本發(fā)明涉及生物治療領(lǐng)域，特別涉及一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病作為一種內(nèi)分泌代謝性疾病，其患病率正隨著人口的增長、老齡化、城市化以及肥胖癥和缺乏運(yùn)動的普遍化逐漸增高。糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DiabeticRetinopathy,DR)是其較為嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，在我國，尤其在經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的大中城市的患病率正在逐年增加。經(jīng)調(diào)查研究表明，在世界范圍內(nèi)的萬盲人中，由DR致盲的占4.5％。因此，對致盲性眼病DR的治療迫在眉睫。DR是多因素導(dǎo)致的一種視網(wǎng)膜進(jìn)行性疾病，發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，涉及到大量不同的細(xì)胞、因子和分子。傳統(tǒng)的理論認(rèn)為，DR是一種視網(wǎng)膜微血管病變，但近些年來，越來越多的研究證實(shí)糖尿病影響了視網(wǎng)膜整個神經(jīng)血管單元，在疾病初期就引起了神經(jīng)血管耦合數(shù)量的減少，漸進(jìn)性的神經(jīng)變性，神經(jīng)膠質(zhì)增生以及神經(jīng)炎癥性改變，而這些病變都出現(xiàn)在臨床可見的視網(wǎng)膜微血管改變之前。視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、微循環(huán)系統(tǒng)以及慢性炎癥因素等在DR發(fā)病過程中相互作用導(dǎo)致病情持續(xù)的發(fā)展，進(jìn)而出現(xiàn)視網(wǎng)膜的微血管病變。目前，DR的主要治療措施包括藥物治療、激光治療和玻璃體切割手術(shù)治療3種方式。根本在于嚴(yán)格的血糖控制和血壓、血黏度管理，對于中重度非增殖型DR及早期的增殖型DR可行激光治療以降低致盲風(fēng)險，而對于伴有玻璃體出血或視網(wǎng)膜脫離的增殖型DR僅能行玻璃體手術(shù)治療。手術(shù)可以清除積血，解剖復(fù)位視網(wǎng)膜，但視網(wǎng)膜的功能早已受到損害，視力恢復(fù)并不理想，還有手術(shù)難度大，手術(shù)本身對視網(wǎng)膜的打擊以及術(shù)中及術(shù)后并發(fā)癥多等不利因素。近年來眼部新生血管研究進(jìn)展表明：血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是引起糖尿病性黃斑水(diabeticmacularedema，DME)和視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)的關(guān)鍵刺激因素。靶向抗VEGF生物治療雖然能改善DR引起的血視網(wǎng)膜屏障損傷，然而抗VEGF藥物治療仍屬于破壞新生血管、抗血管生成的領(lǐng)域，并不能從根本上阻止DR的發(fā)展，而且重復(fù)注射該藥物會造成視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的毒性損害。采取各種方式以降低糖尿病的發(fā)生率或是在可見的微血管病變發(fā)生之前阻止疾病的進(jìn)展才是最合理有效的。事實(shí)上，治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變最合理有效的方法是降低糖尿病的發(fā)生或是在可見的微血管病變發(fā)生之前阻止疾病的進(jìn)展。視網(wǎng)膜發(fā)生病變之前視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞和Müller細(xì)胞就已經(jīng)出現(xiàn)凋亡，如果有一種治療方法能夠在DR早期同時對這些方面進(jìn)行干預(yù)，則可能使DR的治療更加全面更有意義。視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞(retinalpigmentedepithelium，RPE)，在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的維持和自我更新上有重要的功能，如：吞噬消化脫落的光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤；促進(jìn)11一順視黃醛的再生；調(diào)節(jié)眼內(nèi)的免疫反應(yīng)；參與形成視網(wǎng)膜血管屏障等。有研究表明，將RPE細(xì)胞移植到病變視網(wǎng)膜下腔會延緩患者視覺喪失的進(jìn)程或部分恢復(fù)其視覺功能。視網(wǎng)膜下腔自體RPE細(xì)胞移植比較穩(wěn)定，且具有長期的療效。但其來源及數(shù)量限制阻礙了該方法在臨床上的廣泛應(yīng)用。目前，隨著DR發(fā)病機(jī)制逐步明了以及其創(chuàng)新性治療方式的陸續(xù)出現(xiàn)，干細(xì)胞注射療法越來越引起大家的關(guān)注。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療方式為中央和外周神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是神經(jīng)間隙的損傷創(chuàng)造了用于神經(jīng)再生的良好環(huán)境。外泌體(exosome)是一種提取自細(xì)胞培養(yǎng)基上清的膜性囊泡，含有其來源細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)蛋白成分，因此它能夠在不同細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞。大量研究報道，Exosome能夠參與調(diào)控重要的細(xì)胞生理活動，在免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)、凝結(jié)過程中發(fā)揮中重要作用，可以成為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療。因此，外泌體在細(xì)胞微環(huán)境中具有十分重要的作用。目前，研究表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(exosome)具有神經(jīng)營養(yǎng)以及免疫抑制作用，能通過傳遞減輕各種原因?qū)е碌囊暰W(wǎng)膜損傷、減輕炎癥反應(yīng)，從而改善視網(wǎng)膜功能，為臨床治療眼科疾病開辟新途徑。目前治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物治療藥物，如抗VEGF藥物雖然能改善視網(wǎng)膜的損傷，然而對血管具有毒性損害；具有高效療效的干細(xì)胞制劑由于其干細(xì)胞來源的特殊性及數(shù)量的有限性，限制了臨床的應(yīng)用。因此，研發(fā)一種高療效、毒副作用小且容易制備的干細(xì)胞制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員需要解決的技術(shù)問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，所述干細(xì)胞制劑治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變療效顯著、毒副作用小。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明公開了一種干細(xì)胞制劑，包括如下組分：5×104～1×106個/10μL的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和1×106個/10μL臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體。作為優(yōu)選，所述干細(xì)胞制劑包括如下組分：5×105個/10μL的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和1×106個/10μL臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體。作為優(yōu)選，所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞由所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而成。本發(fā)明還公開了所述干細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟：將所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞混合，制得所述干細(xì)胞制劑。本發(fā)明還公開了所述干細(xì)胞制劑或所述的制備方法制得的干細(xì)胞制劑在制備治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物制劑中的應(yīng)用。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定方法參考文獻(xiàn)《間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變實(shí)驗(yàn)研究》。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的制備及鑒定參考文獻(xiàn)《轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜色素上皮樣細(xì)胞的研究》，同濟(jì)大學(xué)學(xué)報，2015,36(5)。外泌體的分離純化和鑒定參考文獻(xiàn)《人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體免疫調(diào)節(jié)功能的研究》，中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，第32期。在臨床研究中，胚胎干細(xì)胞和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的應(yīng)用較為廣泛。然而，從臨床角度來看，骨髓的獲取是一種侵入性方式，增加患者痛苦，來源有限，并且隨著年齡的增加其增殖/誘導(dǎo)能力逐步下降；胚胎干細(xì)胞的來源有限而且其安全性和倫理性問題一直存在爭議。本發(fā)明采用自體臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的組合制劑進(jìn)行DR的治療。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源廣泛、取材方便、增殖力強(qiáng)、具備多向分化潛能及具備免疫調(diào)節(jié)作用的特點(diǎn)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外能夠誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞，將該分化細(xì)胞集落移植入肝臟內(nèi)，體內(nèi)肽、胰島素分泌增加，血糖水平得到控制。而且臍帶間充質(zhì)細(xì)胞可以通過藥物誘導(dǎo)分化化成視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞，替代或修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。局部注射后可以在適宜的微環(huán)境下分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞及前體細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，抑制眼底的局部炎癥反應(yīng)，營養(yǎng)和保護(hù)眼底組織。由同種屬來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體，及由自體來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞能降低所述干細(xì)胞制劑對機(jī)體的免疫原性，且本發(fā)明干細(xì)胞制劑的給藥方式是注射進(jìn)眼部玻璃體腔，注射進(jìn)玻璃體腔引起免疫排斥反應(yīng)可能性小。對本發(fā)明實(shí)施例制備的干細(xì)胞制劑進(jìn)行動物試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明實(shí)施例制備的干細(xì)胞制劑對糖尿病性視網(wǎng)膜病變有良好的療效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開的干細(xì)胞制劑對糖尿病性視網(wǎng)膜病變有良好的療效，且所述干細(xì)胞制劑中的細(xì)胞組分取材容易，來源廣泛，易于推廣應(yīng)用。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，所述干細(xì)胞制劑對糖尿病性視網(wǎng)膜病變有良好的療效。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例中所用組分和試劑均為市售或自制來源。本實(shí)施例以大鼠作為試驗(yàn)對象，所用的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為從大鼠體內(nèi)取材的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，所用的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞為從大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)而成。需要注意的是，本實(shí)施例公開的方法具有普適性，并不限于應(yīng)用在大鼠上，還可應(yīng)用于其它物種，也可應(yīng)用于人體。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定方法參考文獻(xiàn)《間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變實(shí)驗(yàn)研究》。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的制備及鑒定參考文獻(xiàn)《轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜色素上皮樣細(xì)胞的研究》，同濟(jì)大學(xué)學(xué)報，2015,36(5)。外泌體的分離純化和鑒定參考文獻(xiàn)《人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體免疫調(diào)節(jié)功能的研究》，中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，第32期。實(shí)施例1制備干細(xì)胞制劑將1×106個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與1×105個視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞混合，制成10μL混合干細(xì)胞制劑，使用的溶劑為生理鹽水。實(shí)施例2制備干細(xì)胞制劑將1×106個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與5×104個視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞混合，制成10μL混合干細(xì)胞制劑，使用的溶劑為生理鹽水。實(shí)施例3制備干細(xì)胞制劑將1×106個臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體與1×106個視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞混合，制成10μL混合干細(xì)胞制劑，使用的溶劑為生理鹽水。實(shí)施例4DR動物模型的建立及鑒定1、糖尿病模型的建立取健康雌雄性SD大鼠共38只，8～10周齡，體重200～220g。隨機(jī)分為正常對照組(n＝5)和模型組(n＝33)。均行裂隙燈、直接檢眼鏡檢查后，排除眼部疾病。大鼠適應(yīng)性詞養(yǎng)3天后，每只大鼠進(jìn)行體重測量，以45mg/kg計算鏈脲佐菌素(STZ)用量。將STZ溶解于新鮮配制的的梓檬酸-檬酸鈉緩沖液中，配成2％STZ溶液后，立刻進(jìn)行尾靜脈注射。注射后1周時釆尾尖血測血糖，血糖>16.7mmol/L為糖尿病模型建立成功。成模后，大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)及飲食，觀察飲食飲水、大小便、毛色、活動度、精神狀態(tài)等一般情況，每周定時檢測血糖和體重，定期觀察眼前節(jié)及眼底，每月行眼底照相、眼底熒光造影。期間發(fā)現(xiàn)死亡及血糖恢復(fù)的大鼠及時去除。2.糖尿病視網(wǎng)膜病變模型的鑒定糖尿病組大鼠造模成功后飼養(yǎng)10周，分別從正常對照組和模型組中隨機(jī)選擇2只進(jìn)行FITC-dextran熒光造影視網(wǎng)膜鋪片，以證實(shí)DR模型是否成功。FITC-dextran焚光造影視網(wǎng)膜鋪片的方法如下：(1)配液：將50mgFITC-dextran熒光素溶于1mL蒸饋水，用注射器抽取后備用。(2)麻醉：使用10％水合氯酸對實(shí)驗(yàn)大鼠行腹腔注射麻醉。(3)灌注：固定大鼠頭部、四肢，迅速開胸暴露心臟，由心尖部進(jìn)針行左心室灌注，大鼠的耳、鼻尖等部位出現(xiàn)黃色為灌注充分的標(biāo)志。(4)標(biāo)本采集：立刻摘除眼球，固定于4％多聚甲醛30分鐘。(5)視網(wǎng)膜鋪片：在眼科手術(shù)顯微鏡下，沿角鞏膜緣剪幵眼球，去除前節(jié)組織和玻璃體，小心分離出盡可能完整的視網(wǎng)膜，并以視盤為中心放射狀剪開，平鋪于載玻片上，滴2％中性樹膠1滴，蓋上蓋玻片。(6)觀察：使用突光顯微鏡觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)并拍照，取激發(fā)光波長490nm，濾過光波長520nm。結(jié)果顯示，38只大鼠造模成功。實(shí)施例5干細(xì)胞制劑的療效試驗(yàn)以實(shí)施例4建模成功的糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型作為試驗(yàn)對象，選取16只大鼠分為4組，每組均為4只大鼠(8只眼睛)。設(shè)置以下5個組別。正常處理組：取健康SD大鼠4只(8只眼睛)。空白對照組：局部注射生理鹽水注射液。試驗(yàn)組A：實(shí)施例1制備的干細(xì)胞制劑。試驗(yàn)組B：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞1×105個/10μL。試驗(yàn)組C：胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞1×105個/10μL。除正常組外，空白對照組雙眼玻璃體腔內(nèi)分別注射10μL生理鹽水，其它各組大鼠雙眼玻璃體腔分別注射10μL細(xì)胞懸液(均含1×105視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)；正常組大鼠兩只眼不給予任何干預(yù)。大鼠糖尿病成模后進(jìn)行試驗(yàn)，注射上述組別的液體，注射完4個月后處死大鼠，收集眼球標(biāo)本。建立模型前、糖尿病成模后及收集標(biāo)本時檢測大鼠血糖并記錄體重。采用EB灌注血管視網(wǎng)膜鋪片定量檢測觀察視網(wǎng)膜血管滲漏情況。玻璃體腔注射干細(xì)胞制劑的方法如下：(1)注射前將微量進(jìn)樣器(容積10μL)及眼科顯微鑷子等手術(shù)器械高壓蒸汽滅菌，冷卻干燥備用。(2)麻醉和固定：大鼠稱重，按3mL/kg的劑量腹腔注射10％水合氯醛進(jìn)行麻醉。大鼠結(jié)膜囊內(nèi)滴入復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，滴入鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，待四肢癱軟、角膜反射消失，將其固定在自制的泡沫手術(shù)臺上。(3)消毒：碘伏消毒結(jié)膜囊，1分鐘后用生理鹽水沖洗干凈。(4)用微量進(jìn)樣器抽取各試驗(yàn)組細(xì)胞懸液或生理鹽水20μL，排除空氣，在眼科手術(shù)顯微鏡下，于角膜緣后約2mm處以45℃角進(jìn)針將其注入大鼠玻璃體腔內(nèi)，并避免損傷晶狀體。透過晶狀體可見注射器針尖，緩慢推注，停留10秒后拔針，用棉簽在穿刺處輕壓1分鐘，防止注射液體返流。(5)最后在結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)左氧氟沙星滴眼液及紅霉素眼膏預(yù)防感染。(6)將大鼠置于溫暖環(huán)境中，觀察至蘇醒。視網(wǎng)膜EB滲漏定量分析方法如下：伊文思藍(lán)(evansblue，EB)是一種四鈉重氮染料，分子量為980Da，靜脈注射后能與血漿白蛋白以10:1的比例緊密結(jié)合，當(dāng)血管通透性增加時，EB蛋白質(zhì)復(fù)合物通過血管壁滲漏到周圍組織，是一種較理想的示蹤劑。(1)正常對照組取4只大鼠雙側(cè)眼球(8只眼)，DR模型實(shí)驗(yàn)組分別取4只大鼠右眼(8只眼)，進(jìn)行EB滲漏定量分析。(2)麻醉：大鼠稱重，按3mL/kg的劑量腹腔注射10％水合氯醛進(jìn)行麻醉。(3)灌注EB：用大剪刀剪開左側(cè)腹股溝部皮膚暴露左側(cè)股靜脈，用1mL注射器按45mg/kg抽取濃度為30g/L的EB溶液，在1分鐘內(nèi)注射入股靜脈，大鼠全身即刻變藍(lán)表明灌注成功。(4)在溫暖的環(huán)境中循環(huán)2小時，期間大鼠蘇醒需加用水合氯醛補(bǔ)充麻醉。(5)灌注PBS：固定大鼠四肢及頭部，打開胸腔，暴露心臟，由左心室插入灌注針頭，剪開右心耳，灌注PBS(37℃預(yù)熱)，灌注壓力為120mmHg(灌注流量相當(dāng)于66mL/分鐘)，時間2分鐘。(6)取材：灌注結(jié)束后迅速摘除眼球，在手術(shù)顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開，去除前節(jié)及晶狀體、玻璃體等組織，仔細(xì)分離視網(wǎng)膜組織。(7)干燥稱重：視網(wǎng)膜組織避光、置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)干燥45分鐘，稱其干重。(8)將每只視網(wǎng)膜與120μL甲酞胺70℃孵育18小時，提取液4℃15000rpm高速離心30分鐘，取上清分別測620nm及740nm的吸光度值，求其凈吸光度值。(9)紫外分光光度計測得濃度從75ng/μL～1000ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)EB溶液在620nm、740nm處的吸光度值，兩者之差即為凈吸光度值，建立EB標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)EB溶液濃度與凈吸光度值的關(guān)系，得到樣本實(shí)際溶液中EB濃度，用該濃度乘以120μL得出視網(wǎng)膜EB滲漏量(ng)。最后用視網(wǎng)膜干重(mg)標(biāo)化EB滲漏量(ng)，結(jié)果表示為ng/mg。試驗(yàn)結(jié)果如下組別正常對照組對照組試驗(yàn)組A試驗(yàn)組B試驗(yàn)組CEB滲透量024.67±2.2610.25±2.5617.25±2.5616.58±3.26采用SPSS20.0軟件(IBMSPSSStatistics)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，經(jīng)過比較，對照組與各試驗(yàn)組間有顯著差異(P<0.05)，且試驗(yàn)組A、B和C間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中試驗(yàn)組A的治療效果最好。說明實(shí)施例1制備的干細(xì)胞制劑，將臍帶間充質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體與由臍帶間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞混合使用，對糖尿病性視網(wǎng)膜病變有具良好的療效。用實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的干細(xì)胞制劑重復(fù)上述試驗(yàn)，得到同樣的結(jié)論。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3