本發明涉及胰島素給藥載體技術領域，具體涉及一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法。

背景技術：

胰島素是治療糖尿病最常用和最有效的藥物。目前，胰島素最常用的給藥方式是皮下注射給藥。這種給藥方式容易引起感染、過敏反應以及注射位點的脂肪代謝障礙，并且注射疼痛、需要專人進行給藥等缺點也給患者帶來很大困擾。因此，亟需研究開發更加經濟、方便和無痛的新型胰島素給藥系統。

口服胰島素給藥系統是近年來發展的一種新型胰島素給藥系統，這一系統的生理作用機制與胰島素在體內分泌后的內生通路相似，即胰島素首先經過肝臟而不是直接到達血液循環系統。肝臟在血糖水平調節中起著重要作用，它是第一個也是最重要的胰腺分泌胰島素的目標器官。然而，采用皮下注射給藥時只有一小部分(大約為20％)的胰島素到達了肝臟，大量胰島素直接進入血液循環系統，極易引發低血糖癥。口服胰島素給藥系統模擬人體葡萄糖代謝的生理機制，胰島素被吸收后首先經過肝臟，降低在系統循環中的胰島素水平，從而減小低血糖癥發作的風險。但是，口服胰島素給藥系統的實現仍然面臨很多問題。胰島素的口服給藥需要通過胃腸道中的極端環境，酸性的胃液和堿性的腸液以及多種消化酶，并且還需要通過腸道粘液屏障以及上皮細胞層屏障。胰島素作為一種蛋白質類藥物，在人體胃腸道內很容易被蛋白酶水解，失去生物功能。這為胰島素口服給藥的實現帶來了極大的挑戰。

在過去的幾十年內，納米科技和納米藥物的快速發展為口服生物分子類藥物帶來了新的發展契機。研究者們設計開發了多種藥物載體，如聚合物納米顆粒、脂質體、膠束、微膠囊、微凝膠等，對胰島素進行包覆修飾。這些藥物載體能夠保護胰島素的結構和功能不被破壞，從而提高胰島素的吸收率。目前，口服胰島素載體的構筑基元主要包括殼聚糖、葡聚糖、海藻酸鈉和透明質酸等天然聚合物，以及聚乳酸、聚丙烯胺和聚己內酯等合成聚合物。然而，這些藥物載體的制備過程常常需要使用高溫、超聲、劇烈的攪拌等手段，極易對胰島素的結構和生物活性造成破壞。因此，科研人員一直在尋找更好的胰島素載體的制備方法和材料。

近年來，多巴胺由于在弱堿性條件下能夠發生氧化自聚合反應生成聚多巴胺，并且這種自聚合反應可以發生在各種無機和有機材料的表面上，而成為一種新穎的制備表面涂層材料的仿生構筑基元。據文獻報道，聚多巴胺這種極強的粘附性質是因為其分子結構與水生生物貽貝的粘著斑的化學結構相近，二者均富含3,4-二羥基-L-苯丙氨酸和賴氨酸結構單元。此外，聚多巴胺涂層表面的酚羥基和氨基基團賦予其較高的化學反應活性，如酚羥基與巰基的脫水縮合反應、酚羥基與多種金屬離子的絡合反應、氨基基團的邁克爾加成和希夫堿反應等，使其能夠與多種化學分子發生反應。研究者們常利用這些反應對聚多巴胺涂層進行表面修飾，從而制備多功能的復合材料。聚多巴胺涂層除具有極強的粘附能力和較高的化學反應活性外，還具有非常優良的生物相容性，從而使其在生物醫藥領域具有很大的應用前景。

上述分析結果表明，很難通過溫和、快速和可控的反應制備具有良好的生物相容性、能夠克服胃腸道屏障的口服胰島素給藥載體，仿生聚多巴胺材料為胰島素給藥系統的制備帶來新的發展機遇。

技術實現要素：

為了克服上述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，該載體具有良好的生物相容性，能夠克服胃腸道屏障，具有胰島素釋放速率可控的優點。

為了達到上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，包括以下步驟：

1)將胰島素粉末溶解在酸性溶液中使濃度達到5-50mg/mL，向其中加入氯化鈉，使氯化鈉的含量為0.5-5mol/L，通過鹽析法制備胰島素微納米顆粒；

2)將胰島素微納米顆粒分散在多巴胺的弱堿性溶液中，使得胰島素的濃度為10-80mg/mL，多巴胺的濃度為0.5-5mg/mL，震蕩下反應，得到聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構；

3)將聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構分散在功能性分子的溶液中，使得聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構的濃度為10-80mg/mL，功能性分子的濃度為5-10mg/mL，在核殼結構表面修飾功能性分子，得到能夠克服腸道屏障的生物相容性的聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體。

所述的胰島素為人胰島素、牛胰島素、豬胰島素、羊胰島素、馬胰島素、狗胰島素或貓胰島素中的一種或多種。

所述的酸性溶液為鹽酸溶液，其pH為1-2。

所述的通過鹽析法制備胰島素微納米顆粒的水浴反應溫度為5-20℃；反應條件為震蕩、攪拌或是超聲處理；反應時間為0.5-3h。

所述的鹽析法制備胰島素微納米顆粒，制備后通過分散在2mol/L氯化鈉溶液中進行清洗，離心分離，得到純凈的胰島素微納米顆粒。

所述的弱堿性溶液為Tris-HCl溶液、Tris-HCl及H₂O₂溶液、或者NaOH及H₂O₂溶液，溶液的pH為7.5-10.5。

所述的震蕩下反應的震蕩轉速為500-1500rpm；反應時間為12-48h；反應溫度為4-30℃。

所述的聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構通過離心、分散在弱堿性溶液中清洗，并保存在4℃環境中。

所述的功能性分子為能夠與疏水性的、帶負電荷的腸道粘液發生較強的相互作用或是能夠與腸道粘液內的糖蛋白進行特異性識別的生物靶向分子，包括聚乙二醇、殼聚糖、陽離子脂質體和凝集素，這些分子可以提高載體在胃腸道中的穩定性，延長其在腸道粘液內的停留時間，進而提高胰島素的吸收率。

所述的步驟3)通過共價鍵或非共價鍵相互作用在聚多巴胺微膠囊表面修飾功能性分子。

所述的步驟3)功能性分子的具體反應為通過與戊二醛的希夫堿反應在聚多巴胺微膠囊表面修飾殼聚糖、陽離子脂質體和凝集素，通過酚羥基與巰基的脫水縮合反應修飾帶巰基的聚乙二醇分子。

上述聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的應用，包括測試聚多巴胺微膠囊胰島素給藥載體與粘蛋白的相互作用，評估功能性修飾的載體克服腸道屏障的能力；測試聚多巴胺微膠囊胰島素給藥載體的胰島素釋放行為；測試聚多巴胺微膠囊胰島素給藥載體的細胞相容性，聚多巴胺微膠囊胰島素給藥載體用于制備治療下述疾病的產品：人類糖尿病、牛糖尿病、豬糖尿病、羊糖尿病、馬糖尿病、狗糖尿病和貓糖尿病。

本發明的有益效果為：

1)本發明聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體首次通過溫和、快速和可控的反應制備具有良好的生物相容性、能夠克服腸道屏障的仿生聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體。

2)本發明聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體可以通過改變反應過程中胰島素的濃度，鹽析時氯化鈉的濃度，多巴胺的濃度，緩沖溶液的類型、pH值，以及反應時間、溫度、震蕩速度等反應條件，實現對聚多巴胺微膠囊壁厚和尺寸的調控，從而調控負載藥物胰島素的釋放速率。

3)本發明聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體生物相容性好，能夠克服腸道屏障，在腸道粘液內的停留時間長，從而提高胰島素的吸收率，提高給藥系統的給藥效率。

附圖說明

圖1為實施例1制備的(a)未包覆、(b)包覆了聚多巴胺微膠囊殼層的胰島素顆粒的掃描電鏡照片。

圖2為實施例1制備的殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體的胰島素釋放曲線：(a)pH 7.4的PBS緩沖溶液，(b)pH 5.4的PBS緩沖溶液。

圖3為實施例1制備的殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體的細胞毒性測試，(a)為對照樣，(b)、(c)分別為加入20,40μL的殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體后人臍靜脈內皮細胞的存活率。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明進行詳細描述。除非在本發明說明書中另有定義，否則在此所有的技術術語都是根據本領域一般技術人員所通常使用和理解的慣用定義來使用。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1，一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，包括以下步驟：

1)使用pH為2的鹽酸溶液溶解胰島素粉末，使其濃度為10mg/mL，向其中加入氯化鈉晶體，直到氯化鈉的量達到0.6mol/L，15℃水浴中震蕩下反應1h，觀察到白色的胰島素顆粒逐漸析出，離心分離產品，并采用2mol/L氯化鈉溶液清洗產品2次，離心分離，得到胰島素微納米顆粒；

2)首先，配制pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液；其次，將胰島素微納米顆粒分散于Tris-HCl緩沖溶液，使得胰島素的濃度為10mg/mL，加入多巴胺粉末，使其濃度為2mg/mL，將以上反應體系置于室溫下以900rpm的轉速震蕩反應24h，反應過程中，溶液的顏色由粉紅色，逐漸轉變為棕色、深棕色；最后，離心收集顆粒，采用Tris-HCl緩沖溶液清洗顆粒，得到聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構，保存在4℃環境中；其微觀結構如圖1所示，圖1a顯示新制的胰島素顆粒略顯粗糙，而在包覆了聚多巴胺殼層之后，胰島素變得很光滑，如圖1b所示；

3)首先，將聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構，分散到0.025％戊二醛的PBS溶液中(pH 7.4)，使得聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構的濃度為10mg/mL，吸附24小時；洗滌三次后，加入5mg/mL殼聚糖的PBS溶液，吸附12小時，洗滌三次；離心分離，得到殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體，保存在4℃環境中。

本實施例殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體的有益效果：

(1)粘蛋白吸附實驗：

配制0.5mg/mL、pH 5.5的粘蛋白溶液。將上述制備的殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體分散在粘蛋白溶液中，37℃環境中相互作用5h。離心分離，測量上清液中粘蛋白的含量，從而計算出給藥載體吸附粘蛋白的質量，評價給藥載體與粘液作用的強弱。

(2)胰島素釋放行為測試：

分別采用pH 7.4及pH 5.4的兩種PBS緩沖溶液研究口服胰島素給藥載體的胰島素釋放行為。將口服胰島素給藥載體分別分散于兩種緩沖溶液中(2mL)，在200rpm的條件下震蕩釋放胰島素。總共測試時間為24h。在特定的時間點離心取出0.5mL的上清液，并替換為新制緩沖溶液。通過考馬斯亮蘭溶液測試上清液中的胰島素濃度，從而得出胰島素在兩種緩沖溶液中的釋放曲線。口服胰島素給藥載體的胰島素釋放性能如圖2所示。圖2說明，口服胰島素給藥載體的胰島素釋放呈現pH響應性，在pH 5.4的緩沖溶液中，胰島素的釋放很少。而在pH 7.4的緩沖溶液中，胰島素實現完全的釋放。這種響應性的釋放行為，有利于該載體通過口服的方式進行給藥。

(3)口服胰島素給藥載體的細胞相容性：

以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為例進行細胞毒性測試。HUVEC細胞接種密度大約為2×10⁴cells/mL。細胞在聚苯乙烯培養皿中培養。培養基中含10％(v/v％)的胎牛血清，1％的鏈霉素和青霉素，培養基每兩天更換一次。培養箱溫度設定為37℃，含有5％(v/v％)CO₂的潮濕空氣。當細胞達到90％的生長期時，用標準的消化技術將他們分在24孔板中進行培養。根據細胞的培養情況，約兩天后，吸取培養液，換新液，其中一列中不加入任何樣品，作為參比樣，另外幾列中分別加入不同體積(20,40μL)口服胰島素給藥載體溶液，繼續培養12小時。為了測定細胞的活性，在每孔中各加入100μL MTT溶液(濃度為5mg/mL)，用鋁箔包裹培養板在培養箱中溫育4h。去除孔中的培養基和MTT，然后在各孔中分別加入200μL DMSO，震蕩10min，充分溶解沉淀在培養板底部的MTT-甲臜晶體。立即使用紫外-可見光譜儀檢測其在570nm處的吸光值，以防止產物變質。結果如圖3所示。由圖3可知，微膠囊的加入沒有對細胞的生長造成影響，說明微膠囊無細胞毒性，是生物相容的。

實施例2，一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，包括以下步驟：

1)使用pH為1的鹽酸溶液溶解胰島素粉末，使其濃度為50mg/mL；向其中加入氯化鈉晶體，直到氯化鈉的量達到0.5mol/L；5℃水浴中震蕩下反應3h，觀察到白色的胰島素顆粒逐漸析出；離心分離，采用2mol/L氯化鈉溶液進行清洗2次，離心分離，得到胰島素微納米顆粒；

2)配制pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液，將胰島素微納米顆粒分散于Tris-HCl緩沖溶液，使得胰島素的濃度為80mg/mL，加入多巴胺粉末，使其濃度為2mg/mL；將以上反應體系置于室溫下以900rpm的轉速震蕩反應24h，反應過程中，溶液的顏色由粉紅色，逐漸轉變為棕色、深棕色；離心收集顆粒，采用Tris-HCl緩沖溶液清洗顆粒，得到聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構，保存在4℃環境中；

3)將聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構分散到0.025％戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液中(PBS pH 7.4)，使得聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構的濃度為80mg/mL，吸附24小時；洗滌三次后，加入10mg/mL殼聚糖的PBS溶液，吸附12小時，洗滌三次；離心分離，得到殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體，保存在4℃環境中。

實施例3，一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，包括以下步驟：

1)使用pH為1.5的鹽酸溶液溶解胰島素粉末，使其濃度為20mg/mL；向其中加入氯化鈉晶體，直到氯化鈉的量達到2mol/L；15℃水浴中震蕩下反應1h，觀察到白色的胰島素顆粒逐漸析出；離心分離，采用2mol/L氯化鈉溶液進行清洗2次，離心分離，得到胰島素微納米顆粒；

2)配制pH 8.5的Tris-HCl緩沖溶液，將上胰島素微納米顆粒分散于Tris-HCl緩沖溶液，使得胰島素的濃度為40mg/mL，加入多巴胺粉末，使其濃度為2mg/mL；將以上反應體系置于室溫下以900rpm的轉速震蕩反應24h；反應過程中，溶液的顏色由粉紅色，逐漸轉變為棕色、深棕色。離心收集顆粒，采用Tris-HCl緩沖溶液清洗顆粒，得到聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構，保存在4℃環境中；

3)將聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構分散到0.025％戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液中(PBS pH 7.4)，使得聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構的濃度為40mg/mL，吸附24小時；洗滌三次后，加入10mg/mL殼聚糖的PBS溶液，吸附12小時，洗滌三次；離心分離，得到殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體，保存在4℃環境中。

實施例4，一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，包括以下步驟：

1)使用pH為2的鹽酸溶液溶解胰島素粉末，使其濃度為0.5mg/mL；向其中加入氯化鈉晶體，直到氯化鈉的量達到5mol/L；10℃水浴中震蕩下反應1h，觀察到白色的胰島素顆粒逐漸析出；離心分離，采用2mol/L氯化鈉溶液進行清洗2次，離心分離，得到胰島素微納米顆粒；

2)配制pH 10的Tris-HCl緩沖溶液，將上胰島素微納米顆粒分散于Tris-HCl緩沖溶液，使得胰島素的濃度為30mg/mL，加入多巴胺粉末，使其濃度為2mg/mL；將以上反應體系置于室溫下以900rpm的轉速震蕩反應12h，反應過程中，溶液的顏色由粉紅色，逐漸轉變為棕色、深棕色。離心收集顆粒，采用Tris-HCl緩沖溶液清洗顆粒，得到聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構，保存在4℃環境中；

3)首先，將聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構分散到0.025％戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液中(PBS pH 7.4)，使得聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構的濃度為30mg/mL，吸附24小時；洗滌三次后，加入8mg/mL殼聚糖的PBS溶液，吸附12小時，洗滌三次；離心分離，得到殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體，保存在4℃環境中。

實施例5，一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，包括以下步驟：

1)使用pH為1.5的鹽酸溶液溶解胰島素粉末，使其濃度為20mg/mL；向其中加入氯化鈉晶體，直到氯化鈉的量達到2mol/L；15℃水浴中震蕩下反應1h，觀察到白色的胰島素顆粒逐漸析出，離心分離，采用2mol/L氯化鈉溶液進行清洗2次，離心分離，得到胰島素微納米顆粒；

2)配制pH 8.5的NaOH及H₂O₂混合溶液，將胰島素微納米顆粒分散于NaOH及H₂O₂混合溶液，使得胰島素的濃度為50mg/mL，加入多巴胺粉末，使其濃度為0.5mg/mL；將以上反應體系置于室溫下以900rpm的轉速震蕩反應24h。反應過程中，溶液的顏色由粉紅色，逐漸轉變為棕色、深棕色，離心收集顆粒，采用PBS緩沖溶液清洗顆粒，得到聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構，保存在4℃環境中；

3)將聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構分散到0.025％戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液中(PBS pH 7.4)，使得聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構的濃度為50mg/mL，吸附24小時；洗滌三次后，加入8mg/mL殼聚糖的PBS溶液，吸附12小時，洗滌三次；離心分離，得到殼聚糖修飾的口服胰島素給藥載體，保存在4℃環境中。

實施例6，一種聚多巴胺微膠囊口服胰島素給藥載體的制備方法，包括以下步驟：

1)使用pH為1.5的鹽酸溶液溶解胰島素粉末，使其濃度為20mg/mL；向其中加入氯化鈉晶體，直到氯化鈉的量達到2mol/L；15℃水浴中震蕩下反應1h，觀察到白色的胰島素顆粒逐漸析出；離心分離，采用2mol/L氯化鈉溶液進行清洗2次，離心分離，得到胰島素微納米顆粒；

2)配制pH 10.5的Tris-HCl緩沖溶液，將胰島素微納米顆粒分散于Tris-HCl緩沖溶液，使得胰島素的濃度為50mg/mL，加入多巴胺粉末，使其濃度為5mg/mL；將以上反應體系置于室溫下以900rpm的轉速震蕩反應24h，反應過程中，溶液的顏色由粉紅色，逐漸轉變為棕色、深棕色，離心收集顆粒，采用Tris-HCl緩沖溶液清洗顆粒，得到聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構，保存在4℃環境中；

3)將聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構分散到0.025％戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液中(PBS pH 7.4)，使得聚多巴胺包覆的胰島素核殼結構的濃度為50mg/mL，吸附24小時；洗滌三次后，加入10mg/mL凝集素的PBS溶液，吸附12小時，洗滌三次；離心分離，得到凝集素修飾的口服胰島素給藥載體，保存在4℃環境中。

按照實施例1中的方法，采用粘蛋白吸附實驗、胰島素釋放行為測試、MTT細胞活性實驗，分別對實施例2-6制備的口服胰島素給藥載體的應用性能進行評估。結果表明，實施例2-6制備的口服胰島素給藥載體呈現出與粘蛋白有較強的相互作用，并且載體的細胞相容性很好，具有可調控的、pH響應性的胰島素釋放行為，有望應用于人類和動物的糖尿病的治療。