本發明涉及一種組織工程脫細胞血管支架的制備方法。

背景技術：

心血管疾病是人類健康的第一殺手，其中半數以上患者治療的首選是血管移植，但由于部分患者受自身血管來源的限制而難以實施。異體或異種血管曾經作為自體血管的替代物，用于修復病變或缺失的血管，但潛在的疾病傳播風險、急性免疫排斥反應及有限的供體來源又限制了其在移植中應用。組織工程技術的發展為人體血管缺損修復和重建提供了新的解決方案，目前已開發出了多種合成的可降解材料用于構建組織工程支架，并應用于臨床，取得了良好的效果。組織工程血管是一種用組織工程學方法構建的具有良好生物相容性和力學特性的血管替代物，其基本的構件是血管支架材料、種子細胞和信號因子，而血管支架的研究一直是目前血管組織工程研究領域的難點和重點。其中，天然生物支架材料利用自體或者異體血管進行脫細胞處理，獲得細胞外基質，由于這些胞外基質與細胞親和力強，能為細胞生長、繁殖、分化提供近似體內組織發育環境，且生物相容性、順應性均較好，免疫排斥也較低，因此有潛力應用到組織工程化血管中。

然而，這些異體或異種來源的脫細胞支架應用到小口徑(內徑小于6mm)血管移植時，在口徑小、張力大的血管環境中存在著力學性能不足而導致嚴重動脈瘤等問題。因此，要實現脫細胞血管支架在小口徑組織工程化血管中的廣泛應用，必須解決支架力學性能不足的問題。熔融紡絲和濕法紡絲等技術可以利用一些生物相容性較好的高分子材料制備出具有較好力學性能的支架，這種支架的纖維直徑和纖維取向可控，能夠在血流方向和血管徑向提供較好的力學支持，從而滿足體內血流刺激對力學性能的要求，因此在組織工程化血管研究中受到重視。

技術實現要素：

本發明的目的是針對上述存在問題，將脫細胞的組織工程化血管和用熔融紡絲等技術制備的力學支架相結合，發明一種可以有效增強力學性能的組織工程脫細胞血管支架的制備方法，本方法制備的脫細胞血管支架具有力學性能顯著增強、體內移植后免疫反應低、可以設計不同形態的血管支架以滿足實際臨床應用的特點。

本發明的技術方案：

一種組織工程脫細胞血管支架的制備方法，包括以下步驟：

1)以生物可降解高分子材料為原料，在醫用硅膠管上采用熔融紡絲或濕法紡絲技術制備微米級或納米級的有序網狀血管支架，所述有序網狀血管支架的纖維在硅膠管外螺旋式纏繞，纖維之間的角度為45°，網狀血管支架層的厚度為600μm，血管支架的直徑為2mm；

2)將上述帶硅膠管的纖維支架植入到兔子或大鼠實驗動物皮下部位2周到3個月，宿主啟動免疫反應機制并使成纖維細胞等向支架上遷移，最終形成一個由宿主細胞及胞外基質包裹的組織工程化血管支架；

3)將上述組織工程化血管支架取出，移除硅膠管后，對其外層的血管材料進行如下處理：用75wt％的酒精消毒20min，轉移至超凈臺操作，用1wt％的十二烷基磺酸鈉(SDS)在搖床上震蕩12h后，用雙蒸餾水(DDH₂O)將SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶搖床震蕩處理24h，用DDH₂O將酶完全洗去，得到組織工程脫細胞血管支架。

所述生物可降解高分子材料為聚己內酯(PCL)、聚L-丙交酯-co-己內酯(PLCL)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚羥基脂肪酸酯(PHA)和聚氨酯(PU)中的一種或兩種及以上任意比例的混合物。

一種所制備的組織工程脫細胞血管支架的應用，用于實驗動物的血管移植。

本發明的優點在于：

1、多層相互交聯的網狀高分子支架充分改善了原有脫細胞血管支架的力學性能，成功解決了血管移植后的動脈瘤等問題；2、本方法在宿主動物體內構建由免疫機制引起的遷移細胞形成的支架血管，再進行脫細胞處理，既保留了網狀支架以改善血管力學性能，又降低移植后的免疫反應，并且充分利用了細胞外基質提供細胞再生的良好環境；3、本方法還可以通過設計不同形狀和大小的支架來制備不同的脫細胞血管支架，以應用于不同的血管移植條件。

附圖說明：

圖1為脫細胞血管立體結構示意圖。

圖2為脫細胞血管支架剖面結構放大示意圖。

圖中：1，免疫包裹材料；2，高分子纖維；3，醫用硅膠管。

具體實施方式

實施例1：

一種組織工程脫細胞血管支架的制備方法，采用熔融紡絲技術以PCL為原料制備，包括以下步驟：

1)將20克分子量為8000的PCL加入到熔融紡絲機的料筒中，將料筒升溫到210℃并保持1h，調整料筒針頭與外徑為2mm的醫用硅膠管的距離為1cm，設定料筒推進流速為0.5mL/h，接收硅膠管轉速為300rpm，水平移動速度為10mm/s，移動距離為10cm，紡絲時間為12min，得到在硅膠管外纖維呈螺旋式纏繞的有序網狀血管支架；

2)將上述帶有硅膠管的PCL有序網狀血管支架剪為每段2cm，用環氧乙烷滅菌，將大鼠麻醉后，背部兩側剃光成長6cm、寬2cm矩形面，用剪刀剪開1cm長切口，用平頭剪刀將皮層與肌肉組織分離出長4cm、寬1cm、深0.3cm的空腔，將PCL纖維支架平整埋入到空腔中，將切口縫合后消毒，在皮下埋植一個月后，將大鼠麻醉后，在植入支架材料的另一側脫毛切口，將材料與周圍組織剝離后取出，剔除多余的結締組織后得到一個由宿主細胞及胞外基質包裹的組織工程化血管支架；

3)將上述得到的血管支架用75wt％的酒精消毒20min，轉移至超凈臺操作，用1wt％的十二烷基磺酸鈉(SDS)處理12h后，用雙蒸餾水(DDH₂O)將SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶處理處理24h，用DDH₂O將酶完全洗去，得到脫細胞血管支架，放入磷酸緩沖鹽溶液中備用，所述磷酸緩沖鹽溶液的組成：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L；溶液pH為7.2～7.4。

所制備的組織工程脫細胞血管支架用于實驗動物的血管移植，方法如下：將得到的脫細胞血管支架進行大鼠腹主動脈血管移植實驗，通過蘇木素伊紅染色和免疫熒光染色評價其組織相容性和血管再生情況，通過小動物多普勒超聲成像儀檢測血管再大鼠體內的形態和通暢性，對移植血管取材后進行力學性能評價。組織學染色分析可見該脫細胞血管支架與機體之間沒有明顯免疫排斥反應，組織相容性良好；多普勒超聲成像顯示血管形態保持正常，血流通暢；力學測試結果表明，該脫細胞組織工程化血管支架的爆破壓、拉伸強度等力學性能可以滿足生理所需。

實施例2：

一種組織工程脫細胞血管支架的制備方法，采用濕法紡絲技術以PLCL為原料制備，包括以下步驟：

1)將1克PLCL溶解到10mL六氟異丙醇中，室溫攪拌至全部溶解，將直徑為2mm的醫用硅膠管與旋轉電機相連，將PLCL溶液吸入注射器中，注射器針頭置入到乙醇凝固浴中距離硅膠管1cm位置。設定溶液流速為2ml/h，接收硅膠管轉速為500rpm，紡絲時間為40min，得到在硅膠管外纖維呈螺旋式纏繞的有序網狀血管支架，制備完成后將血管支架真空干燥備用；

2)將上述得到的內徑為2mm的有序網狀血管支架裁剪成長為3cm的血管支架，用75wt％醫用酒精滅菌后用無菌生理鹽水置換備用，將兔子麻醉后，背部兩側剃光成長6cm、寬4cm的矩形面，用剪刀剪開1cm長切口，用平頭剪刀將皮層與肌肉組織分離出長4cm、寬1cm、深0.3cm的空腔，將剪好的纖維支架材料平整放入到空腔中，將切口縫合后消毒，在皮下埋植時間達到3個星期后，將兔麻醉后，在植入支架的另一側脫毛切口，將支架與周圍組織剝離后取出；

3)將得到的血管支架用75wt％的酒精消毒20min，轉移至超凈臺操作，用1wt％的十二烷基磺酸鈉(SDS)處理12h后，用雙蒸餾水(DDH₂O)將SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶處理處理24h，用雙蒸餾水(DDH₂O)將酶完全洗去，得到脫細胞血管支架，放入磷酸緩沖鹽溶液中備用(組成同實施例1)。

所制備的組織工程脫細胞血管支架用于實驗動物的血管移植，方法如下：將得到的脫細胞血管支架進行家兔頸動脈血管移植實驗，通過蘇木素伊紅染色和免疫熒光染色評價其組織相容性和血管再生情況，通過小動物多普勒超聲成像儀檢測血管再大鼠體內的形態和通暢性，對移植血管取材后進行力學性能評價。組織學染色分析可見該脫細胞血管支架與機體之間沒有明顯免疫排斥反應，組織相容性良好；多普勒超聲成像顯示血管形態保持正常，血流通暢；力學測試結果表明該脫細胞組織工程化血管支架的爆破壓、拉伸強度等力學性能可以滿足生理所需。