專利名稱：間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性因子的分離與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利設(shè)計(jì)間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性因子的分離與制備方法。通過間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞培養(yǎng)的上清液和培養(yǎng)的干細(xì)胞，將其細(xì)胞破碎，提取間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞中的干細(xì)胞活性因子。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌的轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)肽、細(xì)胞信號分子、核苷類等生物活性因子，對心臟、肝臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)等的修復(fù)與保護(hù)作用；并有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，防止細(xì)胞衰老；干細(xì)胞可通過其表達(dá)、合成和分泌的干細(xì)胞活性分子影響靶器官結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)及其病理狀態(tài)下的修復(fù)，它是實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞治療改善靶器官功能、抗凋亡、抗癌、抗衰老、抗炎、治療糖尿病等作用的重要功能物質(zhì)。本發(fā)明提供了間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌的干細(xì)胞活性因子的分離與制備方法。分離制備的干細(xì)胞活性因子在再生醫(yī)學(xué)(包括惡性腫瘤、心腦血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有廣闊的應(yīng)用前景，并將產(chǎn)生重大的社會效益和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
分離制備的間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性物質(zhì)可分為兩類:小分子干細(xì)胞活性物質(zhì)成為干細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移因子。大分子物質(zhì)為大分子干細(xì)胞活性因子。

(一 )分離培養(yǎng)干細(xì)胞1、收獲干細(xì)胞培養(yǎng)的上清液:分離培養(yǎng)干細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基和因子培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長到合適階段，收獲上清液；亦可多次傳代，多次收獲。2、收獲培養(yǎng)的干細(xì)胞:分離培養(yǎng)干細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基和因子培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長到合適階段，收獲培養(yǎng)的干細(xì)胞。(二)干細(xì)胞活性因子的分離制備1、裂解細(xì)胞、釋放干細(xì)胞活性因子將收獲的干細(xì)胞加合適的液體，并調(diào)節(jié)到合適的PH值，采用機(jī)械(超聲波、膠體磨等)或物理(如多次凍融等)學(xué)方法裂解破壞細(xì)胞，使其釋放細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞活性因子。干細(xì)胞培養(yǎng)上清液不需裂解程序，可直接按下面方法分離提取干細(xì)胞活性因子。2、分離提取干細(xì)胞活性因子可用以下方法:(I)透析提取小分子干細(xì)胞活性因子(相似于干細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移因子)將上述干細(xì)胞裂解物，經(jīng)適當(dāng)處理后，裝入透析袋或玻璃紙透析裝置內(nèi)，在一定溫度下透析，12-30小時(shí)收取透析液。
(2)中空纖維柱分離提取干細(xì)胞活性因子將上述干細(xì)胞裂解物，經(jīng)適當(dāng)處理后，用適當(dāng)分子截留孔徑(如0.2KD、5KD、10KD、15KD等)的中空纖維柱分離截取干細(xì)胞活性因子，按分子量不同，小分子物質(zhì)為干細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移因子，大分子物質(zhì)為大分子干細(xì)胞活性因子。(3)離子交換和層析提取干細(xì)胞活性因子采用離子交換和層析分離提取干細(xì)胞活性因子，根據(jù)干細(xì)胞的分子量或親和性分步(或特定)收集干細(xì)胞活性因子。3、干細(xì)胞活性因子的鑒定(I)蛋白質(zhì)濃度的鑒定。(2)核糖和多核苷酸的濃度鑒定。(3)蛋白質(zhì)和 核酸類物質(zhì)的分類鑒定。(4)干細(xì)胞活性因子的生物活性鑒定。4、可形成的干細(xì)胞活性因子制劑(I)注射用制劑。(2) 口服制劑。(3)噴霧制劑。(4)外用制劑。


無
具體實(shí)施例方式下面通過四個(gè)實(shí)例描述本發(fā)明所涉及的提取干細(xì)胞活性因子的方法，但本發(fā)明所涉及的范圍并不局限于本四個(gè)實(shí)例。實(shí)施例一:用透析袋或玻璃紙制備干細(xì)胞小分子活性因子(類似轉(zhuǎn)移因子)1、細(xì)胞分離:從胎兒骨髓、肝、脾、臍帶；嬰兒臍帶；人骨髓、外周血液；人脂肪組織等分離干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，用專門配制的或購買的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞干細(xì)胞。2、細(xì)胞檢定:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢定細(xì)胞表面標(biāo)志和生物芯片檢定其表面標(biāo)志、生長因子和細(xì)胞因子等。3、細(xì)胞和細(xì)胞分泌液的收獲:(I)收獲細(xì)胞分泌液:直接收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液,然后進(jìn)行分離純化。(2)收獲干細(xì)胞:將培養(yǎng)一定時(shí)間的干細(xì)胞，2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，上清液為細(xì)胞分泌液；細(xì)胞用注射用水懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度，用醋酸緩沖液調(diào)PH3.5-7.0。(3)破碎細(xì)胞:將懸浮的細(xì)胞置于_20°C冷凍，水浴解凍，連續(xù)凍容3次，顯微鏡下觀察細(xì)胞凍容情況，如還有較多的完整細(xì)胞，可增加凍融次數(shù)。(4)收獲凍融液:將細(xì)胞凍融液4000轉(zhuǎn)/分，離心15分，取上清液(細(xì)胞凍融液)用NaOH溶液調(diào)ρΗ7.0。(5)透析:將細(xì)胞凍融液裝入分子截留量為I萬(10KD) 1.5萬的透析袋和玻璃紙裝置內(nèi)，對PBS透析8 30小時(shí)，溫度為4°C左右。中間每3小時(shí)將透析袋或玻璃紙裝置內(nèi)的液體物質(zhì)混勻一次。取出透析袋或玻璃紙裝置，透析袋內(nèi)和玻璃紙裝置內(nèi)的液體，用于進(jìn)一步分離大分子干細(xì)胞活性因子。(6)超濾:收集濃縮透析液，將透析液用0.15KD孔徑的中空纖維過柱，截留0.2KD以上的小分子干細(xì)胞因子，去水并將小分子干細(xì)胞因子濃縮。用注射用生理鹽水調(diào)小分子干細(xì)胞至所需濃度。(7)必要時(shí)凍干。實(shí)施例二:用中空纖維分離獲取干細(xì)胞活性因子1、干細(xì)胞破碎(凍融)液、透析袋和玻璃紙裝置內(nèi)液體和細(xì)胞培養(yǎng)上清液(細(xì)胞分泌液)過一定孔徑的中空纖維柱。2、分離獲取大分子干細(xì)胞因子:(I)分離截取干細(xì)胞因子:用10 15KD孔徑的中空纖維，將上述液體物質(zhì)過柱；截取10 15KD以上的干細(xì)胞因子，再過150KD孔徑的中空纖維柱，收集15 150KD的干細(xì)胞因子。

(2)收集濃縮干細(xì)胞因子:將收集的15 150KD的干細(xì)胞因子，用0.15KD孔徑的中空纖維過柱濃縮去掉水分子。3、分離截取小分子干細(xì)胞因子(類似轉(zhuǎn)移因子)(I)分離截取濃縮小分子干細(xì)胞因子:將10 15KD以下的干細(xì)胞因子，用0.15KD孔徑的中空纖維過柱，去水并濃縮小分子干細(xì)胞因子。(2)收集小分子干細(xì)胞因子:將濃縮去水的小分子干細(xì)胞因子用生理鹽水調(diào)至所需濃度4、必要時(shí)凍干干細(xì)胞因子。實(shí)施例三:層析分離(離子層析、疏水層析、親和層析、凝膠層析等)本例以凝膠層析分離單分子或多分子物質(zhì)1、根據(jù)干細(xì)胞分子量大小用一定型號的葡聚糖凝膠(Sephndex)柱進(jìn)行分離純化。2、干細(xì)胞破碎(凍融)液、透析袋和玻璃紙裝置內(nèi)液體和細(xì)胞培養(yǎng)上清液過柱。3、按分子量大小分布收集流出液。4、用0.15KD的中空纖維濃縮去水。5、調(diào)制所需濃度。6、必要時(shí)凍干。實(shí)施例四:分離提取干細(xì)胞，可以多種方法聯(lián)用，如層析(凝膠層析加親和層析)、中空纖維及透析聯(lián)用。提取干細(xì)胞因子環(huán)境條件的基本要求:(I)細(xì)胞:包括胚胎干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞、成體干細(xì)胞。(2)場地:合乎GMP要求的車間。(3)制品用水及化學(xué)藥品:注射用水、注射用勝利鹽水、化學(xué)物質(zhì)要求分析純。
干細(xì)胞活性因子的鑒定:(I)蛋白質(zhì)濃度的鑒定。(2)核糖和多核苷酸的濃度鑒定。(3)蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)的分類鑒定。(4)干細(xì)胞 活性因子的生物活性鑒定。
權(quán)利要求
1.用透析袋或玻璃紙?zhí)崛⌒》肿娱g充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性物質(zhì)(干細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移因子)。
2.用中空纖維柱分離截留小分子間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性物質(zhì)和大分子干細(xì)胞活性物質(zhì)。
3.用層析法分離提取制備間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞內(nèi)的干細(xì)胞活性因子。
4.裂解破壞干細(xì)胞，分離提取制備間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性因子。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計(jì)間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)干細(xì)胞活性因子的分離與制備方法。通過干細(xì)胞培養(yǎng)的上清液和培養(yǎng)的干細(xì)胞，將其細(xì)胞破碎，提取干細(xì)胞中的干細(xì)胞活性因子。分離制備的干細(xì)胞活性因子在再生醫(yī)學(xué)(包括惡性腫瘤、心腦血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有廣闊的應(yīng)用前景，并將產(chǎn)生重大的社會效益和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A61K35/407GK103239477SQ201210029310
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者馮長訪, 羅軍蓉 申請人:馮長訪, 羅軍蓉