本發(fā)明涉及高分子生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種絲素蛋白納米纖維及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

研制能夠有效促進(jìn)組織再生的生物材料支架是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的迫切需要。天然的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)是我們?cè)O(shè)計(jì)組織工程支架的最佳模板。天然的細(xì)胞外基質(zhì)由大量的膠原、彈性蛋白等纖維蛋白組裝而成，在尺度上具有豐富的微納米纖維結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞粘附和遷移提供物理支持和引導(dǎo)信號(hào)。從仿生的角度來(lái)說(shuō)，用于組織修復(fù)的生物材料支架材料，內(nèi)部構(gòu)建合適的微納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，能夠有效調(diào)控細(xì)胞行為，促進(jìn)細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)和增殖，引導(dǎo)細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)組織再生。因此，高分子材料的納米纖維化及其在組織工程支架中的應(yīng)用對(duì)于促進(jìn)支架材料的功能化具有重要的意義。

蠶絲絲素蛋白是由蠶絹絲腺的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，其生物相容性良好、免疫原性低、力學(xué)性能優(yōu)良、可降解成為多肽和游離氨基酸被機(jī)體吸收和代謝，是組織工程支架的理想原料。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)就家蠶絲素作為組織工程支架開(kāi)展了廣泛的研究，包括相分離、鹽瀝、冷凍干燥在內(nèi)的等多種技術(shù)已經(jīng)用于制備絲素蛋白多孔支架。然而，通過(guò)以上方法獲得的多孔支架，其內(nèi)部缺乏促進(jìn)和引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)微納米纖維引導(dǎo)信號(hào)。目前絲素蛋白納米纖維化的方法主要有靜電紡絲和誘導(dǎo)自組裝。絲素蛋白的靜電紡絲通常需要使用有機(jī)溶劑，降低了材料的生物相容性，而且靜電紡絲制備的絲素蛋白納米纖維也難以制備具有合適孔結(jié)構(gòu)的三維多孔支架。絲素蛋白也可以通過(guò)自組裝形成納米纖維。中國(guó)授權(quán)公告號(hào)為CN 102008756 B的發(fā)明專利提出，預(yù)先使家蠶絲素膠原的混合溶液緩慢自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，然后制備孔壁含納米纖維結(jié)構(gòu)的多孔材料。中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN 102357264 A的發(fā)明專利提出，將絲素蛋白溶液重復(fù)干燥-溶解，緩慢自組裝成納米纖維，然后用于制備孔壁具有納米纖維結(jié)構(gòu)的多孔材料。但這些絲素蛋白自組裝的方法，自組裝過(guò)程緩慢、工藝復(fù)雜，而且獲得納米纖維尺寸較短、不能形成類似細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種新型的絲素蛋白納米纖維化的方法，促進(jìn)絲素蛋白作為組織工程支架的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種絲素蛋白納米纖維及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)凍融的方法重構(gòu)絲素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合冷凍干燥技術(shù)，能夠有效地誘導(dǎo)絲素蛋白的納米纖維化，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、有效、易控。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種絲素蛋白納米纖維化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.取純化的絲素蛋白溶液，將其質(zhì)量濃度調(diào)整為0.1-5%；

S2.將純化的絲素蛋白溶液在-10~0 ℃進(jìn)行冷凍處理2~24h，得到絲素蛋白冷凍體；

S3.將絲素蛋白冷凍體在室溫下融化解凍，離心去除不溶物，得到重構(gòu)的絲素蛋白溶液；

S4.將重構(gòu)的絲素蛋白溶液稀釋到質(zhì)量濃度為0.01-0.5%，在25-37℃下靜置4-12h，然后置于液氮中冷凍成固體，然后將固體做冷凍干燥處理，得到納米纖維化的絲素蛋白。

進(jìn)一步地，所述絲素蛋白為家蠶絲素蛋白。

進(jìn)一步地，所述冷凍處理是在-4℃下冷凍24h。

進(jìn)一步地，所述步驟S3中離心是以5000-15000r/min的轉(zhuǎn)速離心3-10min。

進(jìn)一步地，所述步驟S4中冷凍干燥處理時(shí)間為24h。

一種絲素蛋白納米纖維，由上述方法制備而成。

進(jìn)一步地，其直徑為10-200nm。

一種納米纖維化的多孔支架，所述支架具有孔結(jié)構(gòu)或者通道結(jié)構(gòu)，且孔結(jié)構(gòu)或者通道結(jié)構(gòu)內(nèi)填充有上述的絲素蛋白納米纖維。

進(jìn)一步地，所述填充的具體方法為：

S1.取純化的絲素蛋白溶液，將其質(zhì)量濃度調(diào)整為0.1-5%；

S2.將純化的絲素蛋白溶液在-10~0 ℃進(jìn)行冷凍處理2~24h，得到絲素蛋白冷凍體；

S3.將絲素蛋白冷凍體在室溫下融化解凍，離心去除不溶物，得到重構(gòu)的絲素蛋白溶液；

S4.將重構(gòu)的絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋到0.01-0.4%，灌注到支架材料中，在25-37℃下靜置4-12h，然后置于液氮中冷凍成固體，然后將固體冷凍干燥，得到納米纖維化的多孔支架；所述支架材料為具有孔結(jié)構(gòu)或者通道結(jié)構(gòu)的支架材料。

本發(fā)明的原理是：絲素蛋白在凍融過(guò)程中，二級(jí)結(jié)構(gòu)向亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變形成重構(gòu)的絲素蛋白；重構(gòu)的絲素蛋白溶液在低溫條件下能夠保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在稀釋到0.01-0.5%后，在25℃以上時(shí)容易發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，形成β-折疊化的絲素蛋白；在液氮快速冷凍下能夠有效地組裝成分散的納米纖維結(jié)構(gòu)；同時(shí)，本發(fā)明所提供絲素絲素蛋白納米纖維化的應(yīng)用，通過(guò)將稀釋的重構(gòu)的絲素蛋白溶液灌注具有多孔或者管狀通道結(jié)構(gòu)的空隙中，成功獲得了支架內(nèi)的納米纖維化，有效促進(jìn)了支架的生物功能性。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明通過(guò)凍融的方法重構(gòu)絲素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合冷凍干燥技術(shù)，能夠有效地誘導(dǎo)絲素蛋白的納米纖維化，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、有效、易控；

（2）本發(fā)明的制備過(guò)程都是在低于生理環(huán)境溫度、水環(huán)境下完成，因此制備過(guò)程綠色、溫和，不會(huì)降低材料的生物相容性；

（3）本發(fā)明使用的絲素蛋白溶液濃度低，因此粘度較低，容易灌注到不同的多孔支架的孔隙和管狀材料的通道內(nèi)，實(shí)現(xiàn)支架內(nèi)的納米纖維化。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中制備的絲素蛋白納米纖維的10微米掃描電鏡圖片；

圖2為實(shí)施例1中制備的絲素蛋白納米纖維的1微米掃描電鏡圖片；

圖3為實(shí)施例4中制備的納米纖維化的絲素蛋白多孔支架的500微米掃描電鏡圖片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。

實(shí)施例1

將50 g家蠶生絲浸入2.5 L的0.05%NaCO₃溶液中，于98-100℃下煮沸處理30 min，重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維；將絲素纖維加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下攪拌溶解1小時(shí)得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；

將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到1%，在-7℃下冷凍24小時(shí)后在室溫下融化，獲得重構(gòu)的絲素蛋白溶液；

將重構(gòu)的絲素蛋白溶液以13000 r/min離心5 min，去除不溶物；

將上述重構(gòu)的絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋到0.1%，置于37℃，靜置8小時(shí)；

將上述溶液置于液氮中，冷凍成固體；

將冷凍后的固體放入冷凍干燥機(jī)，經(jīng)24小時(shí)冷凍干燥后得到絲素蛋白納米纖維。

將實(shí)施例1制備過(guò)程中得到的絲素蛋白的納米纖維進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖1和圖2所示。

實(shí)施例2

將脫膠的絲素纖維加入到摩爾比1:2:8的CaCl₂/CH₃CH₂OH/H₂O三元溶液中，在70℃下攪拌溶解1小時(shí)得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；

將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到5%，在-10℃下冷凍24小時(shí)后在室溫下融化，獲得重構(gòu)的絲素蛋白溶液；

將重構(gòu)的絲素蛋白溶液以15000 r/min離心10 min，去除不溶物；

將上述重構(gòu)的絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋到0.01%，置于30℃，靜置12小時(shí)；

將上述溶液置于液氮中，冷凍成固體；

將冷凍后的固體放入冷凍干燥機(jī)，經(jīng)24小時(shí)冷凍干燥后得到絲素蛋白納米纖維。

實(shí)施例3

將脫膠的絲素纖維加入到9 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下攪拌溶解2小時(shí)得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；

將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到0.1%，在-4℃下冷凍24小時(shí)后在室溫下融化，獲得重構(gòu)的絲素蛋白溶液；

將重構(gòu)的絲素蛋白溶液以10000 r/min離心3 min，去除不溶物；

將上述重構(gòu)的絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋到0.5%，置于35℃，靜置4小時(shí)；

將上述溶液置于液氮中，冷凍成固體；

將冷凍后的固體放入冷凍干燥機(jī)，經(jīng)24小時(shí)冷凍干燥后得到絲素蛋白納米纖維。

實(shí)施例4

將脫膠的絲素纖維加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下攪拌溶解1小時(shí)得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；

將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到1%，在-7℃下冷凍24小時(shí)后在室溫下融化，獲得重構(gòu)的絲素蛋白溶液；

將重構(gòu)的絲素蛋白溶液以13000 r/min離心5 min，去除不溶物；

將上述重構(gòu)的絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋到0.1%，按250 μL/cm³灌注到EDC交聯(lián)的絲素蛋白多孔支架內(nèi)，置于25℃，靜止6小時(shí)；

將上述多孔支架置于液氮中冷凍，使灌注到內(nèi)部的溶液冷凍成固體；

將冷凍后的支架放入冷凍干燥機(jī)，經(jīng)24小時(shí)冷凍干燥后得到絲素蛋白納米纖維化的絲素蛋白多孔支架。

將實(shí)施例4制備過(guò)程中得到的納米纖維化的絲素蛋白支架進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖3所示。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。