本發明涉及醫藥技術領域，特別涉及載藥納米材料技術領域，具體涉及一種載藥聚合物納米膠束及其制備方法和應用。

背景技術：

新生血管網絡的形成是腫瘤增殖和轉移擴散的重要因素。從已經存在的血管中產生新血管的過程叫做血管新生。因此，靶向腫瘤血管的血管新生被認為是治療腫瘤的里程碑。腫瘤血管的細胞表面和細胞外基質會表達各種特異性蛋白標志物，這些蛋白標志物在正常細胞中不會表達或者表達水平比腫瘤中低很多。因此，血管新生的腫瘤細胞表面的受體容易錨定特定的靶向分子，如抗體、生物分子、DNA、核酸適配體和多肽等。具有靶向能力的配體能夠輸送藥物或者大分子到達腫瘤血管或腫瘤細胞，從而降低其對正常細胞或組織的毒副作用。不過，與其他化療治療一樣，抗血管新生的治療不能產生持久的療效來使腫瘤大大縮小甚至消失。為了解決這一問題，研究人員設計并開發了具有雙重靶向作用的多肽。

CGKRK(Cys-Gly-Lys-Arg-Lys)多肽與腫瘤血管和細胞的血管新生的內表面具有高度的結合能力和特異性。線粒體蛋白p32被認為是CGKRK多肽的受體，它在多種腫瘤細胞表面都有較高的表達水平。促凋亡D-氨基酸多肽KLAKLAKKLAKLAK(又名D(KLAKLAK)₂)是一種陽離子型α螺旋兩親性的多肽，它能夠通過擾亂線粒體膜來誘導細胞凋亡。這種肽能夠穿透細菌的細胞壁，因此通常用于殺菌；但是它對真核細胞的細胞質膜的穿透能力有限，因此對真核細胞的毒性較小。

為了加強D(KLAKLAK)₂對腫瘤細胞的殺傷力，研究者將特異性靶向腫瘤的多肽CGKRK與D(KLAKLAK)₂連接起來。在連接起來的多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂中，CGKRK部分靶向腫瘤血管的血管新生；D(KLAKLAK)₂部分作用于線粒體膜，通過凋亡途徑來殺死腫瘤細胞。但是，CGKRK-D(KLAKLAK)₂雖然具有腫瘤特異性靶向作用，它仍然呈現出明顯的系統毒性。由于納米載體輸送能夠明顯降低系統毒性，因此該多肽藥物被化學連接到多種納米載體上。

近年來，聚合物膠束作為一種藥物輸送載體在腫瘤治療研究中引起了很大重視。聚合物膠束載藥范圍廣、結構穩定、表面易于修飾，具有優良的組織滲透性,體內滯留時間長,能使藥物有效地到達靶點。而且聚合物膠束由于單體選擇豐富，能夠根據需要進行定制。近幾年的研究中，pH敏感的聚合物膠束研究得較為廣泛。腫瘤細胞與正常細胞和組織(pH 7.4)相比，通常具有較低的pH(6.5-7.2)。在細胞內，核小體和溶酶體也有較低的pH(5.0-6.0)。這些酸性條件使得pH敏感的聚合物膠束成為腫瘤治療的理想載體。

2000年，Robert Langer團隊首次合成聚β-胺酯作(PBAE)為遞送基因的納米載體。聚β-胺酯含有對pH敏感的叔胺，其主鏈上含有的酯鍵也能夠在生理條件下降解，因此聚β-胺酯是一種生物可降解的、pH敏感的聚合物，它被應用于藥物遞送、藥物和基因的共同遞送。到目前為止，還沒有研究者將CGKRK-D(KLAKLAK)₂用pH敏感的聚β-胺酯來遞送。

因此，在本領域中期望能夠得到一種可遞送CGKRK-D(KLAKLAK)₂進入真核細胞的細胞核的載藥納米膠束。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種載藥聚合物納米膠束及其制備方法和應用，所述載藥聚合物納米膠束對pH敏感，可以共載促凋亡多肽和抗腫瘤藥物，且對血管新生具有靶向作用。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

一方面，本發明提供一種載藥聚合物納米膠束，以含有聚β-胺酯的兩親性聚合物作為載體，所述載體與促凋亡多肽共價連接，形成所述載藥聚合物納米膠束。

本發明中，針對納米藥物存在難以從溶酶體逃逸的問題，將pH敏感的含有聚β-胺酯的兩親性聚合物與靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂共軛連接，使其自組裝成納米膠束，膠束內核為聚β-胺酯，膠束外殼為親水性基團，不僅能夠延長納米膠束在血液中的循環時間，還可以使得靶向性促凋亡多肽能夠穿透真核細胞，進入真核細胞細胞核，對細胞本身不會產生毒性。

優選地，所述含有聚β-胺酯的兩親性聚合物為聚β-胺酯-聚乙二醇、聚β-胺酯-聚谷氨酸、聚β-胺酯-聚賴氨酸、聚β-胺酯-聚肌氨酸、聚β-胺酯-聚丙烯酸、聚β-胺酯-透明質酸或聚β-胺酯-磷酰膽堿中的任意一種或至少兩種的組合，優選為聚β-胺酯-聚乙二醇。

優選地，所述促凋亡多肽為靶向性促凋亡多肽，所述靶向性促凋亡多肽的氨基酸序列為CGKRK-D(KLAKLAK)₂。

根據本發明，所述載體與促凋亡多肽的質量比為1:(0.1-10)，例如可以是1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10，優選為1:(0.3-8)，進一步優選為1:(0.5-5)，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

發明人發現，本發明載體與促凋亡多肽限定在這樣的質量比下，可以使得載藥聚合物納米膠束取得較好的包覆率和載藥量，得到的載藥聚合物納米膠束的靶向效果最好。

優選地，所述載藥聚合物納米膠束的粒徑為3-600nm，例如可以是3nm、4nm、5nm、6nm、8nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、220nm、250nm、280nm、300nm、320nm、350nm、380nm、400nm、450nm、500nm、550nm、580nm或600nm，優選為5-400nm，進一步優選為10-200nm，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

根據本發明，為了加強治療效果，所述載藥聚合物納米膠束還包裹抗腫瘤藥物，具體地，將載體與促凋亡多肽共價連接后自組裝成納米膠束，將抗腫瘤藥物包裹在疏水核心中，形成一個穩定的納米球結構，穩定性好，所述載藥聚合物納米膠束能夠靶向腫瘤血管，并通過受體調節來實現細胞內吞，增加負載藥物在細胞內的有效濃度。

優選地，所述抗腫瘤藥物為紫杉醇、多烯紫杉醇、喜樹堿、索菲拉尼、阿霉素或貝伐單抗中的任意一種或至少兩種的組合，優選為多烯紫杉醇。

根據本發明，所述載藥聚合物納米膠束為以聚β-胺酯-聚乙二醇為載體，所述載體與靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂共價連接，包裹多烯紫杉醇，所述載藥聚合物納米膠束是一個致密的納米球結構，進入細胞后，在溶酶體的酸性pH下，聚合物膠束解離，載藥聚合物納米膠束從一個致密的納米球結構變為一個松散的結構，同時釋放出載帶的靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂和多烯紫杉醇，自由的多肽和多烯紫杉醇能夠從溶酶體中逃逸出來，兩者同時一起釋放進入細胞質，起到了一種疊加的殺傷作用；在CGKRK的靶向作用下，D(KLAKLAK)₂能夠到達線粒體位置并破壞線粒體膜，誘導細胞凋亡，多烯紫杉醇則進入細胞核作用于微管蛋白，兩者協同作用，加強了對腫瘤細胞的效果。

優選地，所述包裹抗腫瘤藥物的載藥聚合物納米膠束的粒徑為5-800nm，例如可以是5nm、6nm、8nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、220nm、250nm、280nm、300nm、320nm、350nm、380nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm或800nm，優選為10-500nm，進一步優選為10-200nm，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優選地，所述包裹抗腫瘤藥物的載藥聚合物納米膠束中促凋亡多肽共價連接的聚β-胺酯-聚乙二醇與抗腫瘤藥物的質量比為(1-50):(0.1-5)，例如可以是1:0.1、1:0.2、1:0.5、1:0.8、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:0.1、2:0.5、2:1、2:2、2:5、3:1、3:5、5:1、5:5、8:0.5、8:1、8:5、10:0.5、10:1、10:5、15:0.5、15:1、15:5、20:0.5、20:1、20:5、25:0.5、25:1、25:5、30:0.5、30:1、30:5、35:0.5、35:1、35:5、40:0.5、40:1、40:5、45:0.5、45:1、45:5、48:0.5、48:1、48:5、50:0.5、50:1或50:5，優選為(1-50):1，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

第二方面，本發明提供如第一方面所述的載藥聚合物納米膠束的制備方法，包括以下步驟：

將含有聚β-胺酯的兩親性聚合物和促凋亡多肽溶于有機溶劑中，在惰性氣體的保護下避光攪拌，而后除去有機溶劑，干燥后得到載藥聚合物納米膠束；

優選地，所述方法還包括如下步驟：將制備得到的載藥聚合物納米膠束與抗腫瘤藥物溶解于有機溶劑中，并將上述有機溶劑加入到緩沖溶液中攪拌，除去有機溶劑，得到所述包裹抗腫瘤藥物的載藥聚合物納米膠束。

作為優選技術方案，所述載藥聚合物納米膠束的制備方法，包括以下步驟：

(1)將含有聚β-胺酯的兩親性聚合物和促凋亡多肽溶于有機溶劑中，在惰性氣體的保護下避光攪拌，而后除去有機溶劑，干燥后得到載藥聚合物納米膠束；

(2)將步驟(1)得到的載藥聚合物納米膠束與抗腫瘤藥物溶解于有機溶劑中，并將上述有機溶劑加入到緩沖溶液中攪拌，除去有機溶劑，得到所述包裹抗腫瘤藥物的載藥聚合物納米膠束。

優選地，所述有機溶劑為DMSO、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或四氫呋喃中的任意一種或至少兩種的組合，優選DMSO。

優選地，所述除去有機溶劑采用透析來實現。

優選地，所述透析使用的透析袋的截留分子量為1000-3000，例如可以是1000、1100、1200、1300、1500、1600、1800、2000、2100、2300、2500、2600、2800、2900或3000，優選為2000，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優選地，步驟(1)所述載體與促凋亡多肽的質量比為1:(0.1-10)，例如可以1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10，優選為1:(0.3-8)，進一步優選為1:(0.5-5)，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優選地，步驟(1)所述攪拌的溫度為30-60℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、35℃、36℃、8℃、40℃、41℃、43℃、45℃、48℃、50℃、51℃、53℃、55℃、58℃或60℃，優選為40-55℃，進一步優選為50℃，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優選地，步驟(1)所述攪拌的時間為3-10天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天，優選為4-6天，進一步優選為5天，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優選地，步驟(1)所述干燥的方式為冷凍干燥。

優選地，步驟(2)所述有機溶劑與緩沖溶液的體積比為1:(1-5)，例如可以是優選為1:(1-3)，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優選地，步驟(2)所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或Tris-HCl，優選為磷酸鹽緩沖液；

根據本發明，所述載藥聚合物納米膠束在pH7.4的緩沖液中穩定性良好，直徑為10-200nm，具備丁達爾現象；在pH5.0的醋酸鹽緩沖液中解離，不再具備丁達爾現象；步驟(2)所述緩沖溶液的pH為6.5-8.5，例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，優選為7-8，進一步優選為7.4，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

優選地，步驟(2)所述攪拌的時間為1-20h，例如可以1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h，優選為1-12h，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

第三方面，本發明提供如第一方面所述的載藥聚合物納米膠束在制備靶向腫瘤藥物中的應用。

相對于現有技術，本發明具有以下有益效果：

(1)本發明將pH敏感的含有聚β-胺酯的兩親性聚合物與靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂共軛連接，使其自組裝成納米膠束，膠束內核為聚β-胺酯，膠束外殼為親水性基團，不僅能夠延長納米膠束在血液中的循環時間，還可以使得靶向性促凋亡多肽能夠穿透真核細胞，進入真核細胞細胞核，對細胞本身不會產生毒性；

(2)本發明將載體與促凋亡多肽共價連接后自組裝成納米膠束，將抗腫瘤藥物包裹在疏水核心中，形成一個穩定致密的納米球結構，穩定性好，兩者同時一起釋放進入細胞質，起到了一種疊加的殺傷作用，在CGKRK的靶向作用下，D(KLAKLAK)₂能夠到達線粒體位置并破壞線粒體膜，誘導細胞凋亡，多烯紫杉醇則進入細胞核作用于微管蛋白，兩者協同作用，加強了對腫瘤細胞的效果。

附圖說明

圖1為本發明載藥聚合物膠束的動態光散射檢測結果；

圖2為本發明載藥聚合物膠束的TEM圖像；

圖3為本發明載藥聚合物膠束的核磁圖譜，其中，圖3(A)為PBAE-PEG的核磁圖，圖3(B)為CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的PBAE-PEG的核磁圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。

實施例1靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的pH敏感的聚β-胺酯-聚乙二醇的合成

稱取900mg丁二醇二丙烯酸酯，300mg 5-氨基-1-戊醇和700mg mPEG-NH2溶于DMSO中，在惰性氣氛保護下，50℃避光攪拌一周。待體系冷卻后，用大量的冷乙醚洗滌三次以除去沒反應完全的單體，之后真空干燥，即得到聚β-胺酯-聚乙二醇。

稱取100mg聚β-胺酯-聚乙二醇和120mg靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂，溶于2mL DMSO中，在惰性氣氛保護下，50℃避光攪拌5d，之后用截留分子量為2000的透析袋透析除去DMSO，并凍干以得到干燥的產物，即CGKRK-D(KLAKLAK)2修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇。

實施例2靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的pH敏感的聚β-胺酯-聚乙二醇的合成

稱取800mg丁二醇二丙烯酸酯，400mg 5-氨基-1-戊醇和600mg mPEG-NH2溶于2mL DMSO中，在惰性氣氛保護下、50℃避光攪拌一周。待體系冷卻后，用大量的冷乙醚洗滌三次以除去沒反應完全的單體，之后真空干燥，即得到聚β-胺酯-聚乙二醇。

稱取100mg聚β-胺酯-聚乙二醇和100mg靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂，溶于2mL DMSO中，在惰性氣氛保護下、50℃避光攪拌5d，之后用截留分子量為2000的透析袋透析除去DMSO，并凍干以得到干燥的產物，即CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇。

實施例3靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的pH敏感的聚β-胺酯-聚乙二醇的合成

稱取100mg實施例2制備得到的聚β-胺酯-聚乙二醇和50mg靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂，溶于2mL DMSO中，在惰性氣氛保護下、30℃避光攪拌10d，之后用截留分子量為3000的透析袋透析除去DMSO，并凍干以得到干燥的產物，即CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇。

實施例4靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的pH敏感的聚β-胺酯-聚乙二醇的合成

稱取100mg實施例2制備得到的聚β-胺酯-聚乙二醇和1000mg靶向性促凋亡多肽CGKRK-D(KLAKLAK)₂，溶于2mL DMSO中，在惰性氣氛保護下、60℃避光攪拌3d，之后用截留分子量為1000的透析袋透析除去DMSO，并凍干以得到干燥的產物，即CGKRK-_D(KLAKLAK)₂修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇。

實施例5pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束的制備

稱取6mg CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇和0.3mg多烯紫杉醇，混勻在1mL DMSO中，之后將該有機相逐滴加入到緩慢攪拌的2mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，讓聚合物自組裝成膠束。最后，在磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中透析除去有機溶劑，得到pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束，動態光散射檢測結果如圖1所示，可以看出，平均粒徑在110nm。

實施例6pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束的制備

稱取6mg CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇和0.4mg多烯紫杉醇，混勻在1mL DMSO中，之后將該有機相逐滴加入到緩慢攪拌的2mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，讓聚合物自組裝成膠束。最后，在磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中透析除去有機溶劑，得到pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束。

實施例7pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束的制備

稱取6mg CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇和6mg多烯紫杉醇，混勻在1mL DMSO中，之后將該有機相逐滴加入到緩慢攪拌的2mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，讓聚合物自組裝成膠束。最后，在磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中透析除去有機溶劑，得到pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束。

實施例8pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束的制備

稱取10mg CGKRK-D(KLAKLAK)₂修飾的聚β-胺酯-聚乙二醇和0.2mg多烯紫杉醇，混勻在1mL DMSO中，之后將該有機相逐滴加入到緩慢攪拌的2mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，讓聚合物自組裝成膠束。最后，在磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中透析除去有機溶劑，得到pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束。

用英國馬爾文儀器公司的Zetasizer Nano ZS激光動態光散射儀檢測pH敏感的促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束的粒徑，其平均粒徑為117nm，采用TEM來驗證載藥聚合物膠束，結果如圖2所示，平均粒徑在117nm。

采用核磁來驗證載藥聚合物膠束，結果如圖3(A)-圖3(B)所示，h,g,i峰的消失證明CGKRK-D(KLAKLAK)₂成功結合到PBAE-PEG的末端。

實施例9細胞毒性檢測

將MCF-7(鼠乳腺癌)細胞以每孔7000個細胞的密度種植在96孔板中，生長24h之后，分布加入自由藥物多烯紫杉醇或者促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束，以沒有加藥處理的細胞作為對照，共孵育24h之后，將舊培養基去掉，加入MTT溶液再孵育4h，之后加入100μL DMSO，檢測570nm的紫外吸收，并計算細胞存活率，在相同多烯紫杉醇濃度5μg/mL下，自由多烯紫杉醇處理的細胞存活率為55％，而促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束處理的細胞存活率為25％，表明促凋亡多肽/多烯紫杉醇共載的血管新生靶向聚合物膠束能夠明顯增強多烯紫杉醇的抗腫瘤活性。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的載藥聚合物納米膠束及其制備方法和應用，但本發明并不局限于上述實施例，即不意味著本發明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。