本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及一種膠原蛋白海綿及其制備方法，特別涉及一種以魚皮為原料提取的膠原蛋白，制備孔隙率高、力學(xué)性能可調(diào)的適于軟組織修復(fù)的生物醫(yī)用材料，所述海綿適用于燒燙傷缺損、潰瘍、創(chuàng)傷創(chuàng)面等的修復(fù)治療。

背景技術(shù)：

膠原蛋白是人體組織的基本成分之一，人體蛋白質(zhì)總量的 1/3 左右是膠原蛋白。膠原蛋白本身廣泛分布于身體取的各個(gè)器官之中，如皮膚、骨骼、角膜等。當(dāng)膠原蛋白被損害后，很多器官（如皮膚、骨骼等）的功能也隨之受到影響。在生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)，膠原蛋白是最關(guān)鍵、需求量最龐大的生物醫(yī)學(xué)材料之一。膠原蛋白的種類很多，目前已發(fā)現(xiàn)有 26 種，按不同類型可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型等，其中I型膠原蛋白材料因綜合性能優(yōu)良而被廣泛利用。特別是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，膠原蛋白可制成膠原海綿、膠原膜或人工皮膚等。美國在上世紀(jì) 90 年代就批準(zhǔn)將Apligraf 用于靜脈潰瘍的治療，國內(nèi)對于膠原蛋白用作止血材料的研究也取得了一定的進(jìn)展。由于膠原蛋白本質(zhì)上就是一種天然組織支架材料，因此膠原蛋白成為構(gòu)建組織工程支架的理想材料，如皮膚、骨組織、血管等器官的支架，之后體內(nèi)組織細(xì)胞爬入支架內(nèi)與其生長融合，引導(dǎo)組織再生。純膠原蛋白組織工程支架具有良好的生物相容性、可塑性、易加工并能有效促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖等優(yōu)點(diǎn)。

但對脊椎動(dòng)物與人類共患傳染病的憂慮難以消除，如牛海綿狀腦病、豬流感、禽流感等。從2009年農(nóng)業(yè)部同衛(wèi)生部頒布的《人畜共患傳染病名錄》中，可以發(fā)現(xiàn)從魚類來源的共患傳染病甚少。我國是世界上最大的淡水魚養(yǎng)殖國，據(jù)統(tǒng)計(jì)2013年我國養(yǎng)殖淡水魚產(chǎn)量2000多萬，隨著我國魚類加工業(yè)的快速發(fā)展，魚加工副產(chǎn)物（魚皮和魚鱗）利用程度很低，但是其中（特別是魚皮中）I型膠原蛋白含量在80%以上，因此從魚皮總提取膠原蛋白不僅能夠充分利用資源，提高魚類加工的附加值，而且可以減少環(huán)境污染。所以說魚皮可為魚源膠原的開發(fā)供給充足的原料，具備開發(fā)安全、經(jīng)濟(jì)的膠原材料的潛力。

中國專利 CN103772734A 公開了一種哺乳動(dòng)物源性的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其含蓋了膠原蛋白的提取、提純、交聯(lián)和凍干成型的整個(gè)過程，其主要目的首先是獲得高純度的膠原蛋白，而后再利用其制備膠原蛋白海綿，但是由于是哺乳動(dòng)物源性，其成本過高，一定程度上限制了其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；發(fā)明專利CN103007336A公開了一種魚皮膠原基復(fù)合海綿及其制備方法，它是以魚皮膠原與殼聚糖為原料，冷凍干燥后經(jīng)交聯(lián)再進(jìn)行二次冷凍干燥制備，該專利使用殼聚糖與膠原蛋白混合制備海綿，其中殼聚糖生物相容性較膠原蛋白差， 所以只能作為體表用材料使用，不能作為體內(nèi)修復(fù)材料的應(yīng)用；發(fā)明專利CN103525097A公開了一種水產(chǎn)魚皮明膠海綿及其制備方法。本發(fā)明以水產(chǎn)魚皮明膠為主料，殼聚糖為輔料，戊二醛為交聯(lián)劑，將不同配比的原料液通過冷凍干燥制備出性質(zhì)不同的魚皮明膠海綿，且其制備過程簡單、廉價(jià)易得，克服了現(xiàn)有膠原海綿的一些不足。但其明膠失去了膠原特有的三螺旋結(jié)構(gòu)，所以其生物活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于膠原，限制了在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，同時(shí)該專利所用的交聯(lián)劑為濃度較高的戊二醛，其產(chǎn)生的細(xì)胞毒性不可控。

因此，需要克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，研發(fā)出一種物美價(jià)廉、生物相容性好、生物活性高和降解性能可控的膠原蛋白海綿。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿的制備方法，其制備的海綿不僅保留了膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，而且其生物活性高、降解可控。其特征在于包括以下步驟：

1.一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）取凍干的魚皮膠原蛋白原料，用冰醋酸完全溶解，溶液溶度為8~20mg/ml，然后調(diào)節(jié)其pH為4~6，20-30℃靜置處理24小時(shí)， 進(jìn)行微納結(jié)構(gòu)自組裝；

2）將上述自組裝之后的膠原蛋白溶液注入模具中，在-40℃~-80℃下真空冷凍干燥24~48h，得到魚膠原蛋白海綿；

3）將凍干后的魚膠原海綿用交聯(lián)劑進(jìn)行4~24小時(shí)的低溫交聯(lián)，然后純化水進(jìn)行清洗透析，再次進(jìn)行冷凍干燥，然后進(jìn)行包裝與輻照滅菌處理，即可得生物學(xué)性能優(yōu)良、降解性可控的魚皮膠原蛋白修復(fù)海綿。

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，所述的魚膠原蛋白原料的制備方法如下：取魚皮清洗干凈并脫水，加入正丁醇脫脂，于0-4℃攪拌 8-12 小時(shí)后加入0.05- 0.2M的NaOH溶液中攪拌數(shù)小時(shí)，再用去離子水充分清洗經(jīng)堿溶液處理后的魚皮直至中性；將清洗后的魚皮以料液比1:5-20（w/w）的比例放入 0.05-0.5M 的酸性溶液中，加入蛋白酶攪拌 24-60 小時(shí)，酶解處理得酶解膠原液，最后加入無水乙醇溶液，直至所述膠原液中的乙醇含量達(dá)到30-80%，靜置，過濾，得膠原蛋白，無水乙醇脫水，低溫真空干燥得膠原蛋白粉末，獲得分子量高達(dá)300kD的醫(yī)用級(jí)生物材料用天然高分子魚皮膠原。

3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，所述的魚皮包括草魚、羅非魚、三文魚、青魚、鯊魚在內(nèi)的魚皮產(chǎn)物。

4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，所述的冰醋酸體積分?jǐn)?shù)為0.3%~5%。

5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，所述的自組裝條件為20-30℃、弱酸性條件下靜置致使膠原內(nèi)部的納米膠原絲生長，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，所述的注模模具選擇為特氟龍模具。

7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑有碳化二亞胺、乙醇、環(huán)氧化合物、羥基琥珀酰亞胺、二苯基磷酸鹽 ( DPPA)、戊二醛、甲醛、乙醛酸或京尼平中的一種或幾種，交聯(lián)時(shí)間為4~24小時(shí)。

8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，制備的膠原蛋白修復(fù)海綿的孔徑為100~400微米，孔隙率為85%以上。

根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種魚膠原蛋白修復(fù)海綿及其制備方法，其特征在于，

魚皮膠原原料蛋白含量在95%以上，pH大于4.0 。

由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明設(shè)計(jì)了以魚皮基為原料制備膠原蛋白修復(fù)海綿具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1．本發(fā)明所用主要原料為魚皮提取物，原料來源廣泛、廉價(jià)易得，極大地克服了現(xiàn)有膠原產(chǎn)品價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，提高了經(jīng)濟(jì)效益；

2．本發(fā)明通過利用膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的自組裝機(jī)理，使其在微納結(jié)構(gòu)更貼近人體細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其在修復(fù)使用上更具有生物相容性；

3．本發(fā)明提供的膠原海綿，其孔隙率高，孔徑大小均勻且適中，符合更利于細(xì)胞與組織的生長；

4．該發(fā)明生產(chǎn)上可控性很好，可促進(jìn)傳統(tǒng)醫(yī)藥、醫(yī)療器材產(chǎn)業(yè)向以生物技術(shù)為標(biāo)志的高新技術(shù)迅速發(fā)展，符合我國建設(shè)資源節(jié)約型和環(huán)境友好型社會(huì)的要求，社會(huì)效益顯著。

附圖說明

圖1：為實(shí)施例1中制備的魚膠原蛋白修復(fù)海綿的微觀多孔結(jié)構(gòu)圖。

圖2：為實(shí)施例3中細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)的激光共聚焦譜圖。

圖3：為實(shí)施例4中肌肉植入實(shí)驗(yàn)1個(gè)月后組織HE染色觀察圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

膠原蛋白原料的制備：

取魚皮清洗干凈并脫水，加入400ml 10%的正丁醇脫脂，于0-4℃攪拌 8小時(shí)后加入0.05M的NaOH溶液中攪拌10小時(shí)，再用去離子水充分清洗經(jīng)堿溶液處理后的魚皮直至中性。

將清洗后的魚皮以料液比1:5（w/w）的比例放入0.5M 的酸性溶液中，加入蛋白酶攪拌 24小時(shí)，酶解處理得酶解膠原液，最后加入200ml無水乙醇溶液，最終所述膠原液中的乙醇含量達(dá)到70%，靜置，過濾，得膠原蛋白，再用無水乙醇脫水，低溫真空干燥得膠原蛋白粉末，獲得分子量高達(dá)300kD的醫(yī)用級(jí)生物材料用天然高分子魚皮膠原。

膠原蛋白修復(fù)海綿的制備：

取上述凍干的魚皮膠原蛋白原料，用冰醋酸完全溶解，溶液溶度為10mg/ml，測其pH為4.2，20℃靜置處理24小時(shí)， 進(jìn)行微納結(jié)構(gòu)自組裝。

將上述自組裝之后的膠原蛋白溶液注入模具中，在-40℃條件下真空冷凍干燥48h，得到魚膠原蛋白海綿。

將凍干后的魚膠原海綿浸入到50ml含50mmol/l（MES）的體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液中，先進(jìn)行30min預(yù)交聯(lián)，然后加入EDC65mg和NHS15mg進(jìn)行12小時(shí)的低溫交聯(lián)，然后純化水進(jìn)行清洗透析，再次進(jìn)行冷凍干燥，然后進(jìn)行包裝與輻照滅菌處理，即可得生物學(xué)性能優(yōu)良、降解性可控的魚皮膠原蛋白修復(fù)海綿。

圖1為所制備的魚膠原蛋白修復(fù)海綿的微觀多孔結(jié)構(gòu)圖。

實(shí)施例2

膠原蛋白原料的制備：

取魚皮清洗干凈并脫水，加入600ml 10%的正丁醇脫脂，于0-4℃攪拌 12小時(shí)后加入0.2M的NaOH溶液中攪拌8小時(shí)，再用去離子水充分清洗經(jīng)堿溶液處理后的魚皮直至中性。

將清洗后的魚皮以料液比1:10（w/w）的比例放入0.5M 的酸性溶液中，加入蛋白酶攪拌 24小時(shí)，酶解處理得酶解膠原液，最后加入100ml無水乙醇溶液，最終所述膠原液中的乙醇含量達(dá)到50%，靜置，過濾，得膠原蛋白，再用無水乙醇脫水，低溫真空干燥得膠原蛋白粉末，獲得分子量高達(dá)300kD的醫(yī)用級(jí)生物材料用天然高分子魚皮膠原。

膠原蛋白修復(fù)海綿的制備：

取上述凍干的魚皮膠原蛋白原料，用冰醋酸完全溶解，溶液溶度為12mg/ml，測其pH為4.2，25℃靜置處理12小時(shí)， 進(jìn)行微納結(jié)構(gòu)自組裝。

將上述自組裝之后的膠原蛋白溶液注入模具中，在-80℃條件下真空冷凍干燥48h，得到魚膠原蛋白海綿。

將凍干后的魚膠原海綿浸入到70%的含有0.003%的戊二醛溶液中低溫交聯(lián)12小時(shí)，然后純化水進(jìn)行清洗透析，再次進(jìn)行冷凍干燥，然后進(jìn)行包裝與輻照滅菌處理，即可得生物學(xué)性能優(yōu)良、降解性可控的魚皮膠原蛋白修復(fù)海綿。

實(shí)施例3

魚膠原蛋白原料制備方法同實(shí)施例2。

膠原蛋白海綿的制備：

取上述凍干的魚皮膠原蛋白原料，用冰醋酸完全溶解，溶液溶度為15mg/ml，測其pH為5，25℃靜置處理24小時(shí)， 進(jìn)行微納結(jié)構(gòu)自組裝。

將上述自組裝之后的膠原蛋白溶液注入模具中，在-80℃條件下真空冷凍干燥36h，得到魚膠原蛋白海綿。

將凍干后的魚膠原海綿浸入到1%的京尼平溶液中交聯(lián)48小時(shí)，然后用1%的甘氨酸清洗，最后純化水進(jìn)行清洗，再次進(jìn)行冷凍干燥，然后進(jìn)行包裝與輻照滅菌處理，即得魚皮膠原蛋白修復(fù)海綿。

將上述膠原蛋白海綿滅菌進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，操作方法：除吸收容量外，按照1.25mL/cm²的比例加入浸提介質(zhì)（浸提介質(zhì)：含血清細(xì)胞培養(yǎng)液）浸提，（37±1）℃，（24±2）h制備試驗(yàn)液，取試驗(yàn)液按照GB/T14233.2-2005中規(guī)定的MTT方法進(jìn)行評(píng)級(jí)。結(jié)果顯示細(xì)胞毒性為1級(jí)。

圖2為實(shí)施例3中細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)的激光共聚焦譜圖。

實(shí)施例4

用實(shí)施例1中的海綿進(jìn)行肌肉植入實(shí)驗(yàn)：

試驗(yàn)前，剪去兔脊椎兩側(cè)兔毛，試驗(yàn)時(shí)用戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉，按外科常規(guī)手術(shù)要求以碘酊和75%（V/V）乙醇消毒手術(shù)區(qū)域皮膚，在兔脊椎兩側(cè)約2.5cm處等距離各選4個(gè)植入點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2.5cm，將試驗(yàn)樣品植入到肌肉組織內(nèi)，每點(diǎn)植入樣品大小為10*10mm。

將試驗(yàn)樣品植入到家兔背部兩側(cè)的的肌肉組織內(nèi)，于植入1周、2周、3周、4周分別處死動(dòng)物，肉眼觀察植入部位并切取包括植入材料及周圍足夠多的未受影響的肌肉組織，進(jìn)行HE染色觀察。

在本試驗(yàn)條件下，肌肉植入一周后組織周圍有大量嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，植入兩周可見少量淋巴時(shí)報(bào)，有多核巨細(xì)胞且有疏松囊腔形成。肌肉植入4周后，可見樣品絕大部分被吸收，僅有少量參與，可見膠原纖維，囊腔形成較前致密。

圖3為實(shí)施例4中肌肉植入實(shí)驗(yàn)1個(gè)月后組織HE染色觀察圖。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以列舉。而因此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。