一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用，中藥材牛膝經中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關節炎的藥物中；所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑；所述牛膝總皂苷對白細胞介素-1β所致軟骨細胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細胞介素-1β引起的軟骨細胞炎癥反應，對軟骨細胞有保護作用。本發明拓寬了牛膝總皂苷的應用范圍，也為骨關節炎的防治提供了新途徑。
【專利說明】一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用。
【【背景技術】】
[0002]骨關節炎(osteoarthritis, 0A)是一種慢性退行性骨關節疾病，多發于老年人，以關節軟骨退行性病變，半月板損傷，輕度滑膜炎，骨重構，軟骨下骨硬化，骨贅形成等為主要病理特征，又稱骨關節病、退行性骨關節病、肥大性或增生性關節炎等。OA是全球范圍內最常見的骨關節病，我國OA患者約占總人口的3%，其中大部分為膝骨關節病。
[0003]OA的病因及詳細的病理機制目前仍不完全清楚，現一般認為關節軟骨破壞及其修復過程的失衡導致0A。各種致病因素造成軟骨退行性病變時均從各自途徑導致了關節軟骨細胞的死亡以及軟骨基質的降解，其中軟骨細胞的死亡又是軟骨退行性病變的關鍵。
[0004]OA的治療包括藥物治療和外科手術等。其中治療藥物可分為:快作用緩解癥狀的藥物，主要是非留體類藥物，但引起胃腸道明顯的不良反應以及可能破壞軟骨細胞進而限制了它的長期應用；慢作用緩解OA炎癥的藥物及軟骨保護劑，如補充軟骨基質的氨基葡萄糖類以及IL-1抑制劑如雙醋瑞因，軟骨保護劑如透明質酸等，但因價格昂貴而限制了使用。中醫藥治療OA類疾病歷史悠久，不良反應少，因此可深入挖掘中醫藥治療的特色與優勢。中醫藥防治OA實驗研究取得了很大成績，但是復方研究居多，尋找有效成分明確、質量可控且安全高效的組分中藥具有顯著的實用價值。
[0005]牛膝為覓科多年生草本植物Achyranthes bidentata B1.干燥根，又稱懷牛膝，具有強筋骨、補肝腎、引血下行及逐瘀通經的作用。皂苷類成分是牛膝中重要的活性成分，現有專利申請涉及總皂苷的提取方法，但對牛膝總皂苷作為骨關節炎防治藥物的作用并未見報道。
【
【發明內容】
】
[0006]本發明要解決的技術問題，在于提供一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用，拓寬了牛膝總皂苷的應用范圍，也為骨關節炎的防治提供了新途徑。
[0007]本發明是這樣實現上述技術問題的:
[0008]一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用，中藥材牛膝經中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關節炎的藥物中。
[0009]進一步地，所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
[0010]進一步地，所述牛膝總皂苷對白細胞介素-1 β所致軟骨細胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細胞介素-1 β引起的軟骨細胞炎癥反應，對軟骨細胞有保護作用。
[0011]本發明具有如下優點:
[0012]牛膝飲片經乙醇回流提取，正丁醇萃取，DlOl大孔吸附樹脂富集，獲得牛膝總皂苷。牛膝總皂苷對白細胞介素-1β (IL-Ιβ)所致軟骨細胞凋亡有抑制作用，還可抑制IL-1 β引起的軟骨細胞炎癥反應，對軟骨細胞有顯著保護作用。大鼠右后肢膝關節腔注射碘乙酸鈉造成實驗性骨關節炎模型，牛膝總皂苷能顯著抑制實驗性骨關節炎大鼠關節腫脹，降低血清IL-1 β與一氧化氮(NO)水平，抑制軟骨膠原蛋白的降解，對實驗性骨關節炎大鼠有顯著治療作用。總之，本發明拓寬了牛膝總皂苷的應用范圍，也為骨關節炎的防治提供了新途徑。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0013]下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0014]圖1為牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞活力影響的柱狀圖。
[0015]圖2為Hoechst33258染色檢測牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡的顯微圖。
[0016]圖3Α為Annexin V-FITC流式檢測牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡散點圖。
[0017]圖3Β為Annexin V-FITC流式檢測牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡柱形圖。
[0018]圖4為牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡蛋白的影響Western Blot圖。
[0019]圖5為牛膝總皂苷抑制IL-1 β誘導的軟骨細胞caspase3活性的柱狀圖。
[0020]圖6為牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞中炎癥介質的影響Western Blot圖。
[0021]圖7為牛膝總阜昔對大鼠血清IL-1 β水平的影響柱狀圖。
[0022]圖8為牛膝總阜昔對大鼠血清NO水平的影響柱狀圖。
[0023]圖9為牛膝總皂苷對大鼠血清羥脯氨酸水平的影響柱狀圖。
【【具體實施方式】】
[0024]請參閱圖1?9所示，對本發明的實施例進行詳細的說明。
[0025]本發明涉及一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用，中藥材牛膝經中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關節炎的藥物中。
[0026]所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
[0027]所述牛膝總皂苷對白細胞介素-1 β所致軟骨細胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細胞介素-1 β引起的軟骨細胞炎癥反應，對軟骨細胞有保護作用。
[0028]下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0029]實施例一:干燥的牛膝飲片3.5kg，略破碎，加入4倍體積75%乙醇，水浴加熱，回流提取三次，時間分別為4h、2h、2h。合并提取液，減壓濃縮，稱重。總浸膏用適量水溶解，依次用石油醚，水飽和正丁醇萃取，最后將正丁醇萃取液進行減壓濃縮，稱重。在預處理過的DlOl大孔吸樹脂層表面放入一張濾紙，將事先準備好的上樣液(樣品液的前處理:樣品用適量蒸餾水超聲溶解，3000r/min離心20min以除去沉淀和雜質，得到的樣品液放置于冰箱4°C低溫放置備用)沿玻璃柱內壁小心加入柱子，以3mL/min (即I滴/秒)的流速放液，直至樣品液降至樹脂層表面。依次用5倍柱體積的水、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %乙醇以3mL/min的流速進行梯度洗脫，收集50%洗脫液，經回流濃縮、干燥，獲得牛膝總皂苷提取物，以5%香草醛-冰乙酸:高氯酸:冰乙酸(2:8:50)為顯色劑進行含量測定，所得提取物中牛膝總皂苷含量高于50%。
[0030]實施例二:無菌環境下，小心刮取100 ± 1g的SD雄性大鼠雙側膝關節脛骨坪及髕骨內側透明軟骨，用含100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗軟骨，剪碎至Imm3大小。將軟骨碎片轉移至離心管中，依次用0.25%的胰蛋白酶及0.3%的II型膠原酶分別消化30min，3h。II型膠原酶消化時每隔30min吹打60s。將消化液經200目細胞篩過濾，得到細胞懸液，1200rpm/min離心lOmin。用DMEM/F-12培養基重懸細胞(含20%新生牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素)，將細胞懸液轉移至25cm2細胞培養瓶中，37°C和5% CO2培養箱中培養，實驗使用第2?3代細胞。
[0031]2?3代的軟骨細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，將細胞濃度調為I X 15個細胞ZmL,接種于96孔細胞培養板，37°C和5% CO2培養箱中培養24h。加入含5% NCS的DMEM/F-12培養基，牛膝總皂苷(終濃度為3，10，30μ8/πιυ或IL-1 β (終濃度為10ng/mL)，至37°C,5% CO2條件下培養4h，每孔加MTT(5mg/mL) 20 μ L，繼續培養4h后，小心吸出培養上清，每孔加入DMS0150yL，待結晶充分溶解后，570nm處測定OD值。如圖1所示，圖1為牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞活力影響的柱狀圖，(η = 3，**ρ〈0.0lvs模型組)。結果:牛膝總皂苷能顯著抑制IL-1 β引起的大鼠軟骨細胞活力下降，且呈現濃度依賴關系。
[0032]實施例三:實施例二得到的第2?3代的軟骨細胞，接種于6孔細胞培養板，37°C和5% CO2培養箱中培養24h。加入牛膝總皂苷(終濃度為3，10，30 μ g/mL)或IL-1 β (終濃度為10ng/mL)，37°C，5% CO2條件下培養24h。
[0033]按照細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒說明書的方法進行檢測。結果參閱圖2，圖2為Hoechst33258染色檢測牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡的顯微圖，其中，(a)正常組，(b) IL-1 β，(c) IL-1 β + 牛膝總皂苷(3 μ g/mL)，(d) IL-1 β + 牛膝總皂苷(10 μ g/mL)，(e) IL-1 β +牛膝總皂苷(30 μ g/mL)。結果顯示:正常軟骨細胞呈藍色，IL-1 β誘導的軟骨細胞呈致密濃染，顏色發白，提示軟骨細胞發生凋亡。牛膝總皂苷(10，30yg/mL)可逆轉IL-1 β引起的軟骨細胞凋亡。
[0034]實施例四:用實施例三的方法將軟骨細胞接種及給藥。
[0035]給藥24h后，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，在Ih內進行流式細胞儀檢測。重點參閱圖3A和圖3B，其中，n = 3，*p〈0.05，**p〈0.0lvs模型組。圖3Α為Annexin V-FITC流式檢測牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡散點圖，其中(a)正常組，(b) IL-1 β，(c) IL-1 β + 牛膝總皂苷(3 μ g/mL)，(d) IL-1 β + 牛膝總皂苷(10 μ g/mL)，(e) IL-1 β +牛膝總皂苷(30 μ g/mL)，圖3B為Annexin V-FITC流式檢測牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡柱形圖。結果顯示刺激軟骨細胞24h后，細胞凋亡增力口，牛膝總皂苷對IL-1 β所致的軟骨細胞凋亡有一定的抑制作用。
[0036]重點參閱圖4，圖4是牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞凋亡蛋白的影響Western Blot圖。對于IL-Ιβ誘導的抗凋亡蛋白Bcl-Xlj表達降低和凋亡蛋白Bax、Bad表達上升，牛膝總皂苷有顯著抑制作用。
[0037]重點參閱圖5，圖5是牛膝總皂苷抑制IL-1 β誘導的軟骨細胞caspase3活性的柱狀圖，(n = 3, **p〈0.0lvs.模型組)。對于IL-1 β引起的細胞凋亡酶caspase3活性上升，牛膝總皂苷有顯著抑制作用。
[0038]重點參閱圖6，圖6為牛膝總皂苷對IL-1 β誘導的軟骨細胞中炎癥介質的影響Western Blot圖。牛膝總皂苷還可下調IL-1 β引起的基質金屬蛋白酶(ΜΜΡ3，ΜΜΡ9)和環氧化合酶(C0X-2)的表達。
[0039]實施例五:200±20g雄性SD大鼠36只，隨機分為6組:正常對照組、模型組、牛膝總皂苷(50、100、200mg/kg)三個劑量組、硫酸氨基葡萄糖(75mg/kg)陽性對照組。除對照組外，其余各組大鼠右肢膝關節腔注射10mg/mL的碘乙酸鈉生理鹽水溶液100 μ L，各組大鼠灌胃給藥或對照液，觀測大鼠關節腫脹情況。分別于造模前lh，及造模后第1，2，3，7，14，21天，用500型開式雙外爪游標卡尺測量各組大鼠右肢膝關節直徑。結果如下表:
[0040]
xV正常組模型組低劑量組中劑量組高削量組陽性對照組
N.(mm)(mm)(mm)(mm)(mm)(rnm)
第 0 天9.82±0.48 9.96±0.519.87±0.5310.05±0.37 9.98±0.239.9牡31
第 I 天9.99±0.2312.36±0.35##12.53±0.2512.03±0.35 12,03±0,1412,02±0.16*
第 2 天9.86±0.1513.87±0.48##13.23±0.5212.96士0.51*11.80±0.30*11.34±0.38-*
第 3 天10.01±0.1111.83±0.21##11.03±0.0710.65士0.20*10.42±0.11**10.30士0.08**
第 7 天10.85±0.0511.76±0.11##11.37±0.4811.26±0.3210.98±0.12**10.51±0.18**
第 M 天11.15士0,79 11,73±0.1511.47±0.2811.36士0.45 11.30±0.5111.11 士0.75
第 21 天11.07±0.82 11,74±0.0711.47±0,3011.38±0.41 11.27±0.5711.14±0.68
[0041](注:η= 6, *ρ〈0.05, **ρ〈0.0lvs.模型組，#p<0.05, ##p<0.0lvs.正常組)
[0042]實施例六:實施例五中大鼠造模后第28天，各組大鼠斷頭取血，分離膝關節軟骨標本。血清及標本_80°C凍存，進行各項指標的檢測。
[0043]重點參閱圖7，圖7為牛膝總皂苷對大鼠血清IL-1 β水平的影響柱狀圖，(η = 6，**P<0.01vs.模型組)。按照IL-Ιβ檢測試劑盒說明書進行測定，結果顯示:模型組大鼠血清中的IL-1 β水平顯著上升，牛膝總皂苷(100、200mg/kg)能顯著減少大鼠血清IL-1 β的水平。
[0044]重點參閱圖8，圖8為牛膝總皂苷對大鼠血清NO水平的影響柱狀圖，(η = 6，*Ρ<0.05, **p〈0.01vS.模型組)。按照一氧化氮(NO)檢測試劑盒說明書進行測定，結果顯示:模型組大鼠血清中的NO水平顯著上升，牛膝總皂苷能劑量依賴性降低大鼠血清NO的水平。
[0045]重點參閱圖9，圖9為牛膝總皂苷對大鼠血清羥脯氨酸水平的影響柱狀圖，(η = 6，**P<0.01vs.模型組)。按羥脯氨酸試劑盒說明書進行測定，結果顯示:模型組大鼠血清中羥脯氨酸水平顯著上升，牛膝總皂苷(100、200mg/kg)能顯著降低大鼠血清中Hyp的水平，表明牛膝總皂苷能抑制實驗性OA大鼠軟骨膠原蛋白的降解。
[0046]綜上，本發明的牛膝飲片經乙醇回流提取，正丁醇萃取，DlOl大孔吸附樹脂富集，獲得牛膝總皂苷。牛膝總皂苷對白細胞介素-1 β (IL-Ιβ)所致軟骨細胞凋亡有抑制作用，還可抑制IL-Ιβ引起的軟骨細胞炎癥反應，對軟骨細胞有顯著保護作用。大鼠右后肢膝關節腔注射碘乙酸鈉造成實驗性骨關節炎模型，牛膝總皂苷能顯著抑制實驗性骨關節炎大鼠關節腫脹，降低血清IL-1 β與一氧化氮(NO)水平，抑制軟骨膠原蛋白的降解，對實驗性骨關節炎大鼠有顯著治療作用。總之，本發明拓寬了牛膝總皂苷的應用范圍，也為骨關節炎的防治提供了新途徑。
[0047]雖然以上描述了本發明的【具體實施方式】，但是熟悉本【技術領域】的技術人員應當理解，我們所描述的具體的實施例只是說明性的，而不是用于對本發明的范圍的限定，熟悉本領域的技術人員在依照本發明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應當涵蓋在本發明的權利要求所保護的范圍內。
【權利要求】
1.一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用，其特征在于:中藥材牛膝經中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關節炎的藥物中。
2.如權利要求1所述的一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用，其特征在于:所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
3.如權利要求1所述的一種牛膝總皂苷在防治骨關節炎的藥物中的應用，其特征在于:所述牛膝總皂苷對白細胞介素-1 β所致軟骨細胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細胞介素-1β引起的軟骨細胞炎癥反應，對軟骨細胞有保護作用。
【文檔編號】A61P19/02GK104127455SQ201410342914
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】徐先祥, 張小鴻, 李瓊 申請人:華僑大學