 和 pAdeno-VPl ；(3)將重組質粒pAden0-2B和pAdeno-VPl分別線性化后，通過包裝細胞包裝，得到重組腺病毒r Adeno-2B和rAdeno-VPl ；該重組腺病毒Adeno_2B和Adeno-VPl即為抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑。
6.根據權利要求5所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)以所述的重組質粒pamttle-2B和所述的pShuttle-VPl為模板，通過PCR分別得到U6啟動子+2B融合片段和U6啟動子+VPl融合片段，再將這兩個融合片段串聯，克隆入克隆載體上，得到串聯結構、能分別獨立轉錄的重組質粒P-2B-VP1 ；(2)通過體外連接法將PI-SceI/I-Ceu I雙酶切重組質粒P-2B-VP1得到的目的片段與人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X載體骨架連接，得到重組質粒 pAdeno-2B-VPl ；(3)將重組質粒pAden0-2B-VPl線性化后，通過包裝細胞包裝，得到重組腺病毒 Adeno-2B-VPl ；該重組腺病毒Aden0-2B-VPl即為抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑。
7.根據權利要求6所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于所述的克隆載體優選為PMD19-T simple載體。
8.根據權利要求5或6所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于所述的包裝細胞為人胚腎細胞株HEK293。
9.權利要求1 4任一項所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑在制備抗口蹄疫病毒制劑中的應用。
全文摘要
本發明公開一種抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑及其制備方法與應用。該生物制劑的活性部分為siRNA-VP1和siRNA-2B；siRNA-VP1的轉錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；siRNA-2B的轉錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發明通過將siRNA-VP1的轉錄模板和siRNA-2B的轉錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X，得到能分別轉錄、串聯結構的質粒；接著通過包裝細胞包裝，得到該重組腺病毒Adeno-2B-VP1。通過實驗證實，重組腺病毒Adeno-2B-VP1的防治效果優于重組腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1分別單獨應用或聯合應用的效果。該生物制劑能有抑制口蹄疫病毒復制和抗口蹄疫病感染。
文檔編號A61K48/00GK102512694SQ20121000429
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者代曼曼, 劉文俊, 徐艷芳, 李銀光, 趙明秋, 陳金頂 申請人:華南農業大學