本發明涉及生物治療領域，特別涉及一種干細胞制劑及其制備方法和應用。

背景技術：

黃斑區是視網膜的一個重要區域，位于眼后極部，主要與精細視覺及色覺等視功能有關。一旦黃斑區出現病變，常常出現視力下降、眼前黑影或視物變形。黃斑病變通常有兩種類型。一種是干性黃斑病變，一種是濕性黃斑病變。濕性黃斑變性占總發病率的10％，是由于視網膜下有異常的血管生長，新生血管破裂出血，并引起疤痕組織生長，使視力突然下降，會迅速嚴重地影響患者的中心視力，甚至導致中心視力喪失。濕性黃斑病變的主要癥狀表現為：中央視力快速減弱，視物變形，紙上字句彎曲，視覺中央出現黑影或模糊區域。目前對于黃斑病變的治療常常采用中醫或臨床手術等方法，但是該類方法僅能起到延緩病情，而不能起到根治的作用。此外，現有治療方法復發率高，長期致盲率高。

目前，越來越多的研究者將骨髓間充質干細胞(BMSCs)應用于視網膜病變(ROP)的治療。BMSCs治療ROP的機制表現如下：1.細胞遷移聚集到損傷區域，當視網膜血管損傷后，BMSCS會產生大量的生長因子，如血管內皮生長因子、血小板衍生因子和細胞間黏附因子等，在改善血管形成微環境方面起到重要作用；2.細胞移植參與修復：①被移植的干細胞向病變組織遷移、增殖、融合而補充已經受損的神經節細胞，并與宿主的神經細胞形成緊密的的突觸聯系，重建神經通路，完善相應功能；②通過自分泌及旁分泌的功能，發揮其移植后神經保護及營養作用；③免疫調節作用及下調炎癥反應，在一定程度上抑制相關炎性因子對視網膜血管細胞及神經組織的損傷，且減低了臨床移植后相關并發癥的發生概率。因此，研發一種對黃斑性病變具有良好療效的干細胞制劑是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，所述干細胞制劑對黃斑性病變有良好的療效。

本發明公開了一種干細胞制劑，包括：間充質干細胞、神經樣細胞和白蛋白。

作為優選，所述神經樣細胞由所述骨髓干細胞誘導分化而來。

作為優選，所述間充質干細胞為第二代至第五代的間充質干細胞。

作為優選，所述間充質干細胞的含量為1×10⁶～5×10⁶個/mL。

作為優選，所述神經樣細胞的含量為1×10⁶～5×10⁶個/mL。

作為優選，所述白蛋白的含量為2～15％。

本發明還公開了所述干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：

a1)將所述白蛋白和生理鹽水混合，配制白蛋白懸液；

a2)采用步驟a1)制備得到的白蛋白制劑重懸所述骨髓間充質干細胞，得到骨髓間充質干細胞制劑；

a3)采用步驟a2)制備得到的骨髓間充質干細胞制劑重懸所述神經樣細胞，得到所述干細胞制劑。

作為優選，所述白蛋白制劑的濃度為2～15％。

作為優選，所述間充質干細胞按照以下步驟獲得：

(1)將骨髓進行離心分離，得到原代間充質干細胞；

(2)重懸所述原代間充質干細胞，進行培養；

(3)換液除去未貼壁細胞，加入培養基繼續對所述原代間充質干細胞進行培養；

(4)對培養的細胞進行消化，得到間充質干細胞。

作為優選，所述神經樣細胞由所述間充質干細胞通過誘導分化得到。

作為優選，本發明還公開了所述的干細胞制劑或根據所述的制備方法制得的干細胞制劑在治療黃斑性病變中的應用。

綜上所述，本發明公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，該干細胞制劑包括骨髓間充質干細胞、神經樣細胞和白蛋白。通過將骨髓間充質干細胞聯合由骨髓間充質干細胞誘導分化而成的神經樣細胞進行視網膜下腔移植，能夠避免血液流動而造成外泌體的損失。此外，骨髓間充質干細胞可以分泌多種細胞因子直接參與損傷組織的修復，增強未損傷組織的抵抗能力，縮短組織修復時間。與此同時，神經樣細胞可直接參與神經損傷組織的替代修復，縮短了分化的時間，大大減少治愈期限。因此，治療效果明顯，且不出現不可逆的眼盲。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發明實施例中原代培養的骨髓間充質干細胞的光學顯微鏡圖；

圖2A為本發明實施例中骨髓間充質干細胞的對照管流式檢測結果圖；

圖2B為本發明實施例中骨髓間充質干細胞的樣品管流式檢測結果圖；

圖3為本發明實施例中神經樣細胞的熒光顯微鏡圖。

具體實施方式

本發明公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，該干細胞制劑能夠避免血液流動而造成外泌體的損失，增強未損傷組織的抵抗能力，縮短修復時間，對黃斑性病變具有良好的療效。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。

下面結合實施例，進一步闡述本發明。

實施例1制備骨髓間充質干細胞及神經樣細胞的誘導分化

1、骨髓間充質干細胞的原代培養

取收集好的骨髓，在超凈臺中采用Ficoll密度梯度離心方法，分離出骨髓間充質干細胞；用DMEM+10％FBS完全培養基重懸后接種至15cm規格的平皿中，轉移至5％CO₂、37℃的環境中培養。

培養48h后換液，補充新的完全培養基繼續培養，獲得可傳代的原代細胞；

2、骨髓間充質干細胞的傳代培養

1)取可傳代的P0代細胞，棄掉皿內原培養液，加入10mL PBS緩沖液輕輕沖洗細胞生長面，棄去洗液；

2)加入2mL0.25％胰蛋白酶，左右搖晃平皿使胰酶均勻覆蓋于皿底，在顯微鏡下觀察可見細胞間隙增大，胞質回縮，當長梭形細胞變圓變亮時，立即加入10倍體積的完全培養基終止消化；

3)用移液槍反復吹打，直至細胞全部脫落成單細胞懸液，將懸液轉移至離心管中，1500rpm室溫離心5min；

4)棄上清，加入DMEM+10％FBS完全培養基重懸細胞，細胞密度調至1×10⁵cells，置于37℃、5％二氧化碳和飽和濕度的細胞培養箱中培養；

5)待細胞生長至融合時，重復步驟2)，獲得本實施例所用的第二代至第五代骨髓間充質干細胞。圖1A為第二代骨髓間充質干細胞放大40倍的顯微鏡圖，圖1B為第二代骨髓間充質干細胞放大100倍的顯微鏡圖。

3、骨髓間充質干細胞的鑒定

收集傳代培養的骨髓間充質干細胞P₃代細胞3×10⁶cell，均分至三個EP管中，加入10％FBS+PBS吹打均勻后，1500rpm離心5min，棄上清。清洗2次后，每管細胞加入10％FBS+PBS各200uL，分別標記為對照管(C)、樣品管1(S1)、樣品管2(S2)。其中C管不添加任何東西，S1管添加CD45、CD73、CD90、HLA-DR；S2管添加CD105、CD11b、CD19、CD34；吹打均勻后，避光4℃孵育20min，孵育完加入10％FBS+PBS吹打均勻后，1500rpm離心5min后，棄上清。清洗2次后，用70um的濾網過濾，上流式儀檢測表面抗原。流式結果如圖2所示，圖2A為對照管(C)的流式檢測結果，圖2B為樣品管1(S1)和樣品管2(S2)的流式檢測結果。

根據2006年ISCT頒布的《間充質干細胞鑒定的最低標準》，CD73、CD90、CD105三種表面抗原的表達不低于95.0％；CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表達不高于2.0％。圖2A是骨髓間充質干細胞8種抗原相應的同型對照，圖2B是8種抗原的表達情況：CD73、CD90、CD105表達高于95.0％；HLA-DR、CD45、CD19、CD34、CD11b表達低于2.0％，符合干細胞的表面抗原特征，說明了骨髓干細胞并沒有出現分化的現象，仍維持著干細胞的特點。

4、骨髓間充質干細胞誘導分化形成神經樣細胞

觀察骨髓間充質干細胞，待細胞密度達70％左右時收集細胞于兩個15mL離心管，離心，PBS洗一遍，加入適量的含有堿性成纖維生長因子的預誘導培養液重懸沉淀，將細胞接種于放置了無菌玻片的細胞培養皿內進行細胞爬片，于5％CO₂、37℃的環境中培養；

24h后吸去預誘導培養基，以PBS漂洗2次后，添加含有二甲基亞砜和丁羥茴香醚的誘導培養液，轉移至5％CO₂，37℃的環境中培養；

24h后吸去誘導培養基，以PBS洗兩遍后，添加含25ng/mL神經生長因子(NGF)的完全培養基；對照組更換新的間充質干細胞培養基，連續培養12天，并每隔一天向培養基中添加適量神經生長因子(NGF)，使其維持25ng/mL的終濃度。

對神經樣細胞的鑒定步驟如下：

待神經球直徑約80μm撤去完全培養基，改用不含堿性成纖維細胞生長因子的培養基，并加入體積分數為10％的胎牛血清，調整細胞濃度以5×10⁸×L^-1接種于含有多聚賴氨酸包被的無菌玻片的24孔板中，每孔接種細胞懸液2mL，然后向每孔中加入200μLβ-TubulinⅢ單克隆抗體，將培養板送回培養箱繼續培養4d，中途不進行換液，密切觀察單細胞及神經球的形態學變化及分化情況。在誘導分化的第1天進行抗β-TubulinⅢ染色。誘導分化4d后免疫熒光染色進行分化表型的鑒定，并設置對照組，加入TRITC標記的山羊抗兔IgG二抗，中性樹膠封固，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

對神經樣細胞進行抗β-TubulinⅢ染色，發現染色結果呈陽性，如圖3所示。對照組均不顯色。用NIH ImageJ軟件對圖像作進一步分析處理，將β-TubulinⅢ熒光染色呈陽性的圖片融合、疊加，見β-TubulinⅢ復合多重熒光染色呈陽性。細胞胞體呈梭形或橢圓形，細胞胞體縮小向核靠攏，突起呈雙極或多極狀，細長的突起交織成網，在空間中形成立體神經環式聯系。

β-TubulinⅢ是原始神經上皮中所表達的最早的神經元標志物之一，是神經元的結構蛋白，其作為神經元特有標志物，被廣泛應用于神經生物學研究。從圖片可知，培養的細胞均表達β-TubulinⅢ蛋白，說明了培養的細胞是神經樣細胞。

實施例2干細胞制劑的制備

將白蛋白與生理鹽水混合，配制得到濃度為5％的白蛋白懸液；

收集實施例1制備的第二代到第五代任意一代的骨髓間充質干細胞，用生理鹽水清洗2遍，用白蛋白懸液重懸收集的骨髓間充質干細胞，將骨髓間充質干細胞的含量調整至3×10⁶cells，獲得骨髓間充質干細胞制劑，置于4℃環境中保存備用；

用骨髓間充質干細胞重懸神經樣細胞，并將神經樣細胞的含量調整至3×10⁶cells，制得干細胞制劑。

實施例3干細胞制劑的制備

將白蛋白與生理鹽水混合，配制得到濃度為2％的白蛋白懸液；

收集實施例1制備的第二代至第五代的骨髓間充質干細胞，用生理鹽水清洗2遍，用白蛋白懸液重懸收集的骨髓間充質干細胞，將骨髓間充質干細胞的密度調整至1×10⁶cells，獲得骨髓間充質干細胞制劑，置于4℃環境中保存備用；

用骨髓間充質干細胞重懸神經樣細胞，并將神經樣細胞的密度調整至1×10⁶cells，制得干細胞制劑。

實施例4干細胞制劑的制備

將白蛋白與生理鹽水混合，配制得到濃度為15％的白蛋白懸液；

收集實施例1制備的第二代至第五代的骨髓間充質干細胞，用生理鹽水清洗2遍，用白蛋白懸液重懸收集的骨髓間充質干細胞，將骨髓間充質干細胞的密度調整至5×10⁶cells，獲得骨髓間充質干細胞制劑，置于4℃環境中保存備用；

用骨髓間充質干細胞重懸神經樣細胞，并將神經樣細胞的密度調整至5×10⁶cells，制得干細胞制劑。

實施例5動物試驗

1、動物：選取濕性黃斑病變的大鼠模型，體重相近，不分雌雄，共40只。造模方法為將大鼠麻醉后往視網膜下腔注射基質膠。

2、試驗分組：將濕性黃斑病變的大鼠均分為4組，每組各10只，分組如表1所示；每組制劑的移植體積均為50uL，2周后進行檢測。

3、采用3D Topcon OCT-1000進行檢查，檢查參數為：掃描深度6.0mm×6.0mm，掃描長度隨病變范圍而調整，掃描方式為垂直或水平線形掃描。試驗結果見表1。

表1試驗分組及試驗結果

從結果可知，使用實施例2～5制備的干細胞制劑進行回注，可以對濕性黃斑病變的取得較為明顯的改善作用，治愈率為75.0％～95.0％。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。