I型組蛋白去乙酰化酶抑制劑在抑制腎臟纖維化中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了I型HDAC抑制劑在制備抑制促纖維化受體的組合物或藥物中的用途。本發明還提供I型HDAC抑制劑在抑制TβRI、EGFR和PDGFR中的用途，以及體外非治療性的抑制腎臟細胞纖維化的方法。本發明的抑制劑在抑制促纖維化受體的同時不影響拮抗纖維化的受體的表達和磷酸化，因此是一種選擇性抑制劑，從而能夠作為副作用低的纖維化治療藥物。
【專利說明】I型組蛋白去乙酰化酶抑制劑在抑制腎臟纖維化中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學領域。具體地說，本發明涉及利用I型組蛋白去乙酰化酶抑制劑抑制腎臟纖維化。
【背景技術】
[0002]組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一類酶家族，其除去組蛋白的乙酰基以沉默基因轉錄[1，2]并催化許多非組蛋白蛋白質去乙酰化[3-7]以調節它們的功能。HDAC有四類:1型(HDAC1、2、3 和 8) ；11 型(HDAC4、5、6、7、9 和 10)、III 型(SIRT1-7)和 IV 型(HDACll) [8]。前兩類型的HDAC認為是“經典” HDAC，是目前用于治療癌癥和其它疾病的泛-HDAC抑制劑(SP，曲古抑菌素A(TSA)、伏立諾他)的主要靶點[8，9]。
[0003]除了腫瘤外，HDAC抑制劑還對一些非惡性疾病顯示治療作用。例如，HDAC抑制劑能有效緩解一些神經退化性疾病[10，11]并減輕心臟[12，13]、肝臟[14，15]和皮膚[16]的組織纖維化。因此，HDAC可以成為治療慢性腎病(CKD)的新型靶點。然而，HDAC抑制作用介導腎臟纖維化的減弱的分子機理未知。
[0004]大多數CKD的發病機理涉及導致腎臟纖維化的血液動力學和炎性過程復雜機制，其特征在于腎臟成纖維細胞的活化和過量胞外基質(ECM)蛋白的累積[27，18]。以前的研究證明許多細胞因子和生長因子是刺激成肌纖維細胞增殖/活化以及誘導ECM產生的強效有絲分裂原[19，20]。這些生長因子和細胞因子通過與其受體結合施加其生物學效應。各種慢性腎病顯示幾種細胞因子/生長因子受體的表達增加，包括轉化生長因子受體(T^R) [21]、表皮生長因子受體(EGFR) [22-24]和血小板衍生生長因子受體(I3DGFR) [25]。通過藥學或遺 傳學方法抑制T β R、EGFR和TOGFR能在動物模型中減弱腎臟纖維化[26-30]。這提示這些受體在腎臟纖維發生中起至關重要的作用。
[0005]最近的研究表明，HDAC抑制劑能抑制包括EGFR在內的各種蛋白質表達。例如，伏立諾他或TSA通過EGFR mRNA的轉錄阻遏降低EGFR在肺和結腸直腸癌細胞中的表達[31，32];抑制HDAC6增強EGFR的內吞作用以及隨后通過微管蛋白乙酰化增加的降解
[33]。在培養的近曲小管細胞和糖尿病大鼠腎臟中，伏立諾他也顯示降低EGFR蛋白和mRNA水平，并減弱細胞增殖[34]。因此，細胞因子/生長因子受體可以是HDAC抑制劑的靶點。
[0006]與上述受體相反，外源性肝細胞生長因子激活C-Met緩解了腎臟間質纖維化
[35]，從而提示c-Met作為抗纖維化介質的重要作用。
[0007]因此，本領域急需能導致T β R,PDGFR和EGFR下調，但同時能維持c_Met水平的治療方法和藥物來治療腎臟纖維化。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供能下調促纖維化受體，但不影響拮抗纖維化的受體的藥物組合物和治療方法，從而能治療腎臟纖維化。
[0009]在第一方面，本發明提供I型HDAC抑制劑的用途，所述I型HDAC抑制劑用于制備抑制促纖維化受體的組合物。
[0010]在優選的實施方式中，所述組合物是藥物組合物。
[0011]在另一優選的實施方式中，所述促纖維化受體選自下組
[0012]在另一優選的實施方式中，所述組合物還抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途徑的活化；和/或所述組合物不影響c-Met的表達或磷酸化。
[0013]在另一優選的實施方式中，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學上可接受的鹽。 [0014]在另一優選的實施方式中，所述藥物組合物用于抑制腎臟纖維化。
[0015]在第二方面，本發明提供I型HDAC抑制劑的用途，所述I型HDAC抑制劑用于制備治療或預防腎臟纖維化的藥物。
[0016]在另一優選的實施方式中，所述I型HDAC抑制劑包括MS-275或其藥學上可接受的鹽。
[0017]在另一優選的實施方式中，所述藥物還抑制選自下組的一種或多種促腎臟纖維化受體:Τ β R1、EGFR 和 PDGFR。
[0018]在另一優選的實施方式中，所述藥物還抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途徑的活化；和/或所述藥物不影響c-Met的表達或磷酸化。
[0019]在第三方面，本發明提供I型HDAC抑制劑在抑制TPR1、EGFR和TOGFR中的用途。
[0020]在另一優選的實施方式中，所述抑制是非治療性的和體外的。
[0021]在另一優選的實施方式中，所述I型HDAC抑制劑還抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途徑的活化；和/或
[0022]所述I型HDAC抑制劑不影響c_Met的表達或磷酸化；和/或
[0023]所述I型HDAC抑制劑還抑制腎臟纖維化。
[0024]在另一優選的實施方式中，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學上可接受的鹽。
[0025]在第四方面，本發明提供體外非治療性的抑制腎臟細胞纖維化的方法，其特征在于，包括步驟:在I型HDAC抑制劑存在下，培養腎細胞，從而抑制腎臟細胞的纖維化；
[0026]較佳地，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學上可接受的鹽。
[0027]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1顯示了 MS-275降低梗阻腎臟中的ECM沉積。(A)顯示各種處理后腎臟組織的Masson染色的顯微照片。(B)相對于10個隨機腎皮質的整個面積，分析Masson-陽性腎小管間質面積(藍色)(200X)(平均值土SEM)。數據表示為平均值土SEM(n=6)。上標字母不同的平均值彼此顯著不同(P〈0.05)。
[0029]圖2顯示了 MS-275抑制梗阻腎臟中膠原1、纖連蛋白、a -SMA的表達并增強乙酰基-組蛋白Η3的表達。腎臟組織裂解物用纖連蛋白、膠原1、α -SM,乙酰基-組蛋白Η3或GAPDH的特異性抗體作免疫印跡分析(A)。通過光密度分析法定量纖連蛋白(B)、膠原I (C), a -SMA (D)、乙酰基-組蛋白Η3 (E)的表達水平，并用GAPDH標準化。數據表示為平均值土 SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0030]圖3顯示了 MS-275對梗阻腎臟中UUO-誘導T β RI表達和smad3磷酸化的作用。在所示時間點(A)或在輸尿管梗阻后第7天(B)收集腎臟組織，細胞裂解物分別用T β RI (A, B)、p-Smad和Smad(B)的特異性抗體作免疫印跡分析。通過光密度分析法分別定量T β RI和p-Smad的表達水平，并用GAPDH和Smad3標準化(C，D)。數據表示為平均值土SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0031]圖4顯示了 MS-275對梗阻腎臟中UUO-誘導TOGFR表達和磷酸化的作用。在所示時間點㈧或在輸尿管梗阻后第7天(B)收集腎臟組織，細胞裂解物用P-PDGFRP和TOGFRi^的特異性抗體作免疫印跡分析(A，D)。通過光密度分析法分別定量p-PDGFRi3和TOGFRi^的表達水平，并用I3DGFRP (B, E)和GAPDH(C，F)標準化。數據表示為平均值土SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0032]圖5顯示了 MS-275對梗阻腎臟中UUO-誘導EGFR表達和磷酸化以及Lcn2表達的作用。在輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織，細胞裂解物用p-EGFR、EGFR或Lcn_2的特異性抗體作免疫印跡分析(A)。通過光密度分析法分別定量p-EGFR(B)、EGFR (C)或Lcn_2 (D)的表達水平，并用EGFR或GAPDH標準化。數據表示為平均值土SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0033]圖6顯示了 MS-275對梗阻腎臟中G2/M期的上皮細胞細胞周期停滯和TGF-β I表達的作用。在輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織。顯微照片顯示絲氨酸10的P-組蛋白Η3有免疫熒光染色(紅色)(A)。隨機計數10個腎皮質視野中的P-組蛋白Η3-陽性細胞(200 X)(平均值土 SEM)⑶。組織裂解物用絲氨酸10的P-組蛋白Η3的特異性抗體作免疫印跡分析(C)。采用ELISA測定腎臟組織提取物的TGF-β 1(D)。數據表示為平均值土SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0034]圖7顯示了 MS-275對梗阻腎臟中c_Met的磷酸化和MET表達的作用。在所示時間點(A)或在輸尿管梗阻后第7`天(D)收集所示各種處理后的腎臟組織，細胞裂解物用p-c-Met和MET的特異性抗體作免疫印跡分析(A，D)。通過光密度分析法定量不同組中p-c-MET (B, E)和c-MET (C，F)的表達水平，并用MET或GAPDH(B)標準化。數據表示為平均值土 SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0035]圖8顯示了 MS-275對梗阻腎臟中STAT3和ERK1/2磷酸化的作用。腎臟組織裂解物用磷酸-STAT3 (p-STAT3)、STAT3、磷酸-ERK1/2 (p-ERKl/2)和ERK1/2的特異性抗體作免疫印跡分析(A)。通過光密度分析法定量p-STAT3、STAT3、p-ERKl/2和ERK1/2的表達水平。激活的 STAT3 ⑶和 ERK1/2 (D)分別用 p_STAT3/STAT3、p-ERK/ERK 之比表述。用 GADPH 標準化STAT3(C)和ERK1/2(E)的蛋白質水平。數據表示為平均值土SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0036]圖9顯示了 MS275對培養的腎臟間質成纖維細胞中TGF-β I誘導膠原1、a -SMA和纖連蛋白及乙酰基-組蛋白Η3表達的作用。在MS-275存在下(0-2.0 μ Μ)，血清饑餓的NRK-49F細胞與2ng/ml TGF- β I溫育24小時。細胞裂解物用膠原1、a -SMA、纖連蛋白、乙酰基-組蛋白Η3或GAPDH(A)和T β R1、p_Smad3或Smad3 (E)的抗體作免疫印跡分析(A)。此為三個或更多個免疫印跡實驗的代表。通過光密度分析法定量所示蛋白質的表達水平，并用GAPDH標準化(B、C、D)。數據表示為平均值土SEM。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0037]圖10顯示了 MS275對培養的腎臟間質成纖維細胞中H)GFR、EGFR、cMET、STAT3和ERK1/2的磷酸化和表達的作用。將不同劑量的Μ3-275(0-2.0μΜ)直接加入血清培養的NRK-49F，并溫育24小時。細胞裂解物用所示蛋白質的抗體作免疫印跡分析(Α，Ε)。此為三個或更多個免疫印跡實驗的代表。通過光密度分析法定量所示蛋白質的表達水平。分別用它們本身的總蛋白標準化P-DGFRP、p-EGFR和p-c-MET。用α -微管蛋白標準化TOGFR、EGFR和c-MET。數據表示為平均值土SEM。上標字母不同的平均值間有顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0038]圖11顯示了 MS275對培養的腎臟間質成纖維細胞中膠原1、a -SMA、纖連蛋白和乙酰基-組蛋白Η3表達的作用。在MS-275存在下(0-2.0 μ Μ)，血清饑餓的NRK-49F細胞與5%FBS溫育24小時。制備細胞裂解物，用膠原1、a -SMA、纖連蛋白、或乙酰基-組蛋白Η3或GAPDH(A)的抗體作免疫印跡分析(A)。此為三個或更多個免疫印跡實驗的代表。通過光密度分析法定量所示蛋白質的表達水平，并用GAPDH標準化(B、C、D)。數據表示為平均值土SEM。上標字母不同的平均值間有顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0039]圖12顯示了 MS275對培養的腎臟間質成纖維細胞增殖的作用。NRK-49F細胞血清饑餓24小時(對照)，然后在MS-275不存在或2.0 μ M(A)或0-2.0 μ M MS-275 (B-E)存在下，在含5%FBS(A-C)或2ng/ml TGF-β I的DMEM中溫育48小時。相差照片(200X)顯示MS-275對細胞增殖的作用(A)。通過計數細胞(B，D)或通過MTT試驗(C，E)評估細胞增殖。數據表示為平均值土SEM。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0040]圖13顯示MS-275改善了 UUO損傷后的腎臟破壞作用。顯微照片顯示了各種處理后腎臟組織的PAS染色(A)。基于方法中描述的評分表，對形態改變評分(B)。數據表示為平均值土SEM(n=6)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(P〈0.05)。
[0041]圖14顯示MS-275降低梗阻腎臟中的Lcn2表達。輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織。顯微照片顯示所示各種處理后Lcn2的免疫熒光染色(A)。計數10個隨機腎皮質視野中的Lcn-2陽性細胞(200X)(平均值土SEM) (B)。上標字母不同的平均值間有顯著差異(Ρ〈0.05)。
[0042]圖15顯示MS-275不誘導腎臟成纖維細胞的細胞死亡。在有或無2 μ M MS-275存在下，NRK-49F細胞與5%FBS培養36小時，或在有或無Η202250 μ M存在下培養2小時，收集細胞，進行免疫印跡分析活化的PARP和caspase-3。
[0043]圖16顯示TSA抑制I/II型HDAC阻止梗阻腎臟中UUO-誘導的T β RI表達和EGFR及TOGFR的磷酸化/表達。在輸尿管梗阻后第7天收集腎臟組織(A-C)，細胞裂解物用T β RI或 GADPH ⑷、p-EGFR、EGFR 或 α -微管蛋白⑶、p-PDGFR β、PDGFR β 或 GADPH(C)的特異性抗體進行免疫印跡分析。顯示了 3個或更多個實驗的代表性免疫印跡。
【具體實施方式】
[0044]發明人經過廣泛而深入的研究，出乎意料地發現特異性I型HDAC抑制劑不僅下調介導腎臟纖維化的生長因子受體，還能維持具有抗纖維化作用的受體的完整性，進而發現特異性I型HDAC抑制劑能夠作為腎臟纖維化的治療藥物。在此基礎上完成了本發明。
[0045]促纖維化受體[0046] 本文所用的術語“促纖維化受體”表示在纖維發生中表達或活性增加并在其中起至關重要作用的細胞因子受體和生長因子受體。在具體的實施方式中，所述促纖維化受體包括轉化生長因子-β受體(Τβ R)、表皮生長因子受體(EGFR)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR)。
[0047]HDAC 抑制劑
[0048]本文所用的術語“HDAC抑制劑”具有本領域普通技術人員通常理解的含義，即，能夠抑制、阻遏、降低、減弱或破壞HDAC表達或活性的物質。類似地，本文所用的術語“I型HDAC抑制劑”表示能夠特異性抑制、阻遏、降低、減弱或破壞I型HDAC的表達或活性，而對其它類型的HDAC沒有影響的物質。
[0049]在具體的實施方式中，可選擇的I型HDAC抑制劑有MS-275和SK7041。據報道用 MS-275(Anticancer Drugs,2011, 22(6), 494-9)和 SK7041(Kim, IA, Ii CancerRes.2006, 12:940-9)處理能有效殺傷腫瘤細胞。
[0050]在治療腎臟纖維的優選實施方式中，所述I型HDAC抑制劑是MS-275。
[0051]此外，據報道，I型和II型HDAC有相反作用，II型HDAC可抑制心臟肥大而I型HDAC促進心臟肥大。因此，如果同時抑制I型和II型HDAC，會抵消抑制I型HDAC帶來的治療益處。所以，特異性的I型HDAC抑制劑會產生遠高于泛HDAC抑制劑所產生的治療益處。
[0052]MS-275
[0053]MS-275，也稱為Entinostat，是一種合成的苯酰胺組蛋白抑制劑。MS-275是特異性針對I型HDAC的新一代HDAC抑制劑，其抑制I型HDAC中的HDACl和HDAC3。MS-275的結構上含有一個氨苯基，與其它HDAC抑制劑(如trichostatin A)的分子結構不同。分子式為C21H2tlN4O3,分子量為376.4085。MS-275對于皮膚T細胞淋巴瘤和其它惡性腫瘤也顯示有作為抗腫瘤藥物的治療潛能[36，37]。
[0054]藥學上可接受的鹽
[0055]本文所用的術語“藥學上可接受的鹽”表示MS-275與酸(包括有機酸和無機酸)或堿(包括有機堿或無機堿)形成的鹽，其中所述鹽具備與MS-275相同或基本上相似的藥理學活性，并且對施用對象無毒副作用。
[0056]本發明所用的材料與方法
[0057]化學試劑與抗體
[0058]p-STAT3、STAT3、p_Smad3、Smad3、p-ERKl/2、ERK1/2、ρ-EGF 受體、p-PDGF β 受體、PDGF^受體、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E、p-Met、乙酰基-組蛋白H3、切割的胱冬酶-3、切割的 PARP 抗體購自 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)。Met、纖連蛋白、膠原 I (A2)、GAPDH, EGF 受體、HDACl、HDAC2、HDAC3、HDAC8 抗體購自 Santa Cruz。MS-275、a-SMA和α -微管蛋白抗體和其他化學試劑購自Sigma (St.Louis, MO)。lipocalin_2、TGF-β 1、TGF-β I 酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自 R&D systems (Minneapolis, MN)。HDAC 試驗試劑盒購自 Upstate (Lake Placid, NY)。
[0059]細胞培養與處理
[0060]370C，5%C02和95%空氣的氣氛下，將NRK-49F細胞培養于Dulbecco改進的eagle培養基(DMEM) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)，其含有 5% 胎牛血清(FBS)、0.5% 青霉素和鏈霉素。為檢測MS-275對腎間質成纖維細胞活化的影響，將MS-275直接加入亞融合的NRK-49F細胞培養基中，后按圖中指定的時間孵育。NRK-49F以0.5%FBS的DMEM培養基饑餓24小時，然后加入TGF-β I (2ng/ml), 24小時。
[0061]測定細胞增殖
[0062]細胞增殖效率以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_聯苯基四唑鎗溴化物(MTT)方法檢測，并計數細胞。對MTT檢測，將MTT加入(終濃度，0.5mg/ml)培養基中，2小時。二甲基亞砜釋放四唑，分光光度計在570nm波長處讀數。細胞計數，不同干預后以胰蛋白酶處理細胞，0.4%臺盼藍染色。不同細胞計數使用顯微鏡下血球計數法完成。
[0063]UUO模型和MS-275處理
[0064]UUO 模型由雄性 C57 小黑鼠建立，重約 20_25g (Jackson Laboratory, BarHarbor，ME)，如以前實驗所述[38]。簡要地說，在腹部正中切口，左側輸尿管分離、結扎。為檢測MS-275對UUO損傷誘導的腎臟纖維化的影響，將MS-275 (20mg/kg)溶于50 μ I DMSO中，UUO損傷后立即腹腔注射，每日相同劑量。對照組，只分離不結扎輸尿管，每日注入等劑量的DMS0。7天后殺死小鼠，切取腎臟，進行mRNA、蛋白和組織學檢測。
[0065]免疫熒光和免疫組化染色
[0066]免疫熒光和免疫組化染色如以往的常規方法進行[38]。腎組織固定于4.5%緩沖福爾馬林中，脫水，石蠟切片包埋。腎臟普通組織學分析，使用PAS染色。免疫熒光染色，一抗乙酰基-組蛋白H3 (1:200)、a-SMA (1:200)和熒光二抗(1:200)用于檢測熒光表達。每塊腎組織的檢查和評分(每種情況評估I次)，由腎臟病理科(L.Wang)雙盲法檢測得到。形態學損傷(上皮細胞壞死，管腔壞死和小管擴張)每塊腎臟切3-4片，每片10-12視野，按下述比例定量分析:(none=0 ；<10%=1 ;11_25%=2 ;26_75%=3 ;和>75%=4)。為評估腎臟纖維化的程度，三色法馬松染色按說明書完成(Sigma，St.Louis，MO)。膠原組織面積(藍色區域)使用 Image Pro-Plus 軟件(Media-Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)定量分析，畫線法，圍繞陽性染色區域邊界，每個顯微鏡視野的(400X)平均比率計算和繪制完成。
[0067]免疫印跡分析
[0068]NRK-49F細胞核組織切片的免疫印跡分析按通常的方法完成。灰度值分析以NIH軟件計算完成(National Institutes of Health, Bethesda, MD)。
[0069]統計學分析
[0070]全部實驗至少重復4次。圖中的數值以均值土標準差代表。組間比較采用單因素方差分析(One-way analysis of variance, AN0VA)。多均數比較采用Tukey實驗。兩組間差異比較采用Student t-檢驗。圖中統計學的差異性，以P〈0.05具有統計學差異。
[0071]本發明的優點:
[0072]本發明發現特異性I型HDAC抑制劑能夠降低致纖維化生長因子受體的表達，但不影響具有抗纖維化作用的受體的表達，因此特異性I型HDAC抑制劑的抑制作用具有選擇性，其副作用較低，是一種理想的腎臟纖維化治療藥物。
[0073]下面 結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等人,分子克隆:實驗室手冊(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0074]本發明進行的所有動物研究均得到羅德島醫院科研動物照料和使用委員會的批準。
[0075]實施例1.MS-275抑制I型HDAC減弱UUO損傷后腎臟纖維化的發展
[0076]發明人研究了特異性的I型HDAC抑制劑一 MS-275在UUO小鼠誘導的腎臟纖維化進展中的作用。如圖1所示，UUO損傷誘導膠原沉積，三色法馬松染色顯示注射MS-275導致膠原沉積明顯減少。馬松染色顯示區域半定量分析顯示與假手術組比較，梗阻組ECM蛋白沉積升高6倍。UUO后MS-275治療導致腎臟纖維化下降90%，與UUO組比較。除此之外，MS-275也改善了損傷腎臟的形態學，如腎小管擴張改變(圖13)。上述數據顯示，I型HDAC在腎臟纖維化發展中起到重要作用；MS-275是有效的抗纖維化藥物。
[0077]實施例2.MS-275抑制梗阻腎臟中纖連蛋白、膠原I和a -SMA的表達
[0078]腎間質成纖維細胞的活化和ECM蛋白過度堆積是啟動慢性腎臟纖維化關鍵環節。因此，發明人檢測了 MS-275對a -SMA(腎間質成纖維細胞活化標志物)、纖連蛋白、I型膠原(兩種主要的梗阻性腎病ECM蛋白)表達的影響。圖2A-D，a -SMA和I型膠原的水平，UUO組較假手術(Sham)組明顯升高。MS-275干預大部分阻斷了梗阻性腎病中a-SMA的表達，使I型膠原下降到基礎水平。MS-275并不影響a-SMA和I型膠原在對照組中的表達。盡管纖連蛋白在Sham組中檢測不到，UUO損傷后其表達上調。MS-275治療后阻斷了纖連蛋白表達。MS-275抑制HDAC的效率，由免疫印跡技術檢測乙酰化組蛋白Η3表達來評估。圖2Α, E顯示乙酰化組蛋白Η3在Sham組腎臟中幾乎檢測不到，UUO損傷后其表達輕度下降，MS-275干預后上調了乙酰化組蛋白表達，5倍增長，梗阻性腎病與Sham組相比。總之，以上數據提示I型HDAC在腎間質成纖維細胞活化和UUO損傷后的ECM蛋白沉積作用中至關重要。
[0079]實施例3.MS-275抑制梗阻腎臟中T β RI表達和Smad3活化
[0080]TGF- β受體表達上調和Smad信號通路激活是腎臟纖維化的主要發生機制。
[0081]在三種TGF-β受體(TGF-β I型、II型、III型受體)中，TGF-β I型受體可以直接作用并使Smad3磷酸化，激活其下游信號。因此，發明人以免疫印跡技術檢測了 TGF-β I型受體和Smad3磷酸化情況。圖3A顯示，單側輸尿管結扎誘導TGF- β I型受體呈時間依賴性增長，在手術后7天開始上調、14天達到高峰，持續至少21天。與其一致，輸尿管結扎也誘導了 Smad3磷酸化。MS-275注射后阻斷了上述反應(圖3B、C、D)。Smad3在Sham組腎臟中仍大量表達，在UUO損傷組中，MS-275干預組與單純UUO組其表達不受影響(圖3B)。這些數據顯示UUO損傷誘導了 TGF- β I型受體和Smad3磷酸化表達上調，阻斷I型HDAC活性抑制了 TGF-β信號通路活化。
[0082]實施例4.MS-275抑制梗阻腎臟中PDGFR的磷酸化和表達
[0083]TOGFR在腎間質成纖維細胞和腎臟旁細胞中大量表達，在腎間質成纖維細胞和腎臟旁細胞轉化為肌成纖維細胞中發揮重要作用。TOGFR總蛋白的基礎水平而不是磷酸化TOGFR，在Sham組腎臟中可以檢測到。UUO損傷誘導了 I3DGFR蛋白水平表達增加和其磷酸化，呈時間依賴性增加，UUO術后21天達到高峰(圖4A、B、C)。注射MS-275完全阻斷了PDGFR磷酸化并抑制了梗阻性 腎病I3DGFR表達下降到基礎水平(圖4D、E、F)。這些數據顯示，PDGFR亦受I型HDAC調控。[0084]實施例5.MS-275抑制梗阻腎臟中EGFR和Lcn2的磷酸化和表達[0085]以前的研究顯示，EGFR活化有助于延遲性腎臟缺血、腎切除、血管緊張素II注射損傷導致的腎臟纖維化發展。發明人的研究也顯示，UUO損傷誘導了持續性總EGFR和磷酸化EGFR表達，其在腎臟纖維化中至關重要。在本文中，發明人檢測了 MS-275是否影響UUO模型中EGFR的表達和活化。如圖5A、B、C所示，MS-275注射阻斷了 EGFR磷酸化，也明顯降低梗阻性腎病中EGFR的表達。與此一致的是，MS-275降低了載脂蛋白2(也稱為中性粒細胞明膠相關蛋白，Lcn2)的表達。Lcn2可調控腎臟纖維化，是EGFR下游調控基因(圖5D)。免疫熒光顯示Lcn2主要表達部位為UUO損傷后的小管上皮細胞，在Sham組中未檢測到Lcn2表達(圖14)。因此MS-275在抑制EGFR信號通路也是有效的。
[0086]實施例6.MS-275抑制上皮細胞細胞周期G2/M停滯和TGF- β I產生
[0087]有證據顯示腎臟上皮細胞周期G2/M逃逸導致細胞轉分化為顯著的前纖維化細胞型，該類細胞可釋放TGF-β I。發明人最近的研究顯示腎臟上皮細胞G2/M逃逸由EGFR介導，MS-275 能夠抑制 EGFR 表達和磷酸化(J Am Soc Nephrol, 23 (5):854-67, 2012) ? 因此，MS-275抑制上皮細胞周期逃逸是可能的。為了驗證這種假設，發明人檢測了腎小管絲氨酸10位點的磷酸化組蛋白H3，G2/M階段細胞逃逸的標志物，使用免疫熒光染色和免疫組化分析。p-H3染色陽性的細胞僅僅偶爾被觀察到少量表達在Sham組和MS-275單獨治療組，但在UUO損傷組明顯表達上調。MS-275干預的UUO小鼠p_H3染色陽性細胞明顯減少(圖6A，B)。免疫印跡提示，P-H3在Sham組小鼠中幾乎檢測不到，在UUO損傷后其表達上調，MS-275干預后阻斷了 p-H3表達(圖6C)。因為小管細胞G2/M逃逸，增加了 TGF-β I產生，發明人通過ELISA方法，進一步檢查了 MS-275對TGF-β I表達水平的影響。圖6D顯示，UUO損傷使TGF- β I產生增加，大部分被MS-275干預所抑制。這些數據顯示，抑制HDAC能夠降低TGF- β I產生，通過減輕損傷腎臟小管上皮細胞G2/M逃逸所致。
[0088]實施例7.MS-275不影響梗阻后腎臟中c_MET的磷酸化和表達
[0089]與前面所述3個受體相比，c-MET被配體(肝細胞生長因子)激活，可保護腎臟組織、抑制腎臟纖維化進展，已在很多腎臟病模型中被報道。因此，發明人進一步檢查了 UUO損傷及抑制HDAC活性對C-MET表達和磷酸化的影響。
[0090]結果表明，總c-MET及磷酸化c-MET在UUO損傷后上調，并呈時間依賴性(圖7A-C)。然而，MS-275干預并不影響c-MET磷酸化和表達(圖7D、E、F)。因此，HDAC看來不參與UUO損傷腎臟c-MET的活化和表達。
[0091]實施例8.MS-275抑制梗阻后腎臟中STAT3和ERK1/2的磷酸化
[0092]STAT3和ERK1/2信號通路在梗阻性腎病被活化，并與腎臟纖維化進展和前纖維化細胞因子如TGF-β I釋放有關。因為這些信號通路是很多生長因子和細胞因子受體活化的結果，并且MS-275治療降低了 EGFR和TOGFR信號通路，因此推測抑制HDAC活性可能抑制STAT3和ERK1/2信號通路激活。為了驗證這個假設，發明人檢測了 MS-275對梗阻性腎病STAT3和ERK1/2磷酸化的影響。UUO損傷誘導了 STAT3磷酸化，并上調了總STAT3的表達。MS-275注射后完全阻斷了 STAT3磷酸化并大部分阻斷了其蛋白總體水平表達(圖8A-C)。ERKI/2磷酸化和表達在UUO損傷后亦上調。MS-275干預使ERK1/2磷酸化降低到基礎水平，但僅部分降低了總ERK1/2表達水平(圖8Α，D, Ε)。這些數據提示HDAC也調控了 STAT3和ERKI/2磷酸化和表達。[0093]實施例9.MS-275阻斷培養的腎臟間質成纖維細胞中TGF-β I誘導的膠原I和a-SMA及纖連蛋白的表達
[0094]TGF-β I能夠誘導靜止的腎間質成纖維細胞變型為肌成纖維細胞。為直接闡明I型HDAC在TGF-β I誘導的腎間質成纖維細胞活化中的作用，我們在有或無MS-275存在情況下，以TGF-β I刺激腎間質成纖維細胞(NRK-49F)。TGF-β I (2ng/ml)刺激NRK-49F 24小時，導致I型膠原和α平滑肌激動蛋白(α-SMA)和纖連蛋白的表達增加。MS-275以劑量依賴性方式抑制了上述三種蛋白表達(圖9A-C)，提示MS-275可抑制腎間質成纖維細胞活化。MS-275以劑量依賴性方式上調乙酰化組蛋白H3(圖9A，D)。與體內實驗一致的，MS-275抑制了梗阻性腎病中TGF-β RI和Smad3磷酸化，而Smad3表達不受藥物影響(圖9E)。這些數據，連同MS-275對TGF-β RI和a -SMA和細胞外基質蛋白在損傷性腎臟中的抑制效果，提示I型HDAC在腎間質成纖維細胞活化和腎間質纖維化中起關鍵作用。
[0095]實施例10.MS-275阻斷血清誘導的H)GFR、EGFR，而非c-MET的磷酸化和表達并激活培養的腎臟間質成纖維細胞
[0096]除了 TGF-β外，在腎間質纖維化中，其他細胞因子也被釋放到腎間質，刺激受體活化和誘導腎間質成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞。因為血清中包括了一系列復雜的細胞因子，能夠刺激腎間質成纖維細胞活化，發明人進一步檢測了 MS-275在5%血清培養基時對生長因子受體(EGFR、H)GFR、c-Met)磷酸化和表達的影響。如圖10所示，MS-275治療以劑量依賴性抑制了 EGFR和TOGFR的磷酸化和表達。而c-Met磷酸化和表達不受藥物影響(圖10A-D)。我們也觀察了 MS-275可抑制STAT3和ERKI/2磷酸化(圖10E)。
[0097]除此之外，發明人檢查了 HDAC對腎間質成纖維細胞活化的影響。與體內實驗觀察的一致，MS-275治療抑制了腎間質成纖維細胞活化，在培養的腎間質成纖維細胞中抑制了I型膠原、a -SMA和纖連蛋白表達(圖11Α，B)。MS-275抑制了 HDAC，增加了乙酰化組蛋白Η3的作用(圖11Α，D)。總之，這些數據提示I型HDAC是腎間質成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，并且MS-275在抑制腎間質成纖維細胞活化是有效的。
[0098]實施例11.MS275抑制血清和TGF- β 1-刺激的腎臟間質成纖維細胞增殖
[0099]腎間質成纖維細胞增殖有助于間質纖維化進展。為確定I型HDAC在這個過程中的作用，MS-275直接加入5%FBS的培養基，或血清饑餓細胞以TGF-β I (2ng/ml)刺激。細胞增殖評估通過MTT技術或計算細胞數目完成。MS-275刺激細胞24小時明顯降低了血清或TGF-β I引起的腎間質成纖維細胞增殖(圖12A-E)。MS-275的抑制效應以劑量依賴性增強，0.5 μ M起效，在2 μ M達到最高抑制效果。明顯的，MS-275并不抑制細胞增殖，而不誘導細胞死亡。因為MS-2752 μ M處理并不誘導切割PARP或切割胱冬酶3表達，2個凋亡指標。作為陽性對照，切割PARP或切割胱冬酶3在H2O2暴露的同型細胞3小時可檢測到表達(圖 15)。
[0100]實施例12.給予TSA導致UUO損傷后腎臟中的T β RI, EGFR和TOGFR下調
[0101]發明人最近的研究提示，注射TSA，一種泛HDAC抑制劑，同時抑制I型和II型HDAC活性，也會抑制腎間質成纖維細胞活化和增殖，減輕UUO誘導的腎臟纖維化的進展(Am JPhysiol Renal Physiol.2009; 297:F996_F1005)。發明人還進一步檢查了 TSA 對 3 種前纖維化生長因子受體表達和磷酸化的影響，如以上描述的。與MS-275對這些受體的影響一致，TSA干預也導致了這3種受體的下調，抑制了 EGFR、PDGFR的磷酸化(圖16)。TSA和MS-275相似的抑制效果，提示I型而不是II型HDAC在介導前纖維化生長因子下調方面起
基本作用。
[0102]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0103]參考文獻
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【權利要求】
1.1型HDAC抑制劑的用途，其特征在于，用于制備抑制促纖維化受體的組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述促纖維化受體選自下組:Ti3R1、EGFR和PDGFR。
3.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述組合物還抑制Smad-3、STAT3和ERK172途徑的活化；和/或 所述組合物不影響c-Met的表達或磷酸化。
4.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學上可接受的鹽。
5.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物用于抑制腎臟纖維化。
6.1型HDAC抑制劑的用途，其特征在于，用于制備治療或預防腎臟纖維化的藥物。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制劑包括MS-275或其藥學上可接受的鹽。
8.1型HDAC抑制劑在抑制T β R1、EGFR和TOGFR中的用途。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制劑還抑制Smad-3、STAT3和erk1/2途徑的活化；和/或 所述I型HDAC抑制劑不影響C-Met的表達或磷酸化；和/或 所述I型HDAC抑制劑還抑制腎臟纖維化。
10.一種體外非治療性的抑制腎臟細胞纖維化的方法，其特征在于，包括步驟:在I型HDAC抑制劑存在下，培養腎細胞，從而抑制腎臟細胞的纖維化； 較佳地，所述I型HDAC抑制劑是MS-275或其藥學上可接受的鹽。
【文檔編號】A61K45/00GK103585630SQ201210293429
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月16日 優先權日:2012年8月16日
【發明者】莊守綱 申請人:上海市東方醫院