技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療心血管疾病和腦血管疾病的組合物及其制備與檢驗(yàn)方法，具體的說涉及包含牡荊素和甘露醇的混合組合物，該組合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流動(dòng)力學(xué)以及抗腦缺血等方面，效果顯著。
背景技術(shù)：
：根據(jù)最近的世界衛(wèi)生報(bào)告，冠心病發(fā)病及死亡率近年呈快速增長的趨勢，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球因病死亡中每3個(gè)中就有1個(gè)死于心血管疾病，預(yù)計(jì)到2020年心血管死亡率將增加50％，悉尼大學(xué)的流行病學(xué)專家MacMahon教授指出，2020年心肌梗死與腦卒中將從目前死因的第5與第6位上升至第1和第4位。在我國，12個(gè)城市的統(tǒng)計(jì)，本病人口死亡率為29.6/10萬，其中以北京、天津兩市最高。20世紀(jì)80年代中期，北京、上海、廣州三市本病人口死亡率分別為21.7/10萬、15.7/10萬、4.1/10萬，20世紀(jì)90年代中期分別增至62.0/10萬、37.4/10萬、19.8/10萬，其趨勢北方高于南方。動(dòng)脈硬化、血栓、冠心病、心絞痛是高發(fā)性、高病死率、高殘障性疾病，給一個(gè)人、家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，是全球衛(wèi)生保健和衛(wèi)生資源的巨大負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO預(yù)計(jì)，心腦血管疾病每年至少造成全球1200萬人死亡，已成為人類健康的頭號(hào)敵人。在2005年全球10大暢銷藥物中，心腦血管類藥物占到了4個(gè)。2004年，全球心腦血管藥物銷售額為608億美元，預(yù)計(jì)2008年將上升至912億美元，而2010年這一數(shù)字將有可能竄升為1044億美元。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計(jì)，我國心腦血管病藥物市場的規(guī)模約有160億～180億元人民幣，其中西藥與中藥制劑各占半壁江山。在過去10年內(nèi)，抗心腦血管病中藥(尤以中藥注射劑為主)早已成為國內(nèi)醫(yī)院的常用臨床治療劑。預(yù)計(jì)2020年隨著人口老齡化到來，我國和其他發(fā)展中國家將會(huì)迎來冠心病流行高峰，此類藥物將繼續(xù)顯示強(qiáng)勁的增長勢頭。臨床實(shí)踐證明，中藥注射劑治療心腦血管疾病具有化學(xué)藥產(chǎn)品不可替代的獨(dú)特功效，也有中藥其他劑型難以具備的優(yōu)勢，市場前景廣闊，有望成為未來中藥生產(chǎn)企業(yè)研發(fā)的熱點(diǎn)和市場競爭最為激烈的領(lǐng)域，也是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和現(xiàn)代化可能的重要方向。不得不承認(rèn)的是，盡管國內(nèi)每年都有一些新的治療冠心病中藥應(yīng)用于臨床，但除極少數(shù)藥物外，大多數(shù)中藥始終未能踏進(jìn)國際市場的大門，其原因除藥理學(xué)研究、有效藥物成分、藥代過程并不十分明確外，更主要是因?yàn)闆]有充分采用國際統(tǒng)一的療效標(biāo)準(zhǔn)，很難證明中藥在治療冠心病方面的療效和安全性優(yōu)勢。無論是最佳劑量還是給藥途徑，或是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)過程，目前的研究還不能給出最具說服力的解釋。目前臨床使用頻率較高的中成藥品種包括丹參注射液、川芎嗪注射液、生脈注射液、燈盞花素注射液、黃芪注射液、參脈注射液、參附注射液、葛根素注射液等。山楂葉制劑無論在國內(nèi)還是在國外，在心血管疾病治療上都有著廣范應(yīng)用。據(jù)了解，在歐洲，山楂果、葉和花的混合提取物用于穩(wěn)定性心絞痛患者取得了肯定療效，山楂葉制劑對早期老年慢性心力衰竭的治療也取得顯著療效。在國內(nèi)，山楂葉現(xiàn)已收載于《中國藥典》2005年及2010年一部，山楂葉提取物及制劑益心酮片也已均收載于《中國藥典》2005年及2010年一部。益心酮片作為藥品上市最早收載中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第六冊151頁。功能主治：活血化瘀，宣通血脈。用于瘀血阻脈所致的胸痹，癥見胸悶憋氣、心前取刺痛、心悸健忘、眩暈耳鳴；冠心病心絞痛、高脂血癥、腦動(dòng)脈供血不足見上述癥候著。現(xiàn)代研究表明山楂葉提取物具有降血壓、降低外周血管阻力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈流量、降低心肌耗氧量、強(qiáng)心、增加心輸出量、抗心肌缺血，抗血小板聚集、改善血液流變性，消除氧自由基、降膽固醇和甘油三脂、增強(qiáng)耐缺氧能力和利尿等藥理作用。臨床應(yīng)用于冠心病心絞痛及各種原因引起的早搏有明顯療效，有效地緩解心絞痛及心悸、胸悶等癥狀，改善心電圖，降低血脂，提高HDL，改善微循環(huán)和血流變，增加腦血流量，抗脂質(zhì)過氧化，且安全，未見毒副作用。牡荊素為黃酮類化合物C苷，口服制劑，其生物利用度低，不利于本品臨床療效發(fā)揮，故我們將牡荊素制與甘露醇成凍干粉針組合物。即利于臨床療效最大發(fā)揮，又利于運(yùn)輸、貯藏，方便臨床用藥。社會(huì)人口老齡化即將到來，冠心病、心絞痛、腦中風(fēng)患者日益增多，且有年輕化的趨勢，對此類藥物需求日益增大，已上市臨床運(yùn)用藥物隨著患者使用增多，各種不良反應(yīng)也隨著增加。臨床費(fèi)用居高不下，市場急需療效確切不良反應(yīng)少，毒副作用低，價(jià)格相對便宜的藥物。牡荊素、甘露醇組合物，質(zhì)量穩(wěn)定可控，療效確切體內(nèi)作用清楚，不良反應(yīng)少，毒副作用低，物美價(jià)廉是普通百姓都能用得起的藥。本品開發(fā)上市將能更好的滿足廣大患者需要，解決患者身心痛苦，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供了一種新的臨床用于治療心腦血管疾病的藥物，該藥物效果確切，作用速度快，毒副作用低。本發(fā)明還提供了牡荊素和甘露醇的混合組合物的制備方法、檢驗(yàn)方法。本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：治療心腦血管疾病的組合物，其活性成分為治療有效量的牡荊素和甘露醇的混合組合物。治療心腦血管疾病的組合物是通過在干重的基礎(chǔ)上，按照1:6～10重量比的牡荊素和甘露醇來制備的，具體步驟如下：a、稱取處方量甘露醇、牡荊素原料混合，加注射用水，攪拌均勻，再加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液，攪拌溶解，再用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)至PH在8.5±0.5左右，加0.04-0.05％的針用活性炭，攪拌10-15分鐘，微孔鈦過濾器減壓粗濾，脫炭，檢查含量、pH合格后，再經(jīng)0.2-0.25μm微孔濾膜終端過濾后，分裝于西林瓶中，低溫冷凍干燥；b、預(yù)凍：把分裝好的藥品放入凍干箱內(nèi)隔板上預(yù)凍開始至+25℃～-40℃；c、升華干燥：將冷凝器溫度下降至-45℃以下，啟動(dòng)真空泵，待真空度達(dá)到一定數(shù)值后，緩緩打開蝶閥，當(dāng)干燥箱內(nèi)的真空度達(dá)13.33Pa即0.1mmHg以下關(guān)閉冷凍機(jī)，通過隔板下的加熱系統(tǒng)緩緩加熱，使凍結(jié)產(chǎn)品的溫度逐漸升高至22-25℃；d、再干燥：在25-30℃下干燥，干燥失重符合規(guī)定,在無菌條件下加蓋膠塞，軋蓋，包裝，檢驗(yàn)，入庫。治療心腦血管疾病的組合物的檢驗(yàn)方法，包括以下過程：(1)取本品適量，加乙醇制成每1ml含主藥20μg溶液，作為供試品溶液，另取牡荊素對照品同法制成對照品溶液，按照2010年版中國藥典一部附錄薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對照品溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺膜上，以36％醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1％三氯化鋁溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；(2)取本品適量，加乙醇制成每1ml含主藥10μg的溶液，按照2010年版中國藥典一部附錄紫外-可見分光光度法測定，在270nm波長處有最大吸收；(3)有關(guān)物質(zhì)：取本品內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取約相當(dāng)于牡荊素25mg的樣品，置50ml量瓶中，加60％乙醇10ml使溶解后用流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含500μg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，作為對照溶液；另精密稱取葒草素對照品適量，用流動(dòng)相使溶解并定量稀釋制成每1ml中含3μg的溶液作為雜質(zhì)對照品溶液，按照(5)含量測定項(xiàng)下的色譜條件，精密量取對照品溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20％；再精密量取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時(shí)間4倍，供試品溶液色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，含雜質(zhì)葒草素按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過0.6％，在供試品溶液中任何小于對照溶液主峰面積0.01倍的峰可忽略不計(jì)的情況下，所有各雜質(zhì)量的總和不得過2.0％；(4)甘露醇：取本品適量，約相當(dāng)于甘露醇0.2g，精密稱定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸鈉溶液[取硫酸溶液(1→20)90ml與高碘酸鈉溶液(2.3→1000)110ml混合制成]50ml，置水浴上加熱15分鐘，放冷，加碘化鉀試液10ml，密塞，放置5分鐘，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液1ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml硫代硫酸鈉滴定液相當(dāng)于0.9109mg的C6H14O6，含甘露醇應(yīng)為標(biāo)示量的90.0～110.0％；(5)牡荊素含量測定：按照2010年版中國藥典一部附錄高效液相色譜法測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水-冰醋酸為18：82：1為流動(dòng)相；檢測波長為270nm。理論板數(shù)按牡荊素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，牡荊素峰與雜質(zhì)峰的分離度均應(yīng)符合要求；測定法：取本品內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取約相當(dāng)于牡荊素25mg的樣品，置50ml量瓶中，加60％乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1ml置10ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取牡荊素對照品適量，精密稱定，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含牡荊素(C21H20O10)應(yīng)為標(biāo)示量的90.0～110.0％。本發(fā)明治療心腦血管疾病的牡荊素和甘露醇的混合組合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流動(dòng)力學(xué)以及抗腦缺血等方面，療效確切顯著，作用速度快，質(zhì)量穩(wěn)定可控，無不良反應(yīng)，毒副作用低，成本較低，能更好的滿足廣大患者需要，解決患者身心痛苦，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例1：注射用牡荊素甘露醇的制備a、稱取牡荊素30g、甘露醇180g原料均勻混合，加600ml注射用水，攪拌均勻，再加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液1500ml，攪拌溶解，再用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)至PH在8.5左右，加注射用水至3000ml，加0.05％的針用活性炭，攪拌10分鐘，微孔鈦過濾器減壓粗濾，脫炭，檢查含量、pH合格后，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜終端過濾后，分裝于10ml西林瓶中，每瓶裝3ml，低溫冷凍干燥。b、預(yù)凍：把分裝好的藥品放入凍干箱內(nèi)隔板上預(yù)凍開始至+25℃～-40℃，2小時(shí)；-40℃，3小時(shí)。c、升華干燥：將冷凝器溫度下降至-45℃以下，啟動(dòng)真空泵，待真空度達(dá)到一定數(shù)值后，緩緩打開蝶閥，當(dāng)干燥箱內(nèi)的真空度達(dá)13.33Pa(0.1mmHg)以下關(guān)閉冷凍機(jī)，通過隔板下的加熱系統(tǒng)緩緩加熱，使凍結(jié)產(chǎn)品的溫度逐漸升高至-20℃，再由-20℃逐漸升高至25℃。整個(gè)升華干燥過程約26小時(shí)。d、再干燥：在25℃下干燥約5小時(shí)，干燥失重符合規(guī)定,在無菌條件下加蓋膠塞，軋蓋，包裝，檢驗(yàn)，入庫。實(shí)施例2：注射用牡荊素甘露醇的檢驗(yàn)(1)取本品14.0mg，加乙醇制成每1ml含牡荊素20μg溶液，作為供試品溶液；另取牡荊素對照品同法制成對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對照品溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺膜上，以36％醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1％三氯化鋁溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；(2)取本品7.0mg，加乙醇制成每1ml含主藥10μg的溶液，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2010年版一部附錄ⅤA)測定，在270nm波長處有最大吸收；(3)有關(guān)物質(zhì)取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于牡荊素25mg)，置50ml量瓶中，加60％乙醇10ml使溶解后用流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含500μg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，作為對照溶液。另精密稱取葒草素對照品適量，用流動(dòng)相使溶解并定量稀釋制成每1ml中含3μg的溶液作為雜質(zhì)對照品溶液。照含量測定項(xiàng)下的色譜條件，精密量取對照品溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20％；再精密量取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時(shí)間4倍，供試品溶液色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，含雜質(zhì)葒草素按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過0.6％，所有各雜質(zhì)量的總和不得過2.0％。(供試品溶液中任何小于對照溶液主峰面積0.01倍的峰可忽略不計(jì))；(4)甘露醇取本品233.3mg，約相當(dāng)于甘露醇0.2g，精密稱定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸鈉溶液[取硫酸溶液(1→20)90ml與高碘酸鈉溶液(2.3→1000)110ml混合制成]50ml，置水浴上加熱15分鐘，放冷，加碘化鉀試液10ml，密塞，放置5分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.05mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液1ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml硫代硫酸鈉滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于0.9109mg的C6H14O6，含甘露醇應(yīng)為標(biāo)示量的100.1％；(5)牡荊素含量測定照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥD)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水-冰醋酸(18：82：1)為流動(dòng)相；檢測波長為270nm。理論板數(shù)按牡荊素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，牡荊素峰與雜質(zhì)峰的分離度均應(yīng)符合要求；測定法：取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于牡荊素25mg)，置50ml量瓶中，加60％乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取1ml置10ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取牡荊素對照品適量，精密稱定，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含牡荊素(C21H20O10)應(yīng)為標(biāo)示量的90.0～110.0％。實(shí)施例3：注射用牡荊素甘露醇的臨床使用靜脈滴注，一次1瓶，一日1次；用150ml生理鹽水溶解后使用。具體用法是取無菌注射針管吸取3～5ml注射用水，注入裝有牡荊素、甘露醇組合物的西林瓶中，搖勻使溶解，再用無菌針管吸取注入150ml生理鹽水中，搖勻后，用靜脈滴注的方法，滴入患者靜脈血管內(nèi)。實(shí)施例4：注射用牡荊素甘露醇的臨床使用靜脈滴注，一次2瓶，一日1次；用150ml生理鹽水溶解后使用。具體用法是取無菌注射針管吸取3～5ml注射用水，注入裝有牡荊素、甘露醇組合物的西林瓶中，搖勻使溶解，再用無菌針管吸取注入150ml生理鹽水中，搖勻后，用靜脈滴注的方法，滴入患者靜脈血管內(nèi)。實(shí)施例5：注射用牡荊素甘露醇的臨床使用靜脈滴注，一次2瓶，一日1次；用250ml生理鹽水溶解后使用。具體用法是取無菌注射針管吸取3～5ml注射用水，注入裝有牡荊素、甘露醇組合物的西林瓶中，搖勻使溶解，再用無菌針管吸取注入250ml生理鹽水中，搖勻后，用靜脈滴注的方法，滴入患者靜脈血管內(nèi)。本發(fā)明藥物組合物具有活血化瘀，宣通血脈。用于瘀血阻脈所致的胸悶胸痛、肢體麻木、中風(fēng)偏癱；腦中風(fēng)、冠心病、心絞痛見上述癥候者。本發(fā)明藥效、藥理、毒理等試驗(yàn)詳見下述：試驗(yàn)例1：動(dòng)物心血管藥效研究1、動(dòng)物心血管藥效學(xué)研究結(jié)果(1)試驗(yàn)材料牡荊素、甘露醇混合組合物：由合肥七星醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：101109(凍干粉針，為淡黃色疏松塊狀物，規(guī)格：30mg/每瓶)，臨用前用生理鹽水(NS)溶解至所需濃度；昆明種小白鼠(體重18－24g)及Wistar大鼠(體重200～320g)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)第01號(hào)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度：22±2℃；家兔(體重2.0～2.5kg)和雜種狗(體重7.5～12.0kg)：安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)試驗(yàn)方法：小鼠氣管夾閉心肌缺氧模型昆明種小鼠50只，體重18～24g。隨機(jī)分為5組：NS對照組、牡荊素、甘露醇混合組合物(12，6，3mg·kg-1)3個(gè)劑量組以及葛根素(60mg·kg-1)陽性藥對照組，每組10只，♀♂各半。小鼠尾靜脈注射給予(iv)受試藥物后背位固定于蛙板上，做頸部正中切口，分離氣管，并連接ECG。給藥后20min夾閉氣管，同時(shí)開始記時(shí)，以ECGⅡ?qū)?lián)持續(xù)出現(xiàn)一平直線(即心電消失)作為小鼠死亡的標(biāo)志。記錄小鼠夾閉氣管后Ⅱ?qū)?lián)心電持續(xù)的時(shí)間(min)。大鼠急性心肌缺血模型大鼠60只隨機(jī)分為6組：假手術(shù)(Sham)組；NS模型對照組；牡荊素、甘露醇混合組合物(6，3，1.5mg·kg-1)3個(gè)劑量組以及葛根素(30mg·kg-1)陽性藥對照組，每組10只，♀♂各半。大鼠以10％水合氯醛(0.3ml·100g－1)腹腔注射(ip)麻醉，仰臥位固定，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，行氣管插管，接人工呼吸機(jī)(呼吸時(shí)比為1.5∶1，60次·min－1，潮氣量70次·min－1)，于胸骨左緣3～5肋打開胸腔，暴露心臟，在肺動(dòng)脈圓錐左緣與左心耳下緣2mm處經(jīng)淺層心肌穿一3/8絲線。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成心肌缺血。其中，Sham組及模型組舌下靜脈注射(iv)NS，且Sham組只穿線不結(jié)扎，其它各受試藥組大鼠于冠脈結(jié)扎前20miniv相應(yīng)的受試藥物。實(shí)驗(yàn)過程中，定期監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)ECG，30min后經(jīng)右側(cè)CCA插管取血，3000rpm離心10min，取上清液待測LDH和CK活力；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即摘取心臟，留取左心室稱重，并將其橫切成6～8片，置入0.2％NBT染液中，37℃染色20min后，分離梗死心肌并稱重，以計(jì)算梗死心肌占左心室肌濕重的百分比。Iso誘發(fā)大鼠急性心肌缺血模型50只大鼠(體重220～240g)隨機(jī)分為模型組(ivNS+scIso)、牡荊素、甘露醇混合組合物(6，3，1.5mg·kg-1)3個(gè)劑量組(iv牡荊素、甘露醇混合組合物+scIso)及葛根素30mg·kg-1組(iv葛根素+scIso)，共5組，每組10只，♀♂各半。其中，Iso(注射劑量為5mg·kg-1)于各組受試藥物iv給藥后20min時(shí)于背部皮下注射給予，以誘發(fā)出現(xiàn)急性心肌缺血，并產(chǎn)生缺血ECG波形(Ⅱ?qū)?lián)，ST段抬高或壓低)。各組于注射Iso前及注射后30’,1’,2’,5’,10’,20’分別記錄一次ECG(Ⅱ?qū)?lián))，以ST段偏移基線的高度的總和ΣST的mv數(shù)以及ST段偏移的平均值作為心肌缺血損傷程度的指標(biāo)。20min后處死大鼠，迅速摘取完整心肌組織，剪取心尖部固定部位心肌組織稱濕重；80℃烘烤15小時(shí)后，再稱其干重。計(jì)算心肌含水量(MWC)。MWC＝(濕重-干重)/濕重×100％。犬急性實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞實(shí)驗(yàn)健康成年雜種犬36只，體重7.5～12.0kg。隨機(jī)分成6組：Sham組、NS模型組、牡荊素、甘露醇混合組合物(4，2，1mg·kg-1)3個(gè)劑量組及葛根素15mg·kg-1組，每組6只，♀♂兼用，♀未孕。將犬以3％戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，右側(cè)位固定于手術(shù)臺(tái)上，行氣管插管并連接人工呼吸機(jī)維持呼吸。左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟，分離冠狀動(dòng)脈左前降支中下1/3處，穿線以備結(jié)扎。按梗死區(qū)、梗死周圍及正常組織部位固定30個(gè)心外膜電圖電極，于冠脈結(jié)扎后即刻，5，15，30，45，60，90，120min等時(shí)刻描記心電圖，以ST段升高總電壓數(shù)表示心肌缺血程度(ΣST)，以ST段升高大于2mv的導(dǎo)聯(lián)數(shù)，計(jì)算心肌缺血范圍(N-ST)。結(jié)扎前20min用藥組經(jīng)股靜脈注入所試藥物(給藥容積為1ml/kg)。結(jié)扎2h時(shí)取血待測CK，LDH活性，并迅速于左心室注入碳素墨水后處死，取出心臟，生理鹽水洗凈瘀血，剪下左心室，濾紙吸干后稱重。分離缺血區(qū)(白色)與非缺血區(qū)(黑色)，稱取缺血心肌重量。再將缺血心肌切成等厚的幾片，置于0.2％NBT中，37℃染色20min，剪下梗死心肌(不染色或灰黃色)稱重。以缺血心肌重/左室重×100％代表缺血范圍；以梗死心肌重/缺血心肌重×100％代表梗塞范圍。并計(jì)算心梗指數(shù)，心梗指數(shù)＝梗死區(qū)重量/左室重×100％。雜種犬血流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)選用健康雜種犬30只，體重7.5～12.0kg。隨機(jī)分成5組：NS對照組、牡荊素、甘露醇混合組合物(4，2，1mg·kg-1)3個(gè)劑量組及葛根素15mg·kg-1組，每組6只，♀♂兼用，雌性未孕。以3％戊巴比妥鈉靜脈麻醉，取仰臥位固定。頸部正中切口，暴露并切開氣管，接氣管插管；分離右側(cè)頸靜脈以備冠狀靜脈竇插管進(jìn)行血氧含量測定用；分離左下肢股動(dòng)脈，接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)描記血壓；分離右下肢股動(dòng)脈以備采血進(jìn)行動(dòng)脈血氧含量測定；分離左下肢股靜脈，緩慢恒速輸入生理鹽水(約1ml/min)以補(bǔ)充丟失的體液；四肢皮下固定針式電極，描記標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)ECG，以計(jì)算心率；然后動(dòng)物取前肢右臥位，胸前區(qū)去毛，于左四、五肋間，沿第四肋下緣切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露胸膜后，接人工呼吸機(jī)，充分止血后切開胸膜，提起心包膜切開并作心包床，小心分離冠狀動(dòng)脈左旋支和主動(dòng)脈根部后留預(yù)置線，根據(jù)冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈的粗細(xì)，選擇并連接合適的多普勒超聲血流儀MP100探頭(2mm，12mm)；左心室插管(管內(nèi)充滿肝素生理鹽水)經(jīng)左心室心尖部插入左心室內(nèi)，接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測量左室內(nèi)壓、左室舒張末期壓；從右頸靜脈插管至冠狀靜脈竇(心導(dǎo)管內(nèi)注入肝素生理鹽水抗凝)；上述操作結(jié)束后，靜脈注射肝素進(jìn)行全身肝素化(5mg/kg)。待動(dòng)物穩(wěn)定30分鐘后，觀察并記錄血壓、ECG、冠狀動(dòng)脈流量和主動(dòng)脈流量，并從股動(dòng)脈和冠狀靜脈竇取血進(jìn)行血氧含量測定，作為給藥前的正常值。然后根據(jù)不同組別和劑量靜脈注射給藥(給藥容積為1ml/kg)，于給藥后5，15，30，45，60，90和120min時(shí)分別測定冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈血流量、血壓以及ECG等，并于給藥后30min，60min分別采血測冠狀靜脈竇和股動(dòng)脈血氧含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出心臟稱重。根據(jù)結(jié)果，將血壓、心率、左室內(nèi)壓、冠狀動(dòng)脈血流量、主動(dòng)脈血流量及血氧含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，并根據(jù)公式計(jì)算出心搏出量、心臟指數(shù)、心搏指數(shù)、左室作功、每分鐘100克心肌血流量、冠脈阻力、總外周阻力、心肌耗氧量、心肌氧利用率及心肌耗氧指數(shù)等。二級(jí)指標(biāo)計(jì)算公式如下：⑴體表面積＝(體重kg)2/3×0.11⑵心搏出量＝心輸出量(ml/min)÷心率(beat/min)⑶心臟指數(shù)＝心輸出量(ml/min)÷體表面積(m2)⑷心搏指數(shù)＝心臟指數(shù)(L/min/m2)÷心率(beat/min)×103⑸左室作功＝心臟指數(shù)×1.052×(血壓-5)×13.6÷103⑹每分鐘每100g心肌血流量＝冠脈血流量(ml/min)÷1/3心臟重量×100⑺冠脈阻力＝血壓(mmHg)÷每分鐘每100g心肌血流量⑻總外周阻力＝血壓(mmHg)×79.92÷心輸出量(L/min)⑼心肌耗氧量＝(動(dòng)脈血氧量-冠狀竇靜脈血氧量)×冠脈血流量(ml/min)×10-2⑽心肌氧利用率＝(動(dòng)脈血氧量-冠狀竇靜脈血氧量)÷動(dòng)脈血氧量×100⑾心肌耗氧指數(shù)＝心率(beat/min)×血壓(mmHg)×10-2⑿血流量＝流速(cm/sec)×3.14×半徑(cm)2×60(sec)(3)試驗(yàn)結(jié)果：牡荊素、甘露醇混合組合物對氣管夾閉小鼠心電持續(xù)時(shí)間的影響結(jié)果如表1所示，氣管夾閉后，NS對照組小鼠在9.26±1.14min時(shí)相繼死亡，而牡荊素、甘露醇混合組合物12，6，3mgkg-13個(gè)劑量組小鼠心電消失的時(shí)間均顯著長于NS對照組，最多可延長約32.94％，差異具有高顯著性(P<0.01)，效果優(yōu)于陽性藥。提示牡荊素、甘露醇混合組合物可顯著提高小鼠心臟耐缺氧的能力。表1牡荊素、甘露醇混合組合物對氣管夾閉小鼠心電持續(xù)時(shí)間的影響(n＝10)與NS對照組比較，*P<0.05，**P<0.01牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎大鼠心肌缺血損傷的影響對心肌梗死范圍的影響用NBT染色法顯示心肌梗死范圍的大小，結(jié)果如表2所示，模型組大鼠冠脈結(jié)扎30min，其心肌梗死范圍可達(dá)54.02％±14.32％，而牡荊素、甘露醇混合組合物3個(gè)劑量組均可不同程度減小心肌的梗死范圍，其中6mg·kg-1組大鼠心肌梗死范圍僅為33.47％±6.30％，較模型組降低了38.04％，差異具有高顯著性。療效優(yōu)于陽性藥。提示，牡荊素、甘露醇混合組合物具有減小急性心肌缺血大鼠心肌梗死范圍的作用。表2牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎大鼠梗死心肌重量的影響(n＝10)與Sham組比較，△△P<0.001；與模型組比較，**P<0.01對血漿中LDH及CK活力的影響結(jié)果如表3所示，與Sham組比較，模型組大鼠血漿中LDH及CK的活力均顯著升高，表明冠脈結(jié)扎損傷了大鼠的心肌細(xì)胞膜，LDH及CK從細(xì)胞中外漏，使其在細(xì)胞中活性降低，而在血漿中活性明顯升高。牡荊素、甘露醇混合組合物6，3mgkg-1劑量組可抑制大鼠血漿中LDH活力的異常增高，同時(shí)，牡荊素6mg·kg-1劑量組對CK活力的異常升高也有顯著抑制作用。表3牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎大鼠血漿中LDH及CK活力的影響(n＝10)與Sham組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01牡荊素、甘露醇混合組合物對Iso誘發(fā)心肌缺血大鼠心肌缺血損傷的影響對缺血時(shí)異常ECG(ST段)的影響結(jié)果如下表所示，模型組大鼠ECGST段在scIso后2min即開始明顯抬高，5min時(shí)抬高更為顯著，并一直持續(xù)至20min。牡荊素、甘露醇混合組合物6，3，1.5mgkg-13個(gè)劑量組均可明顯延長ST段異常抬高開始出現(xiàn)的時(shí)間，且與模型組比較，可顯著降低ST段異常抬高的嚴(yán)重程度。提示，牡荊素、甘露醇混合組合物可明顯改善scIso所致的異常ECG變化。表4牡荊素、甘露醇混合組合物對Iso誘發(fā)大鼠急性心肌缺血異常ECG(ST段)的影響(n＝10)與用藥前比較，#P<0.05,##P<0.01，與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01對心肌含水量的影響從表5中可以看出，牡荊素、甘露醇混合組合物6mgkg-1劑量組可顯著降低心肌含水量，抑制心肌水腫。表5牡荊素、甘露醇混合組合物對Iso誘發(fā)心肌缺血大鼠心肌含水量的影響n＝10)與模型組組比較，*P<0.05，**P<0.01牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎犬急性心肌缺血損傷的影響對心肌缺血及梗死嚴(yán)重程度的影響結(jié)果如表6－8所示，用NBT染色法顯示心肌梗死范圍的大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組犬冠脈結(jié)扎120min后，其心肌缺血范圍可達(dá)56.50％±4.70％，梗死范圍達(dá)20.18％±12.17％。而牡荊素、甘露醇混合組合物4，2，1mgkg-13個(gè)劑量組可不同程度地減小心肌的缺血范圍和梗死范圍，其中牡荊素、甘露醇混合組合物大劑量組心肌缺血范圍為41.29％±6.44％，抑制率達(dá)26.92％；心肌梗死范圍為7.17％±3.51％，抑制率達(dá)64.47％；與模型組比較，差異均具有顯著性(**P<0.01，*P<0.05)。同時(shí)，牡荊素4，2，1mgkg-13個(gè)劑量組還不同程度地降低了心梗指數(shù)，最大降低百分率達(dá)74.53％。提示，牡荊素、甘露醇混合組合物可明顯減輕冠脈結(jié)扎致犬急性心肌缺血時(shí)的缺血嚴(yán)重程度。表6牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎犬心肌缺血范圍的影響(n＝6)與Sham組比較，△△P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01表7牡荊素對冠脈結(jié)扎犬心肌梗死范圍的影響(n＝6)與Sham組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05表8牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎犬心梗指數(shù)的影響(n＝6)與Sham組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01對心肌缺血程度(Σ-ST)和心肌缺血范圍(N-ST)的影響結(jié)果如表9，10所示，采用心外膜電極在梗死區(qū)、缺血區(qū)及正常區(qū)放置30個(gè)電極，測得模型組犬冠脈結(jié)扎即刻直至120min，其心肌缺血程度嚴(yán)重，Σ-ST值均顯著高于Sham組(p<0.01)；心肌缺血范圍N-ST也較Sham組顯著增大(p<0.01)，表明冠脈結(jié)扎使犬出現(xiàn)了嚴(yán)重心肌缺血情況。而牡荊素、甘露醇混合組合物4，2mgkg-1劑量組可明顯減小心肌缺血范圍，并可降低冠脈結(jié)扎后45min及60min時(shí)的心肌缺血程度，差異具有顯著性，療效與葛根素相當(dāng)。在其他時(shí)間點(diǎn)，牡荊素、甘露醇混合組合物4，2mgkg-1劑量組與模型組相比，差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對心肌缺血程度也已表現(xiàn)出降低趨勢。提示，牡荊素、甘露醇混合組合物可明顯減輕急性心肌缺血時(shí)的心肌缺血程度和范圍。表9牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎犬心肌缺血程度(Σ-ST)的影響(n＝6)與Sham組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05表10牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎犬心肌缺血范圍(N-ST)的影響與Sham組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01對血漿中LDH及CK活力的影響結(jié)果如表11所示，模型組犬血漿中LDH及CK的活力均顯著升高，牡荊素、甘露醇混合組合物4，2，1mgkg-13個(gè)劑量組與之相比，可顯著抑制血漿中LDH活力的增高，同時(shí)，牡荊素、甘露醇混合組合物4，2mgkg-1劑量組還可降低血漿中CK的活力水平。表11牡荊素、甘露醇混合組合物對冠脈結(jié)扎犬血漿中LDH及CK活力的影響(n＝6)與Sham組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01牡荊素、甘露醇混合組合物對犬心臟血流動(dòng)力學(xué)及心肌耗氧量的影響對血壓、心率的影響與給藥前及NS對照組比較，牡荊素、甘露醇混合組合物各劑量組對麻醉犬血壓、心率無明顯影響(P>0.05)。對犬左室內(nèi)壓的影響與給藥前比較，牡荊素、甘露醇混合組合物4，2mgkg-1劑量組大鼠左室內(nèi)壓有下降趨勢，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而與NS對照組比較，牡荊素2mgkg-1劑量組在給藥后15～45min時(shí)段內(nèi)能明顯降低犬左室內(nèi)壓，且療效優(yōu)于陽性對照藥。對犬冠脈流量、心輸出量的影響牡荊素、甘露醇混合組合物4mg·kg-1劑量組犬冠脈流量與心輸出量較用藥前及NS對照組均明顯增加，牡荊素、甘露醇混合組合物2mg·kg-1劑量組冠脈流量在給藥后15min時(shí)較NS對照組明顯增加，并一直持續(xù)至45min，其心輸出量與用藥前比較明顯增加。提示，牡荊素、甘露醇混合組合物可增加犬冠脈流量及心輸出量。犬冠脈阻力、總外周阻力的影響牡荊素、甘露醇混合組合物4mgkg-1劑量組給藥后45min時(shí)即可明顯降低冠脈阻力，并一直持續(xù)至90min，總外周阻力在用藥后60min時(shí)亦出現(xiàn)明顯下降，并一直持續(xù)至120min；與NS對照組比較，牡荊素4，2，1mgkg-13個(gè)劑量組均可不同程度地降低冠脈阻力，牡荊素、甘露醇混合組合物4，2mgkg-1劑量組還可在用藥后120min時(shí)降低總外周阻力，差異均具有顯著性。對犬心搏出量、心搏指數(shù)的影響牡荊素、甘露醇混合組合物4mg·kg-1劑量組給藥后120min時(shí)可明顯增加犬心搏出量和心搏指數(shù)，與用藥前和NS對照組比較，均具有顯著差異；牡荊素、甘露醇混合組合物2mg·kg-1劑量組給藥后60min時(shí)心搏出量和心搏指數(shù)均較用藥前明顯增加，并一直持續(xù)至120min時(shí)。對犬心臟指數(shù)、左室作功的影響牡荊素、甘露醇混合組合物2mg·kg-1劑量組給藥后使心臟指數(shù)持續(xù)升高，且在45～60min時(shí)間段使左室作功有明顯增加，而牡荊素、甘露醇混合組合物4mg·kg-1劑量組心臟指數(shù)較用藥前及NS對照組比較均有升高，但對左室作功無明顯影響(P>0.05)。對犬每分鐘百克心肌血流量、心肌耗氧指數(shù)的影響與NS對照組比較，牡荊素、甘露醇混合組合物4，2，1mg·kg-13個(gè)劑量組給藥后均能不同程度地增加每100克心肌血流量，但對心肌耗氧指數(shù)無明顯影響(P>0.05)。對犬心肌耗氧量、心肌氧利用率的影響除牡荊素、甘露醇混合組合物1mgkg-1劑量組心肌氧利用率較NS對照組有所降低外，其余各劑量組對麻醉犬心肌耗氧量、心肌氧利用率均無明顯影響(P>0.05)。試驗(yàn)例2：動(dòng)物腦血管藥效研究(1)試驗(yàn)材料牡荊素、甘露醇混合組合物：由合肥七星醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：101109(凍干粉針，為淡黃色疏松塊狀物，規(guī)格：30mg/每瓶)，臨用前用生理鹽水(NS)溶解至所需濃度；昆明種小鼠和ICR種小鼠，分別由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔級(jí)，體重18～22g，動(dòng)物合格證號(hào)：scxk(皖)2005-001)和浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔級(jí)，體重18～22g，動(dòng)物合格證號(hào)：scxk(浙)2003-001)提供；SD大鼠和Wistar大鼠，分別由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔級(jí)，體重180～250g，動(dòng)物合格證號(hào)：scxk(浙)2003-001)和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔級(jí)，體重240～280g，動(dòng)物合格證號(hào)：scxk(軍)2002-001)提供。(2)試驗(yàn)方法小鼠斷頭致腦缺氧模型：昆明種小鼠，隨機(jī)分成NS對照組、受試藥牡荊素、甘露醇混合組合物3個(gè)劑量組及陽性對照藥尼莫地平(Nim)和銀杏葉提取物(EGB)各一組，每組小鼠♀♂各半。各組小鼠分別灌胃(ig)NS或相應(yīng)的受試藥(0.1ml/10g體重)，一天一次，連續(xù)給藥5天，末次給藥2h在小鼠二耳連線處快速斷頭，記錄各小鼠斷頭后張口喘氣動(dòng)作的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間(sec)。夾閉氣管致小鼠缺氧模型：ICR種小鼠，分組和給藥同上，末次給藥2h后，10％水合氯醛300mg.kg-1腹腔注射(ip)麻醉，正中切口，分離氣管，連接心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測心電圖(ECG)，然后夾閉氣管，立即記錄小鼠ECG持續(xù)時(shí)間，以ECG消失為心臟停搏指標(biāo)。大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型：采用線栓改良法制造大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)的局灶性腦缺血再灌模型。大鼠用10％水合氯醛(300mg/kg，ip)麻醉后，將一長5cm，直徑約250μm左右的尼龍線經(jīng)左側(cè)頸外動(dòng)脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20mm感到輕微阻力時(shí)，即可阻斷大腦中動(dòng)脈。阻斷2h后，拔出尼龍線，進(jìn)行缺血再灌注24h。手術(shù)操作及麻醉過程中，大鼠用白熾燈加熱維持體溫，肛溫維持在36.5～37.5℃。Sham組除不插線外，其余手術(shù)過程同模型組。Wistar大鼠，隨機(jī)分成假手術(shù)(Sham)組、模型(NS對照)組、受試藥牡荊素、甘露醇混合組合物3個(gè)劑量組及陽性對照藥Nim和EGB各一組，每組♀♂各半。各組大鼠分別igNS或相應(yīng)的藥物(1.0ml/100g體重)，一天一次，連續(xù)給藥5天，末次ig給藥2h行上述MCAO實(shí)驗(yàn)。MCAO再灌后22h給藥1次，2h后，進(jìn)行異常神經(jīng)癥狀的評(píng)分(0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，右前肢不能完全伸直；2分，向右旋轉(zhuǎn)；3分，向右側(cè)傾倒；4分，無自發(fā)活動(dòng)或昏迷)。然后斷頭取血，快速取腦，稱重后，冠狀切分腦組織成5片，放入2％TTC溶液中于37℃避光染色(正常組織染成紅色，沒有活性的梗死組織拒染呈白色)30min后，用數(shù)碼相機(jī)拍照腦片并輸入計(jì)算機(jī)中，用圖象分析軟件(ImageJ)分別測量計(jì)算各鼠5個(gè)腦片的數(shù)碼圖片截面上的白色梗死組織面積和完整腦片面積后，再乘以腦片厚度，計(jì)算腦梗死體積占整個(gè)腦組織體積的百分比。然后將各鼠的5片腦片在100℃烘箱烘至恒重(即干重)，計(jì)算其腦組織含水量。腦組織含水量＝(濕重－干重)/濕重×100％將所取的血液離心后，分別按試劑盒說明書方法在490nm處測定血清LDH活性，按硫代巴比妥酸法，以TMP為標(biāo)準(zhǔn)品在535nm處測定血清丙二醛(MDA)含量。大鼠全腦缺血再灌模型：采用改良的Pulsinell-Brierley四血管阻斷(4-VO)法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。SD大鼠用10％水合氯醛(300mg/kg，ip)麻醉，俯臥位固定，拉直頸椎，將頭頸處于水平位置，在枕骨下至第二頸椎處行正中切口，鈍性分離肌肉，暴露第一頸椎兩側(cè)的橫突孔，將直徑為0.5mm的電凝針分別插入兩側(cè)的翼孔中，燒灼兩側(cè)椎動(dòng)脈，使其永久性閉合，縫合切口。再經(jīng)頸前部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈分叉前l(fā)cm處的下方放置手術(shù)線，線端置于體外，縫合切口，待大鼠清醒后回籠飼養(yǎng)。24h后，大鼠再次麻醉，測定腦電圖后，拆除頸部的縫合線，提起預(yù)置的手術(shù)線，拉出兩側(cè)分離的頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾迅速夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以腦電波變平為模型成功標(biāo)志。阻斷頸總動(dòng)脈30min，然后同時(shí)松開雙側(cè)動(dòng)脈夾，抽掉手術(shù)線，進(jìn)行腦血管血流再灌120min。Sham組動(dòng)物的手術(shù)操作步驟與缺血組相同，但不電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其余處理同腦缺血組動(dòng)物。腦電圖(EEG)測定方法：大鼠兩側(cè)椎動(dòng)脈阻斷24h后，再次麻醉，于前囟后lmm，矢狀縫左側(cè)2mm處用顱骨鉆在顱骨上鉆一直徑約為2mm的小孔，將單個(gè)針形電極經(jīng)顱骨小孔置于硬膜外，參考電極置耳部皮下，電極引出的屏蔽導(dǎo)線與BELight腦電圖儀相連，記錄缺血前、缺血時(shí)、再灌5min、l5min、30min、60min及120min的EEG。按下列公式計(jì)算全腦缺血再灌大鼠EEG電位幅度的變化百分率。EEG電位幅度變化百分率＝再灌注后EEG幅度/缺血前EEG幅度×100％實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠斷頭取血后，快速取出全腦，一分為二，左半腦稱重后置電熱恒溫烘箱(100℃)烤干，直至恒重后計(jì)算腦含水量。右半腦置10％甲醛溶液中固定，HE染色后行病理組織學(xué)檢查并進(jìn)行評(píng)分(無、無～輕度、輕度、中度及重度病理形態(tài)學(xué)變化分別記0、0.5、1、2和3分)。將所取血液離心后，按照前述方法檢測血清LDH活性和MDA含量。大鼠分組和給藥同大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎實(shí)驗(yàn)。大鼠頸總動(dòng)脈-靜脈旁路血栓實(shí)驗(yàn)：SD大鼠，隨機(jī)分成NS對照組、受試藥牡荊素、甘露醇混合組合物3個(gè)劑量組及陽性對照藥Nim和EGB各一組，每組10只，♀♂各半。大鼠10％水合氯醛麻醉，頸部正中切口，分離左頸總動(dòng)脈和右頸外靜脈。在一長15cm、外徑為2mm的聚乙烯管中置入一根5cm長的絲線并充滿50U/ml肝素生理鹽水溶液，將該聚乙烯管一段插入右頸外靜脈中，結(jié)扎固定后，另一段插入左頸總動(dòng)脈中并扎緊，然后打開動(dòng)脈夾開通血流15min后，取出下聚乙烯管內(nèi)的血栓稱其濕重后放入85℃烤箱中6h再稱其干重，減去絲線重量分別得血栓濕重和干重。各組大鼠分別igNS或相應(yīng)的受試藥(1.0ml/100g體重)，一天一次，連續(xù)給藥5天，末次給藥2h后進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。大鼠血小板聚集實(shí)驗(yàn)：72只大鼠隨機(jī)分成NS對照組、受試藥牡荊素、甘露醇混合組合物3個(gè)劑量組及陽性對照藥Nim和EGB各一組，每組8只，♀♂各半。各組大鼠分別igNS或相應(yīng)的受試藥(1.0ml/100g體重)，一天一次，連續(xù)給藥5天，末次給藥2h后進(jìn)行下述血小板聚集實(shí)驗(yàn)。大鼠戊巴比妥鈉ip麻醉后，打開腹腔，分離腹主動(dòng)脈取血，用3.8％枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝處理，取血量與抗凝劑比例為9∶1，1000r/min離心5min，吸出上層富含血小板血漿(PRP)，余下的血液3000r/min離心15min，制備貧血小板血漿(PPP)。計(jì)數(shù)PRP中血小板，用PPP調(diào)其血小板數(shù)在2.5×108個(gè).ml-1。將PRP移入硅化比色杯中，37℃溫浴5min，測其在600nm處吸光度(A)，用PPP調(diào)PRP的A值在0.6～0.7之間，將調(diào)好的PRP移入另一硅化比色杯中，按Born法在600nm處測加入ADP前的A值，隨后加入100μlADP(終濃度4μmol/ml)，再分別測定加入ADP后30sec、1、2min和5min時(shí)的A值，計(jì)算血小板聚集率。血小板聚集率＝(加入ADP前A值-加入ADP后A值)/加入ADP前A值×100％。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)。(3)試驗(yàn)結(jié)果牡荊素、甘露醇混合組合物對缺血性腦損傷的影響對小鼠斷頭后張口喘氣的影響牡荊素、甘露醇混合組合物可明顯延長小鼠斷頭后張口喘氣時(shí)間。對氣管夾閉小鼠ECG時(shí)間的影響牡荊素、甘露醇混合組合物對夾閉氣管致小鼠ECG時(shí)間有明顯的延長作用；Nim和EGB一樣，有延長的趨勢，但無明顯差異。牡荊素、甘露醇混合組合物對大鼠局灶性腦缺血再灌損傷的影響對異常神經(jīng)癥狀的影響MCAO再灌大鼠出現(xiàn)了明顯的異常神經(jīng)癥狀，與EGB一樣，牡荊素、甘露醇混合組合物可顯著降低異常神經(jīng)癥狀的評(píng)分。對腦水腫和腦組織梗塞體積百分比的影響MCAO再灌大鼠發(fā)生明顯的腦水腫和腦梗塞，與EGB或Nim一樣，牡荊素、甘露醇混合組合物可顯著減輕腦水腫和降低腦組織梗塞體積的百分比，并呈一定的量效關(guān)系。對MCAO再灌大鼠血清LDH活性和MDA含量的影響大鼠MCAO再灌可使血清中LDH活性和MDA含量明顯升高。與EGB及Nim一樣，牡荊素、甘露醇混合組合物可明顯抑制MCAO再灌大鼠血清中LDH活性和MDA含量的升高；牡荊素、甘露醇混合組合物對大鼠全腦缺血再灌損傷的影響對EEG的影響四血管結(jié)扎所致的全腦缺血可使大鼠EEG壓低變平，再灌注可使大鼠EEG有所恢復(fù)，但與Sham比較，再灌120min時(shí)仍沒有完全恢復(fù)。與EGB和Nim一樣，牡荊素、甘露醇混合組合物對全腦缺血再灌大鼠EEG恢復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。對腦含水量的影響全腦缺血再灌大鼠發(fā)生了明顯的腦水腫，與EGB和Nim一樣，牡荊素、甘露醇混合組合物可明顯降低全腦缺血再灌大鼠的腦含水量。對血清LDH和MDA的影響與Sham比較，NS對照組大鼠血清LDH活性及MDA含量有明顯的升高，與EGB和Nim一樣，牡荊素、甘露醇混合組合物可顯著抑制血清LDH活性和MDA含量的升高。病理組織學(xué)檢查結(jié)果Sham組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞正常，核膜清楚，核仁明顯；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，胞漿淡染，細(xì)胞膜及核膜清楚。毛細(xì)血管和小血管管腔較窄或呈一實(shí)性條索。NS模型組大鼠腦組織發(fā)生明顯的病理性改變，神經(jīng)細(xì)胞胞漿和胞核濃縮，染色加深，細(xì)胞體積縮小，軸突和樹突形狀不規(guī)則，神經(jīng)細(xì)胞及毛細(xì)血管、小血管周圍的間隙增寬，間質(zhì)疏松水腫，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹。牡荊素、甘露醇混合組合物各劑量組的腦組織神經(jīng)細(xì)胞濃縮及深染較NS模型組均有不同程度減輕，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹及間質(zhì)疏松程度均也輕于NS模型組。牡荊素、甘露醇混合組合物對大鼠血栓形成的影響：大鼠頸總動(dòng)脈-靜脈環(huán)路可致血栓的形成，與EGB一樣，牡荊素、甘露醇混合組合物可明顯降低血栓的濕重。牡荊素、甘露醇混合組合物對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響與正常對照組比較，100mg.kg-1EGB可顯著地抑制加入ADP后2min和5min時(shí)血小板聚集，5mg.kg-1Nim對加入ADP后5min時(shí)血小板聚集也有顯著的抑制。牡荊素、甘露醇混合組合物對2min和5min時(shí)血小板聚集有明顯的抑制作用。試驗(yàn)例3：動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)研究(1)試驗(yàn)材料牡荊素、甘露醇混合組合物：由合肥七星醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：101109(凍干粉針，為淡黃色疏松塊狀物，規(guī)格：30mg/每瓶)，臨用前用生理鹽水(NS)溶解至所需濃度；Beagle犬，普通級(jí)，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供。許可證號(hào)：SCXK(川)2006-24，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)簽發(fā)，(2)試驗(yàn)方法將供試品配成30mg/ml的溶液給藥，按照50％遞增法給藥體積依次設(shè)計(jì)為2.0、3.0、4.5、6.8、10.1、15.2ml/kg一系列劑量組，給藥時(shí)1號(hào)犬給予4.5ml/kg劑量，按照動(dòng)物的反應(yīng)確定2號(hào)犬的給藥劑量，然后按照2號(hào)犬的反應(yīng)確定三號(hào)犬的給藥劑量，依次類推，每間隔一個(gè)劑量給一只動(dòng)物，測出最低致死劑量和最高致死劑量，然后用兩者之間的劑量再給一只動(dòng)物，此劑量即為近似致死量，未發(fā)現(xiàn)中毒癥狀的劑量為最大耐受量。最大可給予20ml/kg，如仍未死亡，則20ml/kg為最大給藥量。(3)試驗(yàn)結(jié)果1號(hào)動(dòng)物(7.6kg)：給予牡荊素溶液4.5ml(135mg)/kg，給藥過程及給藥結(jié)束后動(dòng)物未見任何異常反應(yīng)。2號(hào)動(dòng)物(7.5kg)：給予牡荊素溶液10.1ml(303mg)/kg，給藥結(jié)束后3min動(dòng)物嘔吐一次，未見其它異常反應(yīng)。3號(hào)動(dòng)物(6.7kg)：給予牡荊素溶液6.8ml(204mg)/kg，給藥過程及給藥結(jié)束后未出現(xiàn)任何的異常反應(yīng)；4號(hào)動(dòng)物(6.6kg)：給予牡荊素溶液20ml(600mg)/kg，給藥結(jié)束后動(dòng)物立即出現(xiàn)嘔吐反應(yīng)，隨后間歇性嘔吐，24h后恢復(fù)正常。所有動(dòng)物14天觀察期內(nèi)未出現(xiàn)任何的異常反應(yīng)，觀察結(jié)束后剖檢，心、肝、脾、肺、腎等主要臟器未見肉眼可見異常。試驗(yàn)例4：動(dòng)物長期毒性試驗(yàn)研究本研究通過連續(xù)6個(gè)月靜脈給藥及停藥恢復(fù)觀察15天，就牡荊素、甘露醇混合組合物對比格犬長期毒性作用進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明在給藥6個(gè)月過程中無動(dòng)物死亡，給藥組在給藥后5～30分鐘動(dòng)物活動(dòng)量減少，部分靜臥，以大劑量組動(dòng)物為甚。空白對照組動(dòng)物各給予生理鹽水后活動(dòng)自如。各給藥組和對照組比格犬除上述癥狀外，在體征外觀、行為活動(dòng)及飲食等方面無明顯異常，大小便正常，毛發(fā)有光澤，一般情況良好，體重自然增加。各組動(dòng)物均未見眼、耳及口腔等處有異常分泌物。血液學(xué)檢查結(jié)果表明：給藥前、給藥2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月及停藥恢復(fù)期時(shí)各劑量組的血液學(xué)指標(biāo)與NS對照組比較無顯著性差異。這提示用藥期間及停藥恢復(fù)期間牡荊素、甘露醇混合組合物對血液學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)無明顯不利的影響發(fā)生。血液生化學(xué)檢查結(jié)果表明：用藥2個(gè)月時(shí)牡荊素、甘露醇混合組合物大劑量組的總蛋白值及6個(gè)月時(shí)牡荊素、甘露醇混合組合物大、中劑量組的總蛋白值較對照組顯著降低，但同期的肝功能其它指標(biāo)與對照組比較無顯著性差異，這提示牡荊素、甘露醇混合組合物長期給藥對比格犬的肝功能各參數(shù)基本無明顯的影響。用藥2個(gè)月時(shí)，小劑量組尿素氮值較NS對照組明顯升高，但用藥4個(gè)月及6個(gè)月時(shí)用藥各劑量組尿素氮值與對照組無差異，這提示2個(gè)月時(shí)小劑量組尿素氮值的變化與藥物無關(guān)，屬一過性的變化。用藥4個(gè)月、6個(gè)月時(shí)牡荊素、甘露醇混合組合物大劑量組比格犬肌酐(CREA)值較對照組明顯升高，而肌酐(CREA)是反映腎功能的一個(gè)主要參考指標(biāo)指標(biāo)之一，因此提示牡荊素、甘露醇混合組合物大劑量對比格犬腎功能有一定的影響。其余各給藥組犬的血液生化學(xué)指標(biāo)與NS對照組比較均無顯著性差異。綜合所有血液生化學(xué)指標(biāo)可看出，各劑量組的牡荊素、甘露醇混合組合物長期給藥對比格犬的肝功能無明顯的影響，但長期給藥可能對腎功能有一定的影響，建議臨床試驗(yàn)時(shí)注意觀察腎功能的變化。尿常規(guī)檢查表明：給藥4個(gè)月、6個(gè)月及恢復(fù)期時(shí)各給藥組尿常規(guī)與NS對照組相比組間無顯著性差異，這提示牡荊素、甘露醇混合組合物給予比格犬6個(gè)月后對動(dòng)物的尿常規(guī)無明顯影響。ECG檢查表明：給藥前、給藥2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月及恢復(fù)期時(shí)各給藥組的ECG各項(xiàng)指標(biāo)與NS對照組比較均無顯著性差異。這提示ECG檢查結(jié)果表明大、中、小劑量的牡荊素、甘露醇混合組合物長期用藥對比格犬的ECG未產(chǎn)生明顯的不利影響。動(dòng)物尸解未見明顯異常；臟器系數(shù)檢查結(jié)果表明用藥4個(gè)月、6個(gè)月及恢復(fù)期時(shí)各劑量組比格犬臟器系數(shù)與NS對照組比較無顯著性差異。病理組織學(xué)檢查主要從臟器的實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性、細(xì)胞壞死、炎癥、出血及血管充血擴(kuò)張、水腫等組織病理學(xué)指標(biāo)方面進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示：給藥4、6個(gè)月及停藥恢復(fù)期15天時(shí)，牡荊素、甘露醇混合組合物大、中、小各劑量組的比格犬心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、甲狀腺、腦(大腦、小腦、腦干)脊髓、食管、胃、十二指腸、膽囊、唾液腺、胰腺、甲狀旁腺、乳腺、胸骨骨髓、睪丸(和附睪)、前列腺、子宮、卵巢、腦、垂體、視神經(jīng)、坐骨淋巴結(jié)、給藥局部等均未見明顯的病變。用藥各組與NS對照組之間均無顯著差異(P＞0.05)。綜上所述，牡荊素、甘露醇混合組合物大、中、小劑量靜脈給藥6個(gè)月對比格狗一般行為學(xué)、體重、攝食量等無明顯影響，牡荊素、甘露醇混合組合物大、中、小劑量組血液學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)無明顯異常變化，血液生化學(xué)檢查提示牡荊素、甘露醇混合組合物大劑量可能對比格犬的腎功能有一定的影響，尿常規(guī)檢查無異常發(fā)現(xiàn)，臟器系數(shù)檢查均未見明顯的影響，病理組織學(xué)檢查未見有明顯的病理學(xué)損害改變，ECG檢查未產(chǎn)生明顯的不利影響；牡荊素、甘露醇混合組合物各劑量組在停藥恢復(fù)期觀察時(shí)未見明顯毒性作用的發(fā)生，也未見新的毒性反應(yīng)的產(chǎn)生。這提示牡荊素、甘露醇混合組合物臨床長期用藥是比較安全的。試驗(yàn)例5：動(dòng)物過敏性、刺激性、溶血性試驗(yàn)研究動(dòng)物過敏性試驗(yàn)結(jié)果(1)樣品及來源牡荊素、甘露醇混合組合物：由合肥七星醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)：101109(凍干粉針，為淡黃色疏松塊狀物，規(guī)格：30mg/每瓶)，臨用前用生理鹽水(NS)溶解至所需濃度；0.9％生理鹽水(NS)：由上海華源制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：100705076；5％新鮮蛋清：用新鮮的雞蛋制備。(2)動(dòng)物豚鼠，32只，體重300-350g，♂性，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度：23±3℃,空調(diào)控制，相對濕度：50～70％。(3)方法豚鼠32只，體重300-350g，♂性，隨機(jī)分成四組，NS對照組、陽性對照組(蛋清)和牡荊素、甘露醇混合組合物高、低劑量組(低劑量為臨床人擬用劑量0.5mg/kg：致敏0.5mg/kg,攻擊1.0mg/kg；高劑量為低劑量的5倍：致敏2.5mg/kg,攻擊5.0mg/kg)，每組8只豚鼠，各組按無菌操作，分別隔日腹腔注射滅菌注射用生理鹽水、牡荊素、甘露醇混合組合物高、低劑量和5％新鮮蛋清0.5ml/只，共5次。于末次致敏注射后的第14天，由前肢外側(cè)靜脈皮膚切開，注射生理鹽水注射液、牡荊素、甘露醇混合組合物高、低劑量和5％新鮮蛋清溶液1.0ml/只，注射時(shí)間為1min，進(jìn)行攻擊，根據(jù)表12觀察過敏反應(yīng)癥狀，仔細(xì)觀察30分鐘，然后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察3小時(shí)。表12過敏反應(yīng)癥狀0：正常7：呼吸急促14：步態(tài)不穩(wěn)1：不安寧8：排尿15：跳躍2：立毛9：排糞16：喘息3：發(fā)抖10：流淚17：痙攣4：搔鼻11：呼吸困難18：橫轉(zhuǎn)5：噴嚏12：羅音19：潮式呼吸6：咳嗽13：紫癜20：死亡結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)表13評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷過敏反應(yīng)強(qiáng)弱。“—”為無癥狀；“+”為不安、哆嗦、搔鼻、排尿、呼吸急促等；“++”為除上述癥狀外，呼吸困難和運(yùn)動(dòng)障礙；“+++”除上述癥狀外，呼吸衰竭直至痙攣，但可恢復(fù)；“++++”為死亡。表13豚鼠過敏反應(yīng)級(jí)數(shù)(4)試驗(yàn)結(jié)果從表14試驗(yàn)結(jié)果可以看出，牡荊素、甘露醇混合組合物給豚鼠腹腔注射致敏，靜脈注射攻擊，對豚鼠無過敏反應(yīng)。牡荊素、甘露醇混合組合物全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)合格。表14第14天豚鼠激發(fā)后產(chǎn)生的癥狀(5)結(jié)論豚鼠在第14天激發(fā)iv牡荊素、甘露醇混合組合物時(shí)均無過敏癥狀，試驗(yàn)結(jié)果表明牡荊素、甘露醇混合組合物靜脈給藥未見明顯的致敏作用。動(dòng)物刺激性試驗(yàn)結(jié)果(1)試驗(yàn)動(dòng)物健康家兔2.2～2.5kg，♀♂各半，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度：23±3℃,空調(diào)控制，相對濕度：50％～70％。(2)試驗(yàn)方法取健康家兔8只，♀♂各半，稱重后，隨機(jī)分成二組，每組4只，分別在固定的耳緣靜脈滴注牡荊素、甘露醇混合組合物(濃度為30mg·100ml-1；5ml.kg-1)和等量NS(5.0ml·kg-1)靜脈滴注速度為1ml.min-1,每日同部位靜脈注射1次，劑量相同(注射時(shí)均要局部去毛和消毒)，連續(xù)4天，停藥第2天，處死動(dòng)物，立即取兔耳標(biāo)本置10％甲醛溶液中固定后行組織病理組織學(xué)檢查，記錄耳緣靜脈進(jìn)針點(diǎn)處向近心端間隔1.0、2.0、3.0和4.0cm處組織損害情況(先肉眼觀察有無充血、水腫和壞死，再進(jìn)行病理學(xué)檢查)。(3)試驗(yàn)結(jié)果靜脈滴注牡荊素、甘露醇混合組合物和NS后，家兔活動(dòng)自如，進(jìn)食及大小便正常，毛發(fā)有光澤，未見明顯的異常反應(yīng)；注射部位皮膚見點(diǎn)狀結(jié)痂外，未見紅、腫、熱、痛及局部增厚、潰爛、結(jié)節(jié)等異常反應(yīng)。病理學(xué)結(jié)果如下表所示，牡荊素、甘露醇混合組合物用藥組及NS對照組家兔耳緣靜脈血管管壁完整，管腔內(nèi)無血栓形成，血管周圍間質(zhì)未見出血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(見表15)。表15牡荊素、甘露醇混合組合物(30mg·100ml-1)靜脈滴注對家兔靜脈的刺激作用注：–：正常。(4)結(jié)論家兔靜脈滴注牡荊素、甘露醇混合組合物未見明顯的靜脈刺激性反應(yīng)。動(dòng)物過敏性試驗(yàn)結(jié)果(1)試驗(yàn)動(dòng)物健康家兔2.3kg，♂，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度：23±3℃，空調(diào)控制；相對濕度：50％～70％。(2)試驗(yàn)方法2％家兔紅細(xì)胞懸液制備：取健康雄性家兔一只，心臟取血10ml，置于燒杯內(nèi)，放入玻璃珠輕輕搖動(dòng)，數(shù)分鐘后除出纖維蛋白，取出已去纖維蛋白血液，加等量生理鹽水(2000rpm,5min)離心，除去上清夜，沉淀的血球再加生理鹽水，清洗，再離心，如此反復(fù)三次，按血球的容量，用生理鹽水配成2％的混懸液。取干凈試管7只編號(hào)后，分別加入2.5ml2％兔紅細(xì)胞懸液，按下表所示分別加入相應(yīng)體積的牡荊素、甘露醇混合組合物(30mg.100ml-1)和NS或雙餾水，置37℃培養(yǎng)箱中，分別觀察0.5、1、2、3h溶血反應(yīng)情況。(3)試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如下表16所示，在2％兔紅細(xì)胞懸液中加入不同體積的牡荊素、甘露醇混合組合物后0.5、1、2、3h均無溶血反應(yīng)的發(fā)生。表16牡荊素、甘露醇混合組合物(30mg.100ml-1)生理鹽水溶液溶血試驗(yàn)注：+：溶血和/或凝集反應(yīng)，-：不溶血也不凝集(4)結(jié)論牡荊素、甘露醇混合組合物未見明顯溶血反應(yīng)。當(dāng)前第1頁1 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