一種喜樹堿類藥物的納米粒及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于醫藥【技術領域】，涉及一種羥基喜樹堿納米粒及其制備方法。所述的喜樹堿類藥物的納米粒采用溶劑沉淀或/和高壓均質法制備，其處方組成：羥基喜樹堿與穩定劑膽固醇-PEG的組合比例為1∶0.02～10。制備的喜樹堿藥物的納米粒載藥量高達98％，粒徑最小可達115nm，儲存穩定，體外具有良好的緩釋效果，無突釋；該納米?？捎行аb載具有喜樹堿骨架的各種藥物及其組合物；制備的羥基喜樹堿納米混懸劑，靜脈注射后體內較市售注射液顯著提高在血漿中的循環時間，能改善藥物的體內組織分布，表現出了卓越的抗腫瘤藥效，具有廣闊的開發前景。
【專利說明】一種喜樹堿類藥物的納米粒及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物制劑領域，具體涉及一種用Cholesterol-PEG穩定的喜樹堿類藥 物的納米粒、其制備方法及應用。

【背景技術】
[0002] 喜樹堿類藥物包括喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹 堿、9-硝基喜樹堿等，均為難溶性藥物，均具有內酯環和較好的抗腫瘤活性，其中10-羥基 喜樹堿（10-HCPT)臨床應用最為廣泛。10-HCPT(也簡稱為HCPT)是臨床治療癌癥的一線 藥物之一，分子式為C 2tlH16N2O5，分子量為364. 35,具有廣譜抗癌活性，腎毒性小，廣泛用于肝 癌、胃癌、頭頸部腫瘤、白血病、膀胱癌等的治療。
[0003] HCPT水溶性差，臨床常將其活性內酯環打開制成鈉鹽注射劑來使用，療效差、毒性 強、半衰期短，需多次給藥，病人耐受性差；同時結構中的酚羥基暴露在空氣中易被氧化。已 有的有關羥基喜樹堿的制劑的報道，載藥量大多較低（通常< 15%，少有> 25% )，且體外 釋放多存在突釋現象。
[0004] 納米粒是將藥物通過不同的方法制備成納米大小的顆粒，包括膠束、聚合物納米 粒、納米混懸劑等。由于具有較大的表面積，藥物溶出速度和程度均較高，納米粒已成為解 決難溶性藥物的給藥問題的主要方法之一。同時，藥物多包封在納米粒內部，進入體內之后 可以在一定時間內與外界環境隔離，從而在一定程度上保護不穩定的藥物，延緩代謝。表面 具有PEG鏈的納米粒，入血后還能避開血漿蛋白的調理，進而有效較少被吞噬系統的清除， 起到長循環作用，包封的藥物也從而能夠延長半衰期在一定程度上實現長效作用。如果納 米粒的粒徑較小（如 300nm 以內），還可由于 EPR(enhanced permeation and retention) 效應而被動靶向腫瘤。因此，納米給藥系統是解決難溶性藥物，尤其是難溶性抗腫瘤藥物的 臨床應用的有效手段。
[0005] 納米混懸劑是納米給藥系統的重要分支，是用合適的技術將藥物直接制備成納米 大小的微粒，并借助于穩定劑對其進行穩定而得到的給藥系統，是納米粒的一種。和使用 了大量輔料的其他納米給藥系統相比，納米混懸劑具有許多優點：（1)理論上，納米混懸劑 是近乎純藥物的納米粒，具有最大限度的載藥量和藥物傳輸效率，特別適合大劑量難溶性 藥物的口服和注射給藥；(2)適用范圍廣，無論是難溶于水的藥物，還是水、油都難溶的藥 物，都可利用一定的方法制得相應的納米混懸劑，且可通過相應技術實現工業化大生產。納 米混懸劑處方組成簡單、工藝簡單、制備快速，干燥后所得粉末作為中間體進一步制備成口 月艮、注射、外用等不同的劑型，方便攜帶，提高病人順應性。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的之一在于提供一種制備方法簡便、載藥量高、穩定性高，能實現羥基 喜樹堿和其他喜樹堿類藥物的體內外緩釋、改善其體內分布、增強抗癌療效的納米粒。
[0007] -種喜樹堿類藥物的納米粒，由喜樹堿類藥物和穩定劑組成，藥物與穩定劑的質 量比為I : 0· 02?10。
[0008] -種喜樹堿類藥物的納米粒，選用的穩定劑為膽固醇-聚乙二醇（chol-PEG)。
[0009] 本發明目的之二在于提供一種喜樹堿類藥物的納米粒的制備方法，本發明采用的 是溶劑沉淀或溶劑沉淀聯合高壓均質的方法制備納米粒，技術方案如下：
[0010] (1)喜樹堿類藥物和穩定劑溶于能與水混溶的有機溶劑中；
[0011] (2)超聲或攪拌條件下將含有藥物和穩定劑的有機溶劑加入到水中；
[0012] (3)減壓旋轉蒸發或透析法除去有機溶劑，或高速離心（至上清檢測不到納米粒 存在）收集沉淀后在加水懸浮；
[0013] (4)必要時高壓均質進一步減小粒徑。
[0014] 上述制備方法，其特征在于：步驟（1)所述的有機溶劑選自DMS0、DMF、甲醇、乙醇、 丙醇、乙腈、異丙醇、PEG400、PEG600中的一種或兩種或多種的混合體系；或者以上溶劑與 乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等于水不相混溶的有機溶劑的混合體系，只要混合體系能和 水混溶同時能很好滴溶解藥物和輔料即可。藥物在有機溶劑中的濃度為0. 001 %?20% (w/v)，穩定劑的濃度為0.001%?50% (w/v);步驟（2)中有機溶劑與水相的體積比為 1 : 2?100 (v/v);步驟（3)中高速離心條件為2000?60000rpm離心1?60min，棄去上 清，沉淀加水超聲復溶；步驟（4)高壓均質條件為溫度0?80°C，壓力500-4000bar，其中理 想均質條件為25°C、2000?2500bar、> 10次循環。
[0015] 步驟（3)和步驟⑷還可以通過冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或噴霧干燥等進一步固 化，所用凍干保護劑可以是PVP、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇中的一種或兩種及 兩種以上的組合，優選PVP為凍干保護劑；凍干保護劑的用量為納米粒重量的10-200%，優 選納米粒重量的20-50%的凍干保護劑。
[0016] 步驟（3)和步驟⑷通過冷凍干燥、噴霧冷凍干燥固化時，在某些時候（如 Ch〇leSter〇l-PEG600、合適的藥載比），甚至可以不用任何凍干保護劑，直接凍干，加水后即 可重建為原來的納米分散體系。
[0017] 本發明的目的之三在于提供一種羥基喜樹堿納米粒在制備注射劑中的應用，所述 的注射劑包括注射液和無菌粉針。本發明的羥基喜樹堿納米粒水相分散介質可用高濃度的 葡萄糖水溶液調成5 %葡萄糖生理等滲體系，適應臨床應用。本發明的羥基喜樹堿納米粒凍 干粉可加入適量的無菌藥用5%葡萄糖水溶液稀釋，重建成供靜脈給藥用的分散體系，適應 臨床使用。
[0018] 本發明的納米粒的優點在于：（1)處方簡單，最少可以只含有藥物和穩定劑 cholesterol-PEG ; (2)載藥量可高達98 %同時平均粒徑可小于200nm，具有非常高的藥物 傳輸效率，同時易實現對腫瘤的被動靶向；（3)體外釋放沒有突釋，即便在90%以上的高載 藥量也觀察不到明顯的突釋現象；（4)凍干保護劑用量少，即便在高達90%的載藥量下，僅 藥物重量的25%的凍干保護劑即可實現凍干后的加水重建；（5)載藥量可根據需要再很寬 的范圍內（10-98%)調整，在低載藥量時納米粒以膠束的形式存在。
[0019] 本發明的納米粒經大鼠藥動學實驗證明，長循環和緩釋效果明顯，血漿AUC較注 射液顯著提高，表觀半衰期顯著延長。
[0020] 本發明的納米粒經荷瘤小鼠實驗證明，能改善藥物的體內組織分布，很大程度實 現了對腫瘤的被動靶向，有助于提高藥效，降低毒副作用。
[0021] 本發明的納米粒經荷瘤小鼠藥效實驗證明，表現出較市售喜樹堿注射液好得多的 抗腫瘤藥效，用于腫瘤治療是一種很有前途的藥物遞送系統。
[0022] 本發明的納米粒工藝簡單，成分單純，易于控制生產，有廣闊的產業化前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為實施例1中羥基喜樹堿納米粒高壓均質前后的平均粒徑分布圖
[0024] 圖2為實施例1中的掃描電鏡照片（X 19000)
[0025] 圖3為實施例1中透射電鏡照片（X 19000)
[0026] 圖4為實施例1中X-粉末衍射圖譜（從上到下依次為羥基喜樹堿納米粒、羥基喜 樹堿原藥與穩定劑chol-PEG_的物理混合物、羥基喜樹堿原藥）
[0027] 圖5為實施例1中羥基喜樹堿在PBS中的體外釋放曲線（η = 3)
[0028] 圖6為實施例1中羥基喜樹堿在水中的體外釋放曲線（η = 3)
[0029] 圖7為實施例1中大鼠血藥濃度與時間變化的關系曲線（η = 8)
[0030] 圖8為實施例1中荷瘤小鼠體重隨時間變化曲線（η = 6)

【具體實施方式】 [0031]
[0032] 下面將描述本發明的幾個實施例，但本發明的內容完全不局限于此。
[0033] 實施例1
[0034] 稱取輕基喜樹堿25mg、Chol-PEG_ 2. 5mg溶于ImL DMF中，加熱至80°C，迅速注入 至4°C的5mL水中，注入完畢，250Hz、4°C超聲30min，HOOOrpm離心lh，棄上清（去除DMF)， 沉淀于60°C、250Hz超聲15min重新分散至5mL水中，25°C、2000bar、12次循環高壓均質即 得納米粒，平均粒徑為115. Onm (圖1)，多分散性指數（PDI)為0. 168。
[0035] 將羥基喜樹堿納米粒不凍干直接4°C保存60天后復溶，粒徑117. 3nm，穩定性良 好。不加保護劑凍干后于4°C保存，半年后再復溶，粒徑為120. 6nm，長期穩定性良好。
[0036] 實施例2
[0037] 稱取輕基喜樹堿25mg、Chol-PEG_ 2. 5mg溶于ImL DMF中，加熱至80°C，迅速注入 至4°C的5mL水中，注入完畢，250Hz、4°C超聲30min，HOOOrpm離心lh，沉淀于60°C、250Hz 超聲15min重新分散至5mL水中，25°C、2000bar、12次循環高壓均質即得納米粒，平均粒徑 為 126. Onm。
[0038] 實施例3
[0039] 稱7-乙基取輕基喜樹堿25mg、Chol-PEG_ 2. 5mg溶于ImL DMF中，加熱至80°C， 迅速注入至4°C的5mL水中，注入完畢，250Hz、4°C超聲30min，HOOOrpm離心lh，棄上清（去 除DMF)，沉淀于60°C、250Hz超聲15min重新分散至5mL水中，25°C、2000bar、12次循環高 壓均質即得納米粒，平均粒徑為131. Onm。
[0040] 實施例4
[0041 ]稱取 9-硝基輕基喜樹堿 12. 5mg、喜樹堿 12. 5mg、Chol-PEG5ticitl IOmg 溶于 ImL DMF-EtOH(4 : l，v/v)中，加熱至 50°C，注入至 4°C 的 5mL 水中，250Hz、4°C 超聲 30min， HOOOrpm離心lh，棄上清（去除DMF)，沉淀于60°C、250Hz超聲15min重新分散至5mL水 中，平均粒徑為167. Onm。
[0042] 實施例5
[0043] 稱取喜樹堿5mg、輕基喜樹堿10mg、7-乙基-10-輕基喜樹堿10mg、Chol-PEG 5_ 15mg溶于ImL DMF-丙酮（4 : 1)中，加熱至40°C，滴加至4°C的5mL水中，注入完畢，250Hz、 4°C超聲30min，HOOOrpm離心lh，棄上清（去除DMF)，沉淀于60°C、250Hz超聲15min重新 分散至5mL水中，平均粒徑為179. Onm。
[0044] 實施例6
[0045] 制備5mg/mL濃度的納米粒凍干，涂覆金6min后，通過掃描電鏡觀察并拍照，加速 電壓為30mV (圖2);制備5mg/mL濃度的混懸劑，吸取6 μ L滴到300目的銅網上，空氣中自 然晾干，后用〇. 1%磷鎢酸染色lOmin，透射電鏡下觀察粒子的形態（圖3)。
[0046] 實施例7
[0047] X-粉末射線衍射圖譜見圖4,樣品測量參數：Cu靶管照射，1.5406 A，40kV，100mA， 步寬：〇.〇Γ，掃描范圍：3-70°，結果可知羥基喜樹堿納米粒中藥物以晶型形式存在。
[0048] 實施例8
[0049] 羥基喜樹堿納米粒的體外釋放實驗
[0050] 方案：實驗采用透析袋法對羥基喜樹堿納米粒進行體外釋放實驗，同時用市售的 羧酸鹽型輕基喜樹堿注射液（Injections)做對照。取以上樣品各ImL(含藥200 μ g)于透 析袋（MWC0 = 3500)中，分別置于IOOmL釋放介質中，于37°C、IOOrpm條件下恒溫攪拌，，每 個時間點取ImL釋放外液HPLC測其中的藥物含量，同時補充等溫等體積的釋放介質，計算 累積釋放度，釋放介質采用〇. lmol/L、pH7. 4的PBS緩沖鹽或純水，同一樣品平行實驗3份。
[0051] 結果：納米粒顯著增強了藥物的緩釋效果，在水或PBS介質中均能緩釋72h(圖5 和圖6)，釋放行為接近零級釋放。
[0052] 實施例9
[0053] 羥基喜樹堿納米粒藥代動力學研究
[0054] 實驗動物：健康SD大鼠16只，雄性，體重200?220g。
[0055] 給藥方案：隨機分成兩組。給藥前禁食12h，自由飲水。以5mg/kg的劑量分別靜 脈注射給予羥基喜樹堿納米粒和市售注射劑。
[0056] 樣品采集：給藥后 5、15、30、60、120、240、480、720min 眼眶后取血 0· 5mL，5000rpm 離心取上清血漿；取收集的血漿200 μ L于EP管中，加冰醋酸20 μ L，于暗處轉化3h (將羧 酸鹽型轉化成內酯型）；加乙酸乙酯ImL,潤旋振蕩lmin, IOOOOrpm離心IOmin ;取上清,氮 氣吹干；剩余物加甲醇200 μ L超聲溶解，過0. 22 μ m針頭式濾器，取20 μ L以HPLC檢測。
[0057] 結果：平均血藥濃度數據用Phoenix WinNonlin(version6. 1)擬合，計算藥代動 力學參數，藥代動力學參數如下表（η = 8, mean土SD，*P <0· Olvs.市售注射劑）：

【權利要求】
1. 一種喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于：所述的納米粒由喜樹堿類藥物和穩定劑 組成，藥物與穩定劑的質量比為1 : 0.02?10。
2. 根據權利要求1所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于：所述的穩定劑為膽固 醇-PEG，其結構如下式所示，其中R可以為OH、OCH3、OCH2CH3、COOH、NH2 ;其中PEG的分子量 可以從200-10000,優選分子量400-5000,更優選分子量600-2000。
3. 根據權利要求1至2所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于：所述的喜樹堿類 藥物，是喜樹堿或具有喜樹堿骨架的衍生物，包括喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、 7 -乙基-10-輕基喜樹喊、9-硝基喜樹喊等。
4. 根據權利要求1至3所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于：所述的喜樹堿類 藥物，可以是權利要求4中所述的喜樹堿類藥物中的一種或兩種或多種藥物的組合物。
5. 如權利要求1至4所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于載藥量最高可達 98 %，粒徑10-1000nm，優選平均粒徑在20-200nm。
6. 根據權利要求1至5所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于：所述的納米粒包 括但不限于納米混懸劑、納米晶、納米粒、納米聚集體等，但不包括具有內水相的脂質體和 囊泡。
7. 如權利要求1至6所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于其中的喜樹堿類藥物 基本上是以內酯型存在。
8. 如權利要求1至7所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于其中的藥物具有良好 的緩釋作用，沒有突釋。
9. 根據權利要求1至8所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于：采用反溶劑法、高 壓均質法中的一種或兩種結合來制備。
10. 根據權利要求9所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于，制備方法包括以下步 驟： (1) 喜樹堿類藥物和穩定劑溶于能與水混溶的有機溶劑中； (2) 超聲或攪拌條件下將含有藥物和穩定劑的有機溶劑加入到水中； (3) 減壓旋轉蒸發或透析法除去有機溶劑，或高速離心（至上清檢測不到納米粒存在） 收集沉淀后在加水懸浮； (4) 必要時高壓均質進一步減小粒徑。
11. 根據權利要求9至10所述的喜樹堿類藥物的納米粒的制備方法，其特征在于：步 驟（1)所述的有機溶劑選自DMSO、DMF、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、異丙醇、PEG400、PEG600中 的一種或兩種或多種的混合體系；或者以上溶劑與乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等于水不 相混溶的有機溶劑的混合體系，只要混合體系能和水混溶同時能很好滴溶解藥物和輔料即 可。藥物在有機溶劑中的濃度為0.001%?20% (w/v)，穩定劑的濃度為0.001%?50% (w/v);步驟⑵中有機溶劑與水相的體積比為1 : 2?100(v/v);步驟⑶中高速離心條 件為2000?60000rpm離心1?60min，棄去上清，沉淀加水超聲復溶；步驟（4)高壓均質條 件為溫度〇?80°C，壓力500-4000bar，其中理想均質條件為25°C、2000?2500bar、彡10 次循環。
12. 根據權利要求9至11所述的喜樹堿類藥物的納米粒的制備方法，其特征在于：步 驟（3)和步驟（4)還可以通過冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或噴霧干燥等進一步固化，所用凍干 保護劑可以是PVP、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇中的一種或兩種及兩種以上的 組合，優選PVP為凍干保護劑；凍干保護劑的用量為納米粒重量的10-200%，優選納米粒重 量的20-50%的凍干保護劑。
13. 根據權利要求9至11所述的喜樹堿類藥物的納米粒的制備方法，其特征 還在于：步驟（3)和步驟⑷通過冷凍干燥、噴霧冷凍干燥固化時，在某些時候（如 Ch〇leSter〇l-PEG600、合適的藥載比），甚至可以不用任何凍干保護劑，直接凍干，加水后即 可重建為原來的納米分散體系。
14. 根據權利要求1至13所述的喜樹堿類藥物的納米粒，可用于制備注射劑，所述的 注射劑包括注射液和無菌粉針；水相分散介質可用高濃度的葡萄糖水溶液調成5%葡萄糖 生理等滲體系，適應臨床應用；本發明的羥基喜樹堿納米粒凍干粉可加入適量的無菌藥用 5 %葡萄糖水溶液稀釋，重建成供靜脈給藥用的分散體系，適應臨床使用。
15. 如權利要求1至14所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于注射給藥后，可以較 傳統注射劑獲得更好的藥物濃度、更長的血漿半衰期和更高的血藥濃度-時間曲線下面積 (AUC)，以及在肝、肺、腫瘤組織更高的藥物分布（AUC)。
16. 如權利要求1至14所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于給藥后，可以獲得較 傳統注射劑更好的抗腫瘤效果。
17. 如權利要求1至16所述的喜樹堿類藥物的納米粒，其特征在于：膽固醇-PEG是必 不可少的核心穩定劑；為進一步改善載藥納米粒的性質，還可以加入有其他藥劑上可以接 受的各種輔料作為非必需的輔助穩定劑，這些輔料包括但不限于PCL-PEG、磷脂、聚乙烯醇 等。
【文檔編號】A61K9/14GK104274413SQ201410362473
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】王向濤, 楊林潔, 洪靖怡, 邸靜 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所