本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

衰老是一種自然規(guī)律，皮膚作為生物衰老過程中變化最為顯著的器官之一，主要表現(xiàn)有皮膚松弛、褶皺、色斑出現(xiàn)等。關(guān)于衰老解釋有不同的學(xué)說，其中最具有影響力的是自由基學(xué)說，它認(rèn)為衰老的誘因是衰老相關(guān)的環(huán)境、疾病和自身因素所產(chǎn)生的自由基。環(huán)境污染、長時間紫外線照射和吸煙會加速皮膚的衰老進(jìn)程，導(dǎo)致皮膚組織缺水、角質(zhì)層變硬、表皮和真皮層變薄、皮膚膠原纖維減少、黑色素沉積，從而產(chǎn)生皺紋、皮膚變得松弛、無光澤、色斑等問題。

D-半乳糖皮下注射可降低抗自由基的相關(guān)酶活性，加快皮膚衰老，屬于衰老造模的內(nèi)源性因素；紫外線的照射可影響真皮層成纖維細(xì)胞的生長、代謝等功能，屬于衰老造模的外源性因素。

我國現(xiàn)有茶園約150萬公頃，除嫩葉做茶外，修剪的過百萬噸枝葉、花、籽都作為廢棄物扔掉。茶樹葉富含茶多酚，茶多酚的抗氧化性可調(diào)節(jié)人體自由基代謝平衡，延緩衰老，預(yù)防和治療心血管疾病、腫瘤等。茶樹花香氣清甜，含豐富的蛋白質(zhì)、多糖、茶多酚、氨基酸、維生素、微量元素、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶、黃酮等，對人體具有解毒、降脂、降糖、抗癌、滋補(bǔ)、養(yǎng)顏等功效。茶種仁油理化特性與橄欖油相似，所含角鯊烯是血液輸氧劑和生物抗氧化劑，提高免疫力，延緩衰老，消炎殺菌；以上各成分綜合作用，有潤澤皮膚和修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的作用，可抵抗紫外線傷害，修復(fù)細(xì)胞，加快傷口愈合或防治皮膚皸裂，治療皮膚病等。如能綜合利用茶樹修剪下的廢棄的葉、花、籽研發(fā)功能食品、保健藥品和日化產(chǎn)品，可充分利用茶樹資源，帶動茶樹品種更新改良，增加茶園產(chǎn)值和茶農(nóng)收入，促進(jìn)宜林荒山綠化。

國內(nèi)外報道對茶葉的研究較多，但多用于內(nèi)服給藥和日常飲用；對茶樹種仁的研究僅局限于其含有的茶皂素、茶籽多糖、油脂和糠醛等的提取，未充分利用抗氧化功效的角鯊烯、茶多酚等，更未見以茶樹樹葉、茶樹花、種仁油為原料制備乳液并進(jìn)行相關(guān)抗衰老實驗的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提出利用廢棄的茶樹葉、茶樹花及茶樹種仁為原料制備抗衰老乳液的方法。

本發(fā)明抗衰老乳液的制備方法包括以下步驟：

1）將茶樹葉清洗后粉碎，然后用80℃水浸提1h，離心收集上清液，將茶樹葉渣用80℃水再浸提1h，離心收集上清液；合并兩次上清液過濾，濾液為茶樹葉提取液；將茶樹種仁粉碎后與60℃水混合后經(jīng)1h研磨，再經(jīng)離心取得上層油脂，即茶樹種仁油；將茶樹花經(jīng)氣流粉碎機(jī)超微粉碎，得茶樹花超微粉；

2）在均質(zhì)條件下，先將茶樹種仁油滴入茶樹葉提取液中，再加入茶樹花超微粉，繼續(xù)均質(zhì)，得抗衰老乳液。

本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)試驗證實具有抗皮膚衰老作用，因而可用于祛斑、去皺和美白潤膚。

茶樹葉中含有茶皂素，具有乳化、發(fā)泡等表面活性，實驗確定提取適宜溫度為80℃，溫度過高時乳化發(fā)泡嚴(yán)重，不利于提取，也不利于茶多酚類成分的穩(wěn)定。

茶種仁因淀粉含量較高，用機(jī)械壓榨法榨油時淀粉受熱膨脹，阻塞油路，使出油率降低；用有機(jī)溶劑浸提茶種油，提取率雖很高，但存在后續(xù)的減壓蒸餾回收溶劑和脫臭等精制工序以及產(chǎn)品中溶劑殘留等安全和環(huán)保問題等；超臨界CO₂萃取具有萃取溫度低、省時、無毒無害，可避免產(chǎn)物氧化、無化學(xué)試劑殘留和污染、不需要精煉等優(yōu)點，但經(jīng)濟(jì)成本高未工業(yè)化普及。本發(fā)明將茶種仁粉碎，加60℃水使細(xì)胞吸水熱漲，再經(jīng)膠體磨進(jìn)一步破壞細(xì)胞壁，再離心分離上層油脂和下層淀粉。實驗確定提油適宜溫度為60℃，因茶種仁中皂素含量也較高，溫度過高時乳化發(fā)泡嚴(yán)重，對油層分離不利，溫度過高淀粉糊化粘度增加也影響油份析出。

茶樹花因皂素含量很高不適宜用水性溶劑提取，也沒必要用高成本的有機(jī)溶劑提取或超臨界CO₂萃取。本發(fā)明將茶樹花超微粉碎后，細(xì)胞破壁，所含茶皂素遇水即溶，起乳化劑作用使茶樹種仁油穩(wěn)定的分散在茶樹葉提取液中；同時茶花超微粉使乳液有一定的粘稠性，有利于乳液的穩(wěn)定；乳液散發(fā)著茶花的自然怡人的清香。

進(jìn)一步地，本發(fā)明每次浸提茶樹葉的水與茶樹葉的混合質(zhì)量比為5∶1。水是提取茶樹葉中茶多酚等功效成分的溶劑，采用該比例進(jìn)行兩次提取符合功效成分提取率要求，也符合作為分散茶樹種仁油所需水相（茶樹葉提取液）量要求，經(jīng)濟(jì)、合理。

所述茶樹種仁和水的混合質(zhì)量比為1∶10，這樣的比例使研磨后的混合液稠度適當(dāng)，利于離心分出油層。

所述步驟2）中均質(zhì)時均質(zhì)機(jī)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速＞3000 r/min，加入茶樹花超微粉后繼續(xù)均質(zhì)的時間為5～10min。因本發(fā)明未添加任何表面活性劑做乳化劑，經(jīng)實驗表明：制備本發(fā)明抗衰老乳液需要在＞3000r/min均質(zhì)條件下才能產(chǎn)生較大的剪切力，使油水兩相能均勻乳化，均質(zhì)時間5～10min可以形成穩(wěn)定乳液。

另外，本發(fā)明所述茶樹葉、茶樹種仁與茶樹花的用料質(zhì)量比為10∶10∶1。茶樹葉是提取茶多酚等功效成分的原料，前期實驗測定了茶樹葉中抗衰老功效成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素（EC）的含量，以此為依據(jù)確定茶樹葉用量；前期實驗也測定了加水研磨法提取茶樹種仁油的提取率以及油中角鯊烯的含量，以此為依據(jù)確定茶樹種仁用量；實驗中發(fā)現(xiàn)茶樹花含有大量皂素，用作乳化劑兼有增稠作用而確定其用量。

附圖說明

圖1為EGCG標(biāo)準(zhǔn)對照品高效液相色譜圖。

圖2為EC標(biāo)準(zhǔn)對照品高效液相色譜圖。

圖3為角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)對照品高效液相色譜圖。

圖4為檢測波長為278nm的抗衰老乳液高效液相色譜圖。

圖5為檢測波長為210nm的抗衰老乳液高效液相色譜圖。

圖6為顯微鏡下觀察正常組小鼠皮膚表皮層形態(tài)照片。

圖7為顯微鏡下觀察模型組小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

圖8為顯微鏡下觀察陽性對照組小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

圖9為顯微鏡下觀察抗衰老乳液低劑量組小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

圖10為顯微鏡下觀察抗衰老乳液高劑量組小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

圖11為顯微鏡下觀察正常組小鼠皮膚中膠原纖維的照片。

圖12為顯微鏡下觀察模型組小鼠皮膚中膠原纖維的照片。

圖13為顯微鏡下觀察陽性對照組小鼠皮膚中膠原纖維的照片。

圖14為顯微鏡下觀察抗衰老乳液低劑量組小鼠皮膚中膠原纖維的照片。

圖15為顯微鏡下觀察抗衰老乳液高劑量組小鼠皮膚中膠原纖維的照片。

具體實施方式

一、抗衰老乳液的制備工藝：

1、取10kg茶樹葉，清洗后攪碎，加入50kg溫度為80℃的水中1h不時攪拌，然后離心收集上清液。再將離心后的茶樹葉渣用80℃水50 kg再浸提1h，再次離心收集上清液。合并兩次上清液，經(jīng)過濾，得茶樹葉提取液。

2、取10kg茶樹種仁，粉碎后加100kg溫度為60℃的水1 h膠體磨研磨，離心分離上層油脂得茶樹種仁油。

3、將1kg茶樹花經(jīng)氣流粉碎機(jī)超微粉碎得茶樹花超微粉。

4、在3200 r·min^-1均質(zhì)條件下將茶樹種仁油滴入茶樹葉提取液中，再逐漸加入茶樹花超微粉，繼續(xù)均質(zhì)5～10min得抗衰老乳液。

二、高效液相色譜法對抗衰老乳液中功效成分的含量測定：

準(zhǔn)確稱取抗衰老乳液20mg，分別用甲醇定容至10ml，超聲30min后，以0.45μm微孔濾膜過濾，濾液作為用于檢測EGCG和EC的供試液1。

另外準(zhǔn)確稱取抗衰老乳液500mg，加正己烷超聲溶解，過濾，揮干正己烷，用甲醇定容于10mL容量瓶，超聲30min后，以0.45μm微孔濾膜過濾，濾液作為用于檢測角鯊烯的供試液2。

色譜柱為C₁₈（4.6×250mm，5μm），流速為1.0ml/min，柱溫25℃，檢測EGCG和EC是以水∶甲醇∶冰醋酸=84∶15∶1的體積比混合液作為流動相，檢測波長為278nm；檢測角鯊烯是以甲醇∶乙腈=6∶4的體積比混合液作為流動相，檢測波長為210nm。

精密吸取各供試液20μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定3次，并按標(biāo)準(zhǔn)對照法計算樣品中各功效成分的含量。

EGCG的線性回歸方程為：Y=529808X-320.31，R²=0.9996，在0.05mg～0.4mg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；EC的線性回歸方程為：Y=2220370X+3.7073，R²=0.9999，在0.025mg～0.2mg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；角鯊烯的線性回歸方程為：Y=143760X+907.4，R²=0.9992，在0.1mg～0.6mg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表1和附圖1～5（各圖中縱坐標(biāo)表示信號強(qiáng)度，AU為電壓放大倍數(shù)）。

表1 HPLC測定抗衰老乳液中各功效成分含量結(jié)果

即測定抗衰老乳液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素及角鯊烯含量分別為18.26%、1.53%及1.02%。

由圖1可見保留時間24.848分鐘處表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的色譜峰。

由圖2可見保留時間32.724分鐘處表兒茶素（EC）的色譜峰。

由圖3可見保留時間31.594分鐘處角鯊烯的色譜峰。

由圖4可見保留時間24.942分鐘處色譜峰，歸屬于抗衰老乳液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的分離峰；保留時間32.742分鐘處色譜峰歸屬于抗衰老乳液中表兒茶素（EC）的分離峰。

由圖5可見保留時間32分鐘處色譜峰，歸屬于抗衰老乳液中角鯊烯的分離峰。

三、抗衰老乳液的功效實驗：

（一）在體動物實驗方法：

1、動物分組與處理：

分組：取30只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分別為：正常組、模型組、維生素E陽性對照組（200 mg/kg·d）、抗衰老乳液低劑量組（200 mg/kg·d）、抗衰老乳液高劑量組（400 mg/kg·d）。

造模：小鼠背部脫毛約5cm×5 cm，模型組、陽性對照組、抗衰老乳液低劑量組和抗衰老乳液高劑量組小鼠每日頸背部皮下注射1 %D-半乳糖1 ml/100 g，并進(jìn)行30瓦紫外燈照射，照射時間為30 min/d，持續(xù)40 d；正常組小鼠每日注射等體積的生理鹽水，正常光照，持續(xù)時間同造模組。

給藥：從造模第11天開始，陽性對照組、抗衰老乳液低劑量組和抗衰老乳液高劑量組小鼠每天按照設(shè)定劑量背部涂抹維生素E和抗衰老乳液，正常組和模型組小鼠每天背部涂抹生理鹽水，連續(xù)涂抹30天后考察小鼠背部皮膚變化。

2、皮膚觀察：

2.1 皮膚肉眼觀察：

肉眼觀察小鼠背部皮膚表面，通過觀察皮膚的光澤度、光滑度、有無斑點、有無彈性等初步判斷小鼠皮膚的衰老情況。

2.2 皮膚組織的形態(tài)學(xué)觀察：

2.2.1 皮膚切片染色：

剪取背部皮膚組織約2 cm×2 cm，脫毛處理后除去皮下的脂肪組織，在Bouin氏固定液中固定超過24 h，酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，分別HE染色和Masson三色染色，對比各組皮膚的顯微結(jié)構(gòu)。

2.2.2 圖像采集與定量：

對每組HE染色的切片，分別在200倍鏡下拍攝采集，每組挑選4個視野，觀察皮膚的顯微結(jié)構(gòu)，測量表皮和真皮層厚度；對每組Masson三色染色的切片，在400倍鏡下拍攝，同樣每組挑選4個視野，觀察膠原纖維的形態(tài)變化，測定膠原纖維的粗細(xì)、長度及面積比例。所采集的圖像均用image-pro Plus 6.0對各指標(biāo)進(jìn)行測量。

3、皮膚生化指標(biāo)的測定：

取小鼠皮膚組織制備成組織勻漿，按照測定試劑盒說明書，采用羥胺法測SOD值、TBA法測MDA值。取小鼠皮膚采用堿水解法測定Hyp值，根據(jù)試劑盒說明書提供的公式計算所需數(shù)據(jù)。

4、皮膚含水量的測定：

取脫毛后背部皮膚2cm×2cm，精密稱取濕重，放置烘箱24 h后精密稱取干重。

。

5、統(tǒng)計學(xué)方法：

所有測定指標(biāo)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理分析和比較，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時，有顯著性差異；P<0.01時，有極顯著性差異，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

（二）在體動物實驗結(jié)果：

1、皮膚考察：

正常組皮膚光滑，有色澤，有彈性；模型組皮膚粗糙且有褶皺，表皮變薄，缺乏彈性；對比于模型組，陽性對照組、抗衰老乳液高低劑量組表皮褶皺明顯變少，皮膚光滑有光澤；同時高劑量組有較好的皮膚彈性，皮膚無明顯褶皺，恢復(fù)光澤等明顯優(yōu)于低劑量組。

2、皮膚組織的形態(tài)學(xué)觀察：

2.1 HE染色結(jié)果：

HE染色顯微鏡下觀察結(jié)果見附圖6～10（放大倍數(shù)200，標(biāo)尺為100μm）。

圖6可見顯微鏡下觀察到的正常組小鼠皮膚表皮層形態(tài)：小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮和真皮層厚度正常，毛囊和皮脂腺飽滿，表皮和真皮分界較清楚，染色較均勻。

圖7可見顯微鏡下觀察到的模型組小鼠皮膚表皮層病理變化情況：表皮和真皮都變薄，汗腺和毛囊數(shù)量與圖6相比顯著減少。

圖8可見顯微鏡下觀察到的陽性對照組小鼠皮膚表皮層病理變化情況：小鼠表皮較規(guī)則，真皮層厚度增加，毛囊和汗腺與圖7相比顯著增多。

圖9可見顯微鏡下觀察到的抗衰老乳液低劑量組小鼠皮膚表皮層病理變化情況：小鼠表皮較規(guī)則，真皮層厚度增加，但毛囊和汗腺與圖8、圖10比較不夠飽滿。

圖10可見顯微鏡下觀察到的抗衰老乳液高劑量組小鼠皮膚表皮層病理變化情況：與圖7相比，觀察到小鼠表皮規(guī)則，真皮層厚度顯著增加且分界較清晰，染色均勻，毛囊和皮脂腺明顯增加。

2.2 抗衰老乳液對衰老小鼠皮膚厚度的影響：

表皮和真皮的測量結(jié)果表明，對比于正常組，模型組的表皮和真皮均明顯變薄，抗衰老乳液給藥后，各給藥組的表皮和真皮均有顯著增加（P<0.05，P<0.01），見表2。

表2 抗衰老乳液對衰老小鼠皮膚厚度的影響（, n=6）

注：^△與正常組比較，^△△P<0.01；^▲與模型組比較，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

2.3 Masson三色染色結(jié)果：

Masson三色染色膠原纖維染色為藍(lán)色，見附圖11～15（放大倍數(shù)400，標(biāo)尺為20 μm）。

由圖11可見，正常組的小鼠皮膚中膠原纖維粗細(xì)適中，緊密有序。

由圖12可見，模型組的小鼠皮膚中膠原纖維排列松散雜亂無序，膠原纖維變短變細(xì)且數(shù)量少間隙大。

由圖13可見，陽性對照組相對于模型組，小鼠皮膚中膠原纖維的量明顯增加，且形態(tài)恢復(fù)正常。

由圖14、圖15可見，抗衰老乳液給藥組相對于模型組，小鼠皮膚中膠原纖維的量明顯增加，且形態(tài)恢復(fù)正常，并且抗衰老乳液高劑量組效果更優(yōu)于低劑量組。

2.4 抗衰老乳液對衰老小鼠膠原纖維組織學(xué)參數(shù)的影響：

小鼠皮膚中膠原纖維的粗細(xì)、長度和密度的測定結(jié)果表明，與正常組相比，模型組的膠原纖維明顯變細(xì)，長度變短，密度變小。給藥后，相對于模型組，陽性對照組和抗衰老乳液低劑量組小鼠皮膚膠原纖維比例增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），給藥組的其他參數(shù)均有顯著增加（P<0.01），見表3。

表3抗衰老乳液對衰老小鼠膠原纖維組織學(xué)參數(shù)的影響（, n=6）

注：^△與正常組比較，^△△P<0.01；^▲與模型組比較，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

3、皮膚中生化指標(biāo)的測定：

試驗結(jié)果表明，與空白組相比較，模型組皮膚中的SOD、Hyp含量明顯降低，MDA含量則明顯增加。與模型組相比，抗衰老乳液高低劑量組皮膚的SOD、Hyp含量顯著增加，MDA含量顯著下降（P<0.05，P<0.01），見表4。

表4 抗衰老乳液對衰老小鼠皮膚SOD、MDA、Hyp含量的影響（, n=6）

注：^△與正常組比較，^△△P<0.01；^▲與模型組比較，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

4、抗衰老乳液對衰老小鼠皮膚含水率的影響：

皮膚含水率試驗表明，相比于正常組，模型組的小鼠皮膚含水率減少；抗衰老乳液高低劑量給藥后，小鼠皮膚的含水率均較模型組顯著增加（P<0.05，P<0.01），見表4。

表4 抗衰老乳液對衰老小鼠皮膚含水率的影響（,n=6）

注：^△與正常組比較，^△△P<0.01；^▲與模型組比較，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

綜上，本發(fā)明采用D-半乳糖聯(lián)合紫外照射，綜合模擬內(nèi)源性和外源性衰老因素，更加符合真實衰老過程，成功建立小鼠衰老模型進(jìn)行抗衰老乳液抗衰老實驗。

實驗結(jié)果顯示：對比于正常組的小鼠皮膚，模型組小鼠的皮膚褶皺、暗沉且有色素沉著，表皮和真皮層變薄，膠原纖維排序紊亂且斷裂，皮膚中超氧化物歧化酶（SOD）、羥脯氨酸（Hyp）含量減少，丙二醛（MDA）含量增加，皮膚含水率減少。經(jīng)過抗衰老乳液經(jīng)皮給藥后，皮膚的皺紋變淺，且有光澤，皮膚光滑，相比于模型組，抗衰老乳液給藥組皮膚全層結(jié)構(gòu)完整，小鼠的表皮和真皮層變厚，膠原纖維排列致密且有序，膠原纖維比例也明顯增加，皮膚中SOD、Hyp含量和含水率均顯著增加，MDA含量顯著減少。說明本發(fā)明產(chǎn)品—抗衰老乳液具有抗皮膚衰老作用。