本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)和生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨壞死是指人體骨骼活組織成份壞死。中國(guó)醫(yī)學(xué)把骨壞死稱之為骨蝕癥。而對(duì)于骨壞死，人體在任何部位都有可能發(fā)生，僅就缺血性壞死已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40余處，而股骨頭壞死發(fā)生率最高，這主要由生物力學(xué)和解剖學(xué)方面的特點(diǎn)來(lái)決定的。股骨頭壞死的病因不盡相同，由于缺乏縱向比較研究以及理想的動(dòng)物模型，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未得到統(tǒng)一定論，目前的研究主要集中于股骨頭的血管微循環(huán)和微血管缺血方面，盡管股骨頭壞死的病因存在很大的差異，但都有一個(gè)共同的基本病理變化：股骨頭血供減少或者中斷導(dǎo)致骨細(xì)胞壞死，隨后壞死區(qū)出現(xiàn)修復(fù)反應(yīng)，壞死與修復(fù)的過(guò)程交織進(jìn)行，壞死的終末期可出現(xiàn)股骨頭負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)面塌陷以及繼發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生。全能干細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞，同時(shí)還能表達(dá)多種基因，分泌多種成骨活性因子，為爬行替代、骨折愈合創(chuàng)造了有利條件，已在體外研究及體內(nèi)骨與軟組織損傷修復(fù)方面顯示出良好的應(yīng)用前景。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)全身或局部注入全能干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞很少發(fā)生移植排斥反應(yīng)，對(duì)于治療骨壞死具有一定的療效。目前，治療骨壞死的種子細(xì)胞主要為自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，但兩者均為成體干細(xì)胞類型，已經(jīng)具有一定的分化程度，在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)，這兩種成體干細(xì)胞很容易出現(xiàn)分化現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果較差，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于治療骨壞死具有一定的局限性，需要研發(fā)一種新型的能夠有效治療骨壞死的干細(xì)胞制劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。該干細(xì)胞制劑采用胚胎干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞聯(lián)合治療骨壞死，可有效促進(jìn)骨壞死的愈合，顯著提高新生骨的生長(zhǎng)，其治療效果顯著好于單純采用胚胎干細(xì)胞或骨髓單個(gè)核細(xì)胞的治療效果。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑，包括胚胎干細(xì)胞、骨髓單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)和溶媒。本發(fā)明采用胚胎干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞聯(lián)合治療骨壞死，替代骨髓干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞作為修復(fù)骨損傷的主要細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞保持著干細(xì)胞最為原始的分化潛能，并未出現(xiàn)細(xì)胞衰退凋亡現(xiàn)象，狀態(tài)優(yōu)良，且來(lái)源豐富，在體外分化能力強(qiáng)，治療效果顯著。此外，添加了骨髓單個(gè)核細(xì)胞，兩者聯(lián)合使用。研究顯示胚胎干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞聯(lián)合治療，可有效促進(jìn)骨壞死的愈合，顯著提高新生骨的生長(zhǎng)，其治療效果顯著好于單純采用胚胎干細(xì)胞或骨髓單個(gè)核細(xì)胞的治療效果。在骨頭修復(fù)過(guò)程中需要多種生長(zhǎng)因子的參與，而此時(shí)內(nèi)源性生長(zhǎng)因子往往難以滿足需要，故外源性生長(zhǎng)因子在骨頭壞死的治療中正逐漸受到重視。在骨頭壞死的治療過(guò)程中，采用一定的方法適時(shí)適量地引入特定的生長(zhǎng)因子，有助于骨頭缺損的修復(fù)與重建，這些特定的生長(zhǎng)因子主要分為促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和調(diào)控骨、軟骨細(xì)胞增殖分化因子。在本發(fā)明中，干細(xì)胞制劑中添加了單核細(xì)胞趨化因子-1，利于胚胎干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞形成骨組織。作為優(yōu)選，每1mL干細(xì)胞制劑中各組分的用量為：胚胎干細(xì)胞：(1～10)×106個(gè)；骨髓單個(gè)核細(xì)胞：(1～10)×106個(gè)；單核細(xì)胞趨化因子-1：1～20ng；溶媒：補(bǔ)足。優(yōu)選地，每1mL干細(xì)胞制劑中各組分的用量為：胚胎干細(xì)胞：(1～5)×106個(gè)；骨髓單個(gè)核細(xì)胞：(1～5)×106個(gè)；單核細(xì)胞趨化因子-1：10ng；溶媒：補(bǔ)足。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，每1mL干細(xì)胞制劑中各組分的用量為：胚胎干細(xì)胞：(1～2.5)×106個(gè)；骨髓單個(gè)核細(xì)胞：(1～2.5)×106個(gè)；單核細(xì)胞趨化因子-1：10ng；溶媒：補(bǔ)足。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，溶媒為生理鹽水。制劑中選用生理鹽水作為溶劑，其與人體組織的滲透壓一致，不會(huì)對(duì)骨組織產(chǎn)生損傷。但溶媒的種類并非限定于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的溶媒均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。作為優(yōu)選，干細(xì)胞制劑的保存溫度≤4℃。低溫保存制劑，一方面可避免MCP-1失活，另一方面則很好的保持了干細(xì)胞的生物活性，提高治療效果。作為優(yōu)選，干細(xì)胞制劑的劑型為注射劑。本發(fā)明還提供了該干細(xì)胞制劑在制備治療骨壞死藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，骨壞死為股骨頭壞死。本發(fā)明還提供了該干細(xì)胞制劑的制備方法，包括：將單核細(xì)胞趨化因子-1溶于溶媒中，得到單核細(xì)胞趨化因子-1溶液，采用單核細(xì)胞趨化因子-1溶液重懸胚胎干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞，制得干細(xì)胞制劑。本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。該干細(xì)胞制劑包括胚胎干細(xì)胞、骨髓單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)和溶媒。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢(shì)之一：1、本發(fā)明采用胚胎干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞聯(lián)合治療骨壞死，可有效促進(jìn)骨壞死的愈合，顯著提高新生骨的生長(zhǎng)，其治療效果顯著好于單純采用胚胎干細(xì)胞或骨髓單個(gè)核細(xì)胞的治療效果；2、在本發(fā)明中，干細(xì)胞制劑中添加了單核細(xì)胞趨化因子-1，利于胚胎干細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞形成骨組織，可提高療效；3、本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑制備時(shí)間短，制備效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。術(shù)語(yǔ)解釋：骨髓單個(gè)核細(xì)胞是指骨髓中的細(xì)胞核為單個(gè)的總稱，包括了造血干細(xì)胞(HSC)、MSCs、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)和基質(zhì)細(xì)胞等，是含有多種細(xì)胞成分的混合細(xì)胞群。單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)是最早發(fā)現(xiàn)并被廣泛研究的CC類趨化因子家族的成員之一，它對(duì)單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞有趨化作用。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離純化方法參考文獻(xiàn)為：孫林，周旭，章體玲.骨髓單個(gè)核細(xì)胞的提取、分離、標(biāo)記和體外培養(yǎng).中國(guó)心血管病研究[J],2008,6(8):777-779。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用中所用生物材料、試劑或儀器均可由市場(chǎng)購(gòu)得。其中胚胎干細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1干細(xì)胞制劑的制備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細(xì)胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個(gè)核細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，骨髓單個(gè)核細(xì)胞的終濃度為5.0×105個(gè)/mL，胚胎干細(xì)胞的終濃度為5.0×105個(gè)/mL。③把制劑均分至1-2個(gè)注射器中。④制劑保存運(yùn)輸：把制劑放入到無(wú)菌的空盒里，把裝有制劑的空盒轉(zhuǎn)移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進(jìn)行運(yùn)輸。⑤細(xì)胞及制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)A、細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)(形態(tài)、活力、表面抗原)：表1制劑中的細(xì)胞的活率項(xiàng)目實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4存活率(％)97.8996.4798.7699.43骨髓單個(gè)核細(xì)胞是一群細(xì)胞，是由多種類型的細(xì)胞組合而成，故不能通過(guò)表面抗原進(jìn)行檢測(cè)，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，即可獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞。B、制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)(細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素、五類病毒)：表2制劑制成后檢測(cè)結(jié)果注：由于胚胎干細(xì)胞購(gòu)買于中科院，其質(zhì)量不需要再做檢測(cè)。實(shí)施例2干細(xì)胞制劑的制備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細(xì)胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個(gè)核細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，骨髓單個(gè)核細(xì)胞的終濃度為1.0×106個(gè)/mL，胚胎干細(xì)胞的終濃度為2.5×106個(gè)/mL。③把制劑均分至1-2個(gè)注射器中。④制劑保存運(yùn)輸：把制劑放入到無(wú)菌的空盒里，把裝有制劑的空盒轉(zhuǎn)移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進(jìn)行運(yùn)輸。⑤細(xì)胞及制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)：試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1近似。實(shí)施例3干細(xì)胞制劑的制備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細(xì)胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個(gè)核細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，骨髓單個(gè)核細(xì)胞的終濃度為2.5×106個(gè)/mL，胚胎干細(xì)胞的終濃度為1.0×106個(gè)/mL。③把制劑均分至1-2個(gè)注射器中。④制劑保存運(yùn)輸：把制劑放入到無(wú)菌的空盒里，把裝有制劑的空盒轉(zhuǎn)移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進(jìn)行運(yùn)輸。⑤細(xì)胞及制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)：試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1近似。實(shí)施例4干細(xì)胞制劑的制備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細(xì)胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個(gè)核細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，骨髓單個(gè)核細(xì)胞的終濃度為5.0×106個(gè)/mL，胚胎干細(xì)胞的終濃度為5.0×106個(gè)/mL。③把制劑均分至1-2個(gè)注射器中。④制劑保存運(yùn)輸：把制劑放入到無(wú)菌的空盒里，把裝有制劑的空盒轉(zhuǎn)移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進(jìn)行運(yùn)輸。⑤細(xì)胞及制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)：試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1近似。實(shí)施例5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1、動(dòng)物造模：取30只新西蘭大白兔，3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(30mg/kg)，取髖關(guān)節(jié)前外側(cè)切口，顯露股骨頭及股骨頸前上部，行LightBμLb手術(shù)。在股骨頸軟骨與骨交界處，以3.5mm電鉆頭向股骨頭前內(nèi)側(cè)鉆孔，深約4.0mm。刮匙向內(nèi)側(cè)潛行刮除部分股骨頭松質(zhì)骨至軟骨下骨，約占股骨頭總體積的50％～60％，模擬骨壞死行病灶清理術(shù)，干紗布保護(hù)股骨頭以外組織，用沾有液氮的棉球即刻填塞于缺損區(qū)冷凍，連續(xù)冷凍25次，每次約8s，共持續(xù)約3min，使骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞壞死，生理鹽水復(fù)溫，制備ANFH動(dòng)物模型。2、股骨頭壞死(ANFH)動(dòng)物模型修復(fù)方法：試驗(yàn)分組：對(duì)照組：?jiǎn)渭兩睇}水復(fù)溫后即刻縫合切口；實(shí)施例1組：吸取50μL實(shí)施例1的干細(xì)胞制劑植入缺損區(qū)，使用骨蠟封閉骨孔，縫合切口；實(shí)施例2組：吸取50μL實(shí)施例2的干細(xì)胞制劑植入缺損區(qū)，使用骨蠟封閉骨孔。實(shí)施例3組：吸取50μL實(shí)施例3的干細(xì)胞制劑植入缺損區(qū)，使用骨蠟封閉骨孔。實(shí)施例4組：吸取50μL實(shí)施例4的干細(xì)胞制劑植入缺損區(qū)，使用骨蠟封閉骨孔。各組縫合切口，術(shù)后連續(xù)3天臀大肌注入硫酸慶大霉素注射液，2ml/只，每日一次。3、評(píng)價(jià)方法：a、影像學(xué)觀察(X線評(píng)分)術(shù)后2、4、8周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(30mg/kg)后取仰臥位，攝髖關(guān)節(jié)正位X線片，觀察髖關(guān)節(jié)和骨缺損灶骨密度變化，并行Lane-SandhuX線評(píng)分評(píng)價(jià)成骨情況。b、組織學(xué)檢測(cè)(不同時(shí)間點(diǎn)新生骨面積百分比)4、X線評(píng)價(jià)比較結(jié)果表3：各組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)X線評(píng)分比較組別制劑只數(shù)2周4周8周對(duì)照組生理鹽水30.34±0.161.05±0.041.48±0.03實(shí)施例1組實(shí)施例1制劑30.46±0.191.24±0.551.64±0.49實(shí)施例2組實(shí)施例2制劑31.75±0.42*2.28±0.37*3.81±0.56*實(shí)施例3組實(shí)施例3制劑31.89±0.37*2.33±0.51*3.96±0.43*實(shí)施例4組實(shí)施例4制劑32.59±0.27*4.57±0.16*6.47±0.38**表示與對(duì)照組相比，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lane-SandhuX線評(píng)分顯示：術(shù)后2、4、8周，實(shí)施例1與對(duì)照組1對(duì)比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。實(shí)施例2～4組成骨明顯優(yōu)于對(duì)照組1和實(shí)施例1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且實(shí)施例4成骨優(yōu)于實(shí)施例2、3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(對(duì)比實(shí)驗(yàn))本實(shí)施例動(dòng)物造模、修復(fù)方法及評(píng)價(jià)方法同實(shí)施例5，各組制劑組成如下：表4：本實(shí)施例中所用制劑組別具體組成對(duì)照組1生理鹽水對(duì)照組23.5×106/mL骨髓單個(gè)核細(xì)胞+10ng/mLMCP-1對(duì)照組33.5×106/mL胚胎干細(xì)胞+10ng/mLMCP-1實(shí)施例21.0×106/mL胚胎干細(xì)胞+2.5×106/mL骨髓單個(gè)核細(xì)胞+10ng/mLMCP-1實(shí)施例32.5×106/mL胚胎干細(xì)胞+1.0×106/mL骨髓單個(gè)核細(xì)胞+10ng/mLMCP-11、X線評(píng)價(jià)結(jié)果如下：表5：各組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)X線評(píng)分比較組別只數(shù)2周4周8周對(duì)照組160.29±0.160.89±0.351.27±0.51對(duì)照組261.24±0.19*1.67±0.26*1.98±0.33*對(duì)照組361.38±0.17*1.85±0.19*2.24±0.28*實(shí)施例2組61.75±0.13#2.28±0.17#3.81±0.16#實(shí)施例3組61.80±0.20#2.32±0.28#3.96±0.23#*表示與對(duì)照組1相比，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#表示與對(duì)照組2、3相比，P<0.01，具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lane-SandhuX線評(píng)分顯示：術(shù)后2、4、8周，對(duì)照組2、3與對(duì)照組1對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且實(shí)施例2、3與對(duì)照組1對(duì)比，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例2、3與對(duì)照組2、3對(duì)比，差異均具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明胚胎干細(xì)胞與骨髓單個(gè)核細(xì)胞組合使用后能夠產(chǎn)生更好的治療效果。2、新生骨面積百分比表6：各組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)新生骨面積百分比比較組別只數(shù)2周4周8周對(duì)照組166.7±1.717.5±2.424.8±3.6對(duì)照組2612.6±2.1*26.7±2.1*45.0±4.1*對(duì)照組3614.2±1.8*28.9±2.5*54.6±5.4*實(shí)施例2組618.4±1.3#42.5±3.4#72.6±3.2#實(shí)施例3組619.3±1.8#44.1±2.9#74.5±3.7#*表示與對(duì)照組1相比，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#表示與對(duì)照組2、3相比，P<0.01，具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。新生骨面積百分比檢測(cè)結(jié)果顯示：術(shù)后2、4、8周，對(duì)照組2、3與對(duì)照組1對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且實(shí)施例2、3與對(duì)照組1對(duì)比，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例2、3與對(duì)照組2、3對(duì)比，差異均具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明胚胎干細(xì)胞與骨髓單個(gè)核細(xì)胞組合使用后能夠產(chǎn)生更好的治療效果。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3