本發明涉及納米生物醫學技術領域，具體地說，是一種應用于神經外科間接血管搭橋術的生物可降解納米纖維膜片及制備方法。

背景技術：

缺血性腦血管疾病是直接威脅人類健康的重大疾病，常見于顱內外血管狹窄或閉塞、腦動脈硬化性小血管病變、煙霧病等【Qiu L,Ng G,Tan EK,et al.Chronic cerebral hypoperfusion enhances Tau hyperphosphorylation and reduces autophagy in Alzheimer's disease mice.Sci Rep,2016；6:23964.Araki Y,Takagi Y,Ueda K,et al.Cognitive function of patients with adult moyamoya disease.J Stroke Cerebrovasc Dis,2014；23:1789-1794.Su SH,Hai J,Zhang L,et al.Assessment of cognitive function in adult patients with hemorrhagic moyamoya disease who received no surgical revascularization.Eur J Neurol,2013；20:1081-1087.】，長期的腦供血不足可導致神經細胞變性、凋亡、患者認知功能障礙以及社會行為能力低下等【Wang Z,Fan J,Wang J,et al.Chronic cerebral hypoperfusion induces long-lasting cognitive deficits accompanied by long-term hippocampal silent synapses increase in rats.Behav Brain Res,2016；301:243-252.】，嚴重影響了患者的生存質量，臨床上尚缺乏有效的治療措施。

顱內外血管重建通過直接或間接方法將顱外血管與顱內血管溝通，重建缺血區腦循環，臨床用于治療缺血性腦血管病【Reynolds MR,Derdeyn CP,Grubb RL Jr,et al.Extracranial-intracranial bypass for ischemia cerebrovascular diease:what have we learned from the carotid occlusion surgery study.Neurosurg Focus,2014；36:E9.】。直接顱內外血管搭橋術有助于迅速改善腦血流，但在手術過程中需臨時阻斷受血血管，有可能加重腦缺血；血管重建后腦血流動力學急劇變化誘發再灌注損傷、腦出血、過度灌注；遲發性吻合血管閉塞導致搭橋手術失敗等風險【Jinlu Yu,Lei Shi,Yunbao Guo et al.,Progress on Complications of Direct Bypass for Moyamoya Disease.Int J Med Sci.2016；13(8):578–587.】。直接顱內外血管搭橋手術主要用于巨大顱底腫瘤切除或復雜顱內動脈瘤孤立時，需臨時犧牲顱內主要受累供血動脈，其臨床應用范圍極為有限。

臨床和相關基礎研究顯示顱內外間接搭橋是一種安全的血管重建方法，將顳肌、硬膜或血管貼敷于缺血區腦組織，顱外血管以“按需生長”的方式向顱內生長，避免直接搭橋僅限于受血血管分布范圍的局限性，并且不受急性腦缺血時間窗的限制，可在圍缺血期的任何時間進行手術；同時也可規避直接血管搭橋所引起的缺血再灌注損傷【Starke RM,Komotar RJ,Hickman ZL,et al.Clinical features,surgical treatment,and long-term outcome in adult patients with moyamoya disease.J Neurosurg.2009；111:936-942.】。但間接顱內外血管搭橋術后血管再生程度存在明顯的個體化差異，臨床效果報道不一，如何實時調控缺血區腦組織中的血管再生已成為臨床上亟待解決的關鍵問題。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是促進血管生成的關鍵因子，可實時調節血管內皮細胞的分裂與增殖，參與多種生理病理過程，如組織損傷修復、腦外傷、腦卒中等【Carmeliet P,Jain RK.Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.Nature.2011；473:298-307.】；通過直接激活神經祖細胞分化和成熟、軸突生長，具有神經保護作用【Dumpich M,Mannherz HG,Theiss C.VEGF signaling regulates cofilin and the Arp2/3-complex within the axonal growth cone.Curr Neurovasc Res.2015；12:293-307.】。有研究在顱內外間接血管重建過程中，局部移植表達VEGF-A的成肌細胞，結果發現皮層血管生成有所增加，但局部腦血流改善并不明顯，可能與移植細胞粘附、遷移和VEGF-A表達有關【Hecht N,Marushima A,Nieminen M,Kremenetskaia I,von Degenfeld G,Woitzik J,et al.Myoblast-mediated gene therapy improves functional collateralization in chronic cerebral hypoperfusion.Stroke.2015；46:203-211.】。由此可見，VEGF局部釋放有助于提高間接顱內外血管搭橋術后的血管再生，但如何實時有效控釋VEGF，促進缺血區腦組織中血管“按需生長”，目前仍缺乏有效的方法。而且采用局部注射無法直接作用于間接血管搭橋的組織界面，對腦皮層的血管再生缺乏持續的刺激作用。

綜上所述，現有文獻的報導中，尚未有關于本發明中所述的生物可降解納米纖維膜片，并以生長因子控釋的方式促進缺血腦組織中的血管和(或)神經再生的相關研究報道。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種應用于神經外科間接血管搭橋術的生物可降解納米纖維膜片。

本發明的再一的目的是，提供該生物可降解納米纖維膜片的制備方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：一種應用于神經外科間接血管搭橋術的生物可降解納米纖維膜片，通過以下方法制得：將生物可降解聚合物材料，溶于極性、易揮發有機溶劑中，通過靜電紡絲方法，制得由直徑為納米尺度的超細纖維組成的膜片；通過層層自組裝技術將促進腦組織血管再生和/或促進神經再生的生長因子或多肽序列負載至膜片上，經干燥制得產品。

所述的生物可降解聚合物材料為：聚己內酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、絲素蛋白、膠原蛋白中的一或幾種。

所述的極性、易揮發有機溶劑為：三氯甲烷、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、六氟異丙醇、三氟乙酸、甲酸、乙酸或丙酮中的一種或幾種溶劑的混合物。

靜電紡絲方法所施加直流高壓范圍為：10-30KV，流量為0.1-1ml/h，時間為3-5h，噴絲頭距離收集裝置的距離為：20-100cm。

促進腦組織血管再生的生長因子為血管內皮生長因子。

促進腦組織神經再生的生長因子為神經生長因子。

所述的層層自組裝技術為聚電解質的靜電層層自組裝技術。

所述的聚電解質包括帶正電的聚電解質和帶負電的聚電解質，所述的帶正電的聚電解質為聚乙烯亞胺、聚丙烯胺鹽酸鹽、膠原蛋白、殼聚糖中的一種或幾種；所述的帶負電的聚電解質為聚苯乙烯磺酸鈉、海藻酸鈉、透明質酸、硫酸軟骨素中的一種或幾種。

層層自組裝技術的實現方法為：將膜片用水洗滌后真空干燥后待用，將干燥后的膜片浸入聚烯丙胺溶液中浸泡，然后用水浸泡；再將促進腦組織血管再生和/或促進神經再生的生長因子制成生長因子溶液，把膜片置于所述的生長因子溶液中浸泡吸附，然后用水洗滌；然后依次浸入帶負電的聚電解質溶液、生長因子溶液和帶正電的聚電解質溶液中，循環5-10次，每次浸泡后均用水洗脫；完成后用氮氣氣流干燥，即得到產品。

為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是：所述的制備方法包括以下步驟：將生物可降解聚合物材料，溶于極性、易揮發有機溶劑中，通過靜電紡絲方法，制得由直徑為納米尺度的超細纖維組成的膜片，將膜片用水洗滌后真空干燥后待用；將干燥后的膜片浸入聚烯丙胺溶液中浸泡，然后用水浸泡；再將血管內皮生長因子和/或神經生長因子制成生長因子溶液，把膜片置于所述的生長因子溶液中浸泡吸附，然后用水洗滌；然后將膜片依次浸入帶負電的聚電解質溶液、生長因子溶液和帶正電的聚電解質溶液中，循環5-10次，每次浸泡后均用水洗脫；完成后用氮氣氣流干燥，即得到產品；

所述的生物可降解聚合物材料為：聚己內酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、絲素蛋白、膠原蛋白中的一或幾種；

所述的極性、易揮發有機溶劑為：三氯甲烷、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、六氟異丙醇、三氟乙酸、甲酸、乙酸或丙酮中的一種或幾種溶劑的混合物；

靜電紡絲方法所施加直流高壓范圍為：10-30KV，流量為0.1-1ml/h，時間為3-5h，噴絲頭距離收集裝置的距離為：20-100cm；

所述的帶正電的聚電解質為聚乙烯亞胺、聚丙烯胺鹽酸鹽、膠原蛋白、殼聚糖中的一種或幾種；

所述的帶負電的聚電解質為聚苯乙烯磺酸鈉、海藻酸鈉、透明質酸、硫酸軟骨素中的一種或幾種。

本發明優點在于：

本發明的應用于腦神經外科間接搭橋術的生物可降解納米纖維膜片無毒性，在體內降解后不會產生有害物質，具有良好的生物相容性。通過層層自組裝技術在納米纖維膜片上負載生長因子，可以避免有機溶劑、強酸強堿、高溫等因素造成生長因子失活，組裝的聚電解質可以保證膜片上負載的生長因子保持良好的活性。該納米纖維膜片可以在腦部血管梗阻部位長期控制釋放VEGF、NGF等生長因子，由此可以誘導調控腦組織血管梗阻部位的血管再生以及神經再生。

附圖說明

附圖1：負載生長因子的納米纖維膜片電鏡圖。

附圖2：生長因子釋放曲線。本發明能夠在30天以上控釋生長因子，藥物釋放圖充分說明了按本發明所得到的產品能保證在神經外科間接搭橋術后的藥物控釋功能，促進缺血腦組織中血管生成以及神經再生。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1

采用PCL為原料，溶解于三氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中(體積比9:1)，制成濃度為6％(wt)的溶液。將此混合物溶液加入到通過注射泵控制的靜電紡絲注射器中，設定高壓發生器的電壓為15KV，收集距離為15cm，可以獲得由直徑為納米尺度的超細纖維組成的膜片，然后將此膜片用去離子水多次洗滌后真空干燥后待用。將干燥后的膜片浸入聚烯丙胺(PAH，0.1-1mg/ml)溶液中，浸泡30-60分鐘，然后用去離子水浸泡10分鐘。再將VEGF和NGF制成0.1-10μg/ml濃度的混合生長因子溶液，把膜片置于此生長因子溶液中浸泡10-20分鐘進行吸附，然后用去離子水洗滌。然后依次浸入聚苯乙烯磺酸鈉(PSS，0.1-1mg/ml)溶液、生長因子溶液和聚烯丙胺(PAH，0.1-1mg/ml)溶液中，循環5-10次，每次浸泡10-20分鐘，每次浸泡后均用去離子水洗脫。完成后用氮氣氣流干燥。即得到應用于腦神經外科間接搭橋術的生物可降解納米纖維膜片。

實施例2

采用PLGA為原料，溶解于六氟異丙醇中，制成濃度為7％(wt)的溶液。將此混合物溶液加入到通過注射泵控制的靜電紡絲注射器中，設定高壓發生器的電壓為14KV，收集距離為15cm，可以獲得由直徑為納米尺度的超細纖維組成的膜片，然后將此膜片用去離子水多次洗滌后真空干燥后待用。將干燥后的膜片浸入聚烯丙胺(PAH，0.1-1mg/ml)溶液中，浸泡30-60分鐘，然后用去離子水浸泡10分鐘。再將VEGF和NGF制成0.1-10μg/ml濃度的混合生長因子溶液，把膜片置于此生長因子溶液中浸泡10-20分鐘進行吸附，然后用去離子水洗滌。然后依次浸入聚苯乙烯磺酸鈉(PSS，0.1-1mg/ml)溶液、生長因子溶液和殼聚糖(Chitosan，0.1-1mg/ml)溶液中，循環5-10次，每次浸泡10-20分鐘，每次浸泡后均用去離子水洗脫。完成后用隨后用氮氣氣流干燥。即得到應用于腦神經外科間接搭橋術的生物可降解納米纖維膜片。

實施例3

采用PCL和膠原蛋白(collagen)為原料(比例為2:1)，溶解于六氟異丙醇中，制成濃度為7％(wt)的溶液。將此混合物溶液加入到通過注射泵控制的靜電紡絲注射器中，設定高壓發生器的電壓為15KV，收集距離為15cm，可以獲得由直徑為納米尺度的超細纖維組成的膜片，然后將此膜片用去離子水多次洗滌后真空干燥后待用。將干燥后的膜片浸入聚烯丙胺(PAH，0.1-1mg/ml)溶液中，浸泡30-60分鐘，然后用去離子水浸泡10分鐘。再將VEGF和NGF制成0.1-10μg/ml濃度的混合生長因子溶液，把膜片置于此生長因子溶液中浸泡10-20分鐘進行吸附，然后用去離子水洗滌。然后依次浸入海藻酸鈉/PSS混合溶液(海藻酸鈉，0.1-1mg/ml；PSS，0.1-1mg/ml)、生長因子溶液和膠原蛋白/聚烯丙胺混合溶液(Collagen，0.1-1mg/ml；PAH，0.1-1mg/ml)溶液中，循環5-10次，每次浸泡10-20分鐘，每次浸泡后均用去離子水洗脫。完成后用隨后用氮氣氣流干燥。即得到應用于神經外科間接血管搭橋術的生物可降解納米纖維膜片。

采用靜電紡絲技術制備生物可降解聚合物如聚已內酯、聚乳糖、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、膠原蛋白、絲素蛋白的納米纖維薄膜，該納米纖維薄薄膜是一種非免疫源性納米級材料，可完全降解吸收，具有優良的細胞粘附性和生物相容性。通過層層自組裝技術，可將帶有相反電荷的聚電解質逐層吸附到納米纖維膜的纖維上，由于VEGF本身帶有負電荷，可被帶正電荷的聚電解質吸附，從而在組裝過程中，VEGF可逐層被吸附到聚電解質層中。通過這種方法可有效調控VEGF的緩釋，促進缺血區血管網絡化生成，有望克服間接顱內外血管重建過程中血管再生不足的缺陷，根本改善患者預后。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。